張亞平，單魯豫，穆琦瑄，李文慧，王丹妮，王躍飛，于卉娟

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，省部共建組分中藥國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市中藥化學(xué)與分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617）

中醫(yī)藥是中華民族的瑰寶，為中華民族繁衍生息作出了巨大貢獻(xiàn)。國家藥品監(jiān)管部門、產(chǎn)業(yè)界、科研界高度重視中藥中有害物質(zhì)的防控及檢測，如黃曲霉毒素、硫磺、重金屬等。2021年6月，國家中藥材標(biāo)準(zhǔn)化與質(zhì)量評估創(chuàng)新聯(lián)盟成立，聚焦高質(zhì)量中藥材的加工、生產(chǎn)、流通環(huán)節(jié)，提出“三無一全”（無硫磺加工、無黃曲霉毒素超標(biāo)、無公害、全過程可追溯）優(yōu)質(zhì)藥材品牌理念，進(jìn)一步促進(jìn)高質(zhì)量中藥材市場供給。中藥材有害菌污染是影響中藥材質(zhì)量的重要方面，其中黃曲霉菌極易侵染中藥材，其代謝產(chǎn)物黃曲霉毒素具有劇毒性和致癌性，嚴(yán)重影響臨床用藥安全[1-2]。此外，黃曲霉毒素也存在于發(fā)霉的糧食、豆類、堅果及其相關(guān)食品中。

黃曲霉毒素主要是由黃曲霉菌（Aspergillusflavus）和寄生曲霉菌（Aspergillus parasiticus）在潮濕溫?zé)岘h(huán)境下產(chǎn)生的毒性次級代謝產(chǎn)物，是二氫呋喃香豆素化合物及其衍生物[3]。目前已發(fā)現(xiàn)20 多種黃曲霉毒素，其中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1等毒素已被分離鑒定，根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)主要劃分為環(huán)戊烯酮型和內(nèi)酯型[4]（表1）。AFB1是已知黃曲霉毒素中毒性最強(qiáng)的化合物，其毒性約是氰化鉀的10 倍、砒霜的68 倍[5]，被世界衛(wèi)生組織列為Ⅰ類致癌物[6]。AFB1結(jié)構(gòu)中存在3 個毒性位點(diǎn)[7]：1）呋喃環(huán)上的雙鍵（C8-C9）是黃曲霉毒素與蛋白質(zhì)或核酸形成復(fù)合物的作用位點(diǎn)，是導(dǎo)致基因突變、致癌致畸的主要基團(tuán)。2）香豆素內(nèi)酯環(huán)上的10、11、15 號位點(diǎn)。3）環(huán)戊烯酮環(huán)上的1、2、3、14 號位點(diǎn)，這部分位點(diǎn)易被取代基團(tuán)取代。長期暴露于黃曲霉毒素下會導(dǎo)致機(jī)體免疫抑制、先天畸形、不孕不育、內(nèi)分泌紊亂、肝細(xì)胞癌變等[8]。

表1 黃曲霉毒素的分類及化學(xué)結(jié)構(gòu)

黃曲霉毒素嚴(yán)重危害人類健康，國家藥典委員會強(qiáng)調(diào)，藥品微生物檢查是藥品安全性控制的重要研究內(nèi)容?！吨腥A人民共和國藥典》對中藥檢測黃曲霉毒素的要求日趨嚴(yán)格，從2010年版的5 種藥材增加到2020年版的24 種，涵蓋根莖類、果實(shí)種子類和動物類藥材，檢測限度為AFB1不得超過5 μg/kg，AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的總量不得超過10 μg/kg[9-11]?？茖W(xué)有效地防控黃曲霉毒素侵染中藥對提升中藥臨床用藥安全具有重要意義。目前，中藥中黃曲霉毒素的富集、檢測及降解解毒方法研究較多，為了更好地為中藥中黃曲霉毒素的研究提供參考，本文綜述了近年來黃曲霉毒素的富集方法、檢測分析技術(shù)、降解解毒方法的研究進(jìn)展（圖1）。

圖1 黃曲霉毒素富集-檢測-降解解毒方法

1 黃曲霉毒素的富集方法

由于中藥樣品基質(zhì)復(fù)雜且黃曲霉毒素含量較低，因此，在進(jìn)行分析檢測前需采取適當(dāng)?shù)臉悠非疤幚矸椒ㄟM(jìn)行提取、富集[12]。關(guān)于黃曲霉毒素的提取方法主要有振搖提取法、超聲提取法、高速均質(zhì)提取法、加速溶劑萃取法等。常用的黃曲霉毒素純化方法主要有萃取法、柱凈化法、免疫親和層析法、基質(zhì)固相分散法、分子印跡固相萃取法等，新技術(shù)與新方法的應(yīng)用能夠特異性富集目標(biāo)化合物[13]。表2總結(jié)了黃曲霉毒素的富集方法及其基本原理、優(yōu)勢、應(yīng)用實(shí)例[14-26]。

表2 黃曲霉毒素的富集方法及其基本原理、優(yōu)勢、應(yīng)用實(shí)例

2 黃曲霉毒素的檢測方法

黃曲霉毒素在人體或動物體內(nèi)長期蓄積會導(dǎo)致肝毒性、致畸、致癌[27-28]。因此，建立高效、靈敏的黃曲霉毒素檢測方法對保障藥品和食品安全至關(guān)重要。黃曲霉毒素的傳統(tǒng)檢測方法有薄層色譜法、高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等。色譜法具有檢測結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，同時也存在樣品前期處理復(fù)雜、需要專業(yè)的檢測人員等局限性[13]。免疫分析法是用于快速檢驗(yàn)的新技術(shù)，其原理是抗原-抗體特異性識別目標(biāo)分析物，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、高通量等優(yōu)點(diǎn)[29]。酶聯(lián)免疫吸附法廣泛應(yīng)用于中藥中黃曲霉毒素的檢測，被收載為《中華人民共和國藥典》2020年版中黃曲霉毒素測定的方法之一[11]。側(cè)流免疫層析法、膠體金免疫層析法、化學(xué)發(fā)光免疫法、熒光免疫吸附法等可實(shí)現(xiàn)樣品中黃曲霉毒素的現(xiàn)場快速檢測[30-31]。近年來，基于適配體和新型納米材料的生物傳感器因具有靈敏度高、檢出限低、操作簡便等優(yōu)勢，在黃曲霉毒素檢測中得到了廣泛應(yīng)用[32]。此外，通過引入基于適配體的不同技術(shù)實(shí)現(xiàn)AFB1的檢測，例如電化學(xué)、表面等離子體共振、比色法等[33]。表3 對黃曲霉毒素檢測方法進(jìn)行了分析[34-42]。

表3 黃曲霉毒素檢測方法的比較分析

3 黃曲霉毒素的降解方法

黃曲霉毒素對光和熱穩(wěn)定，不溶于水。中藥被其侵染后脫除困難，建立有效脫除黃曲霉毒素的方法對保障中藥、食品安全意義重大。常用的黃曲霉毒素降解方法有物理法、化學(xué)法、生物法（圖2）[43]。表4 對黃曲霉毒素的降解方法進(jìn)行了分析。

圖2 黃曲霉毒素不同降解方法的優(yōu)勢和局限性

表4 黃曲霉毒素降解方法的比較分析

物理方法主要采用加熱、輻照、吸附劑吸附、超聲等方式降低黃曲霉毒素的濃度。高溫破壞毒素位點(diǎn)達(dá)到脫毒目的，但同時會影響中藥品質(zhì)，容易造成成分降解等[43-44]。吸附劑與黃曲霉毒素結(jié)合可以有效脫除黃曲霉毒素，常用的吸附劑有葉綠素、氧化磁性石墨烯和磁性石墨烯的納米材料、黏土等[45-46]。超聲降解是一種安全綠色的黃曲霉毒素脫毒方法，一般作為輔助手段與其他方法協(xié)同使用[47]。

化學(xué)方法是指采用化學(xué)試劑降解黃曲霉毒素或抑制霉菌滋生[48]，主要包括有機(jī)酸法、臭氧降解法、氨化脫毒法[49]。有機(jī)酸對AFB1具有明顯的降解作用[50]，如檸檬酸、丙酸、苯甲酸、酒石酸等。臭氧可降解真菌毒素并抑制微生物增殖，對環(huán)境危害較小，被譽(yù)為“綠色因子”，但其本身作為強(qiáng)氧化劑會破壞基質(zhì)中的營養(yǎng)物質(zhì)[51]。氨化脫毒是指利用氨水處理或氨氣熏蒸等方式改變黃曲霉毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)，達(dá)到降低毒性的目的，但攝入過量的氨氣會造成機(jī)體損傷[52]。微生物降解霉菌毒素是近年來研究較為廣泛的一種脫毒方式，利用微生物自身的代謝體系改變黃曲霉毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)，使之轉(zhuǎn)化為其他化學(xué)衍生物，達(dá)到消除毒性或降低毒性的目的，是一種安全、高效、綠色的脫毒方式。熒光假單胞菌、鰻敗血假單胞菌、葡萄球菌等菌株可有效降解黃曲霉毒素。生物酶降解是微生物降解的有效補(bǔ)充，通過破壞黃曲霉毒素的毒性基團(tuán)降低其毒性，具有特異性強(qiáng)、高效性、反應(yīng)條件溫和等特點(diǎn)。紅球菌[53]、枯草芽孢桿菌[54]、黑曲霉[55]等多種真菌和細(xì)菌的代謝酶能有效降解黃曲霉毒素[56-57]。

目前，關(guān)于黃曲霉毒素降解方法的研究取得了較大進(jìn)展，每種降解方法都有其獨(dú)特的優(yōu)勢[58-66]，可以綜合利用多元協(xié)同技術(shù)達(dá)到除去黃曲霉毒素的效果，提高其在不同研究對象中的適用性。探索綠色、環(huán)保、安全的整合降解黃曲霉毒素技術(shù)將成為未來研究的主流和重點(diǎn)。

4 結(jié)語

黃曲霉毒素毒性極強(qiáng)，容易污染中藥及食品，對人類健康構(gòu)成嚴(yán)重危害。本文綜述了近年來黃曲霉毒素的富集方法、檢測技術(shù)及降解脫毒方法。由于黃曲霉毒素具有含量低、毒性大的特點(diǎn)，開發(fā)出更靈敏、更快速、更經(jīng)濟(jì)的檢測手段具有重大迫切需求。黃曲霉毒素的早檢測、早預(yù)防、早干預(yù)是有效解決黃曲霉毒素危害性的重要措施。