黃健瑩 歐陽欽 吳春明 劉三海 王麗佳 趙安靜 謝遠(yuǎn)太

浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬溫州市中醫(yī)院 浙江 溫州 325000

浙南名老中醫(yī)任俠民先生以溫州道地藥材雞骨草和垂盆草，創(chuàng)立二草清肝湯（EQD），臨床和基礎(chǔ)研究證實(shí)對急性肝衰竭（ALF）有一定的療效[1]。前期實(shí)驗(yàn)顯示二草清肝湯（EQD）對免疫性肝損害大鼠的肝細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用，其機(jī)制與肝細(xì)胞內(nèi)的PI3K/AKT/GSK3β 信號途徑的活化受抑制有關(guān)[2]；最新研究顯示ALF 小鼠肝組織Tott 樣受體4（TLR4）mRNA 表達(dá)明顯升高，EQD 能下調(diào)肝組織的TLR4 mRNA 表達(dá)[3]。據(jù)此，我們推測EQD 可能是通過肝細(xì)胞TLR4/PI3K/AKT/GSK3β 信號通路調(diào)控肝細(xì)胞凋亡。因此，本研究擬以脂多糖（LPS）構(gòu)建人源HL-7702 肝細(xì)胞凋亡模型，在分子和細(xì)胞水平檢測相關(guān)凋亡信號分子表達(dá)情況，為EQD 用于防治ALF 提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物和細(xì)胞：BALB/C，雄性，周齡6～8w，30只，許可證號：SCXK（湘）2019-0004，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司；飼養(yǎng)環(huán)境：溫度20～26℃，濕度40%～70%。人源HL-7702 肝細(xì)胞（貨號：CL-0190），購自普諾賽生物公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物：所用中藥材均購自溫州永安堂中藥飲片公司，按原方比例（雞骨草、垂盆草、茵陳各15g，制大黃3g，茯苓、澤瀉、蒼術(shù)各10g，陳皮、甘草各6g），水煎2次合并藥液，過濾濃縮至含生藥3.3g/mL，加入其兩倍的乙醇拌勻，沉淀后取得上清液；回收乙醇后濃縮得浸膏，加入糊精、蔗糖混勻，制粒即得。實(shí)驗(yàn)前取蒸餾水溶解，按1∶2∶3 比例分別制成二草清肝湯小劑量、中劑量和大劑量，以備實(shí)驗(yàn)時用。

1.3 試劑：Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit（批號：AP101-100-kit，MULTI SCIENCES 聯(lián)科生物）；GSK3β（批號：22104-1-AP，protein tech）；Cy3 Goat Anti-Rabbit IgG（批號：As007，ABclonal）；即用型DAPI 染液（批號：KGA215-50，凱基）；CCK-8 法細(xì)胞增殖檢測試劑盒（批號：KGA317，凱基生物）；Trizon Reagent（批號：CW0580S，CWBIO）；超純RNA 提取試劑盒（批號：CW0581M，CWBIO）；HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR （+gDNA wiper）（批號：R223-01，Vazyme）；ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（批號：Q711-02，Vazyme）；50×TAE 緩沖液（批號：T1060，Solarbio）；6×DNA Loading Buffer（批號：GH101-01，TRANS）；50bp DNA Ladder（批號：MD108，TIANGEN）；Gsafe Red plus 核酸染料（批號：GK20002，GLPBIO）；瓊脂糖粉（批號：75510-019，Invitrogen）；LPS（批號：L2880，Sigma）。

1.4 儀器：旋渦混合器（XH-C，常州越新儀器制造有限公司）；低溫高速離心機(jī)（TGL-16D，常州中捷實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司）；流式細(xì)胞儀[Novo Cyte 2060R，艾森生物（杭州）有限公司]；熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9054，山東博科生物）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（HGZF-101-1，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）；熒光顯微鏡（CKX53，OLYMPUS）；高壓鍋（YS20ED，蘇泊爾）；全自動樣品快速研磨儀（Tiss-12，上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）；高速臺式冷凍離心機(jī)（H1750R，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；微型離心機(jī)（D1008E，SCJLOGEX）；旋渦混合器（XH-C，常州越新儀器制造有限公司）；紫外分光光度儀（NP80，Nano Photometer）；電泳儀（DYY-8C，北京六一生物科技有限公司）；普通PCR 擴(kuò)增儀（TC-EA，杭州博日科技有限公司）；熒光PCR儀[CFX Connect實(shí)時，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司]；超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)儀[ChemiDocTM XRS+，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司]。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法：分述如下。

1.5.1 小鼠急性肝衰竭模型構(gòu)建和含藥血清的制備：分組：空白對照組（n=6）、LPS 組（n=6）、LPS+EQD 低劑量組（n=6）、LPS+EQD 中劑量組（n=6）、LPS+EQD 高劑量組（n=6）；灌胃：制取二草清肝湯EQD，LPS+EQD 低劑量組為0.2mL/d，LPS+EQD 中劑量組為0.3mL/d，LPS+EQD 高劑量組為0.4mL/d，灌胃，1 日1 次，共12 天；正常組和LPS 組同時予3mL/kg·d 的生理鹽水灌胃，1 日1 次，共12 天。末次給藥4h 后，除空白對照組外所有小鼠均腹腔注射D-Gal（800mg/kg）和LPS（7.5mg/kg），制備ALF 小鼠模型。末次注射LPS 24h后，處死各組小鼠。取各組肝組織和血清進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5.2 細(xì)胞處理：棄去細(xì)胞培養(yǎng)上清，用1×PBS 洗2遍，加入0.25%胰酶（含0.02% EDTA）消化，待細(xì)胞變圓加入培養(yǎng)基終止消化并收集細(xì)胞懸液至10mL 離心管中，1000rpm 離心3min，棄去上清液加入培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計數(shù)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要對細(xì)胞鋪6孔板和96孔板，將細(xì)胞根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行稀釋，96 孔板每孔3000 和5000 個細(xì)胞，均勻地鋪到細(xì)胞培養(yǎng)板中，做好標(biāo)記，放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞完全貼壁后，按照分組，加入不同劑量的含藥血清100μL 預(yù)處理2h，然后再加入10μg/mL 的10μL LPS處理24h，空白對照組加入100μL+10μL的生理鹽水。

1.5.3 流式檢測凋亡：收集1～3×106個細(xì)胞，加1mL PBS，1500rpm 離心3min，洗兩遍；用雙蒸水將5×Binding Buffer稀釋為1×Binding Buffer；取300μL預(yù)冷的1×Binding Buffer 重懸細(xì)胞；每管各加入5μL Annexin V-FITC 和10μL PI；輕微混勻后，室溫避光孵育10min；再向每管中加入200μL 預(yù)冷的1×Binding Buffer；混勻后上流式儀檢測。

1.5.4 免疫熒光：細(xì)胞的固定：棄上清后PBS浸洗3次，每次3min；用4%的多聚甲醛固定15min，PBS 浸洗培養(yǎng)皿3 次，每次3min。打孔：0.5%Triton X-100（PBS 配制）室溫通透20min。PBS 浸洗培養(yǎng)皿3 次，每次5min，移液槍吸干PBS，在培養(yǎng)皿上滴加5%BSA，37℃封閉30min。一抗：移液槍吸掉封閉液，不洗，每個培養(yǎng)皿滴加足夠量的稀釋好的一抗；GSK3 bate（1∶200）4℃孵育過夜；PBS 浸洗培養(yǎng)皿3 次，每次3min，移液槍吸干培養(yǎng)皿內(nèi)多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗Cy3（1∶200），37℃孵育30min，PBS 浸洗培養(yǎng)皿3 次，每次3min。注意：從加熒光二抗起，后面所有操作步驟都盡量在較暗處進(jìn)行。復(fù)染核：滴加DAPI 避光孵育5min，對標(biāo)本進(jìn)行染核，用PBS浸洗多余的DAPI；封片：用20%甘油封閉培養(yǎng)皿，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.5.5 實(shí)時熒光定量PCR（qPCR）：采用Trizon 試劑提取總RNA，用UV-Vis 分光光度計測定RNA 濃度和純度。然后，對提取的RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR 檢測。β-actin 作為內(nèi)參，bax、bcl-2 和active-caspase3 的相對表達(dá)量根據(jù)2-△△Ct法計算。序列見表1。

表1 PCR引物序列、產(chǎn)物長度及退火溫度

1.5.6 Western blot 檢測：棄掉培養(yǎng)皿中的細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入100μL 的細(xì)胞裂解液，置于冰上20 min。用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮至一側(cè)，移液槍吸入已做好標(biāo)記的EP管中。12000rpm離心10min，棄沉淀，取上清液移至新的EP 管（BCA 測定），總蛋白置于-20℃保存。根據(jù)BCA 試劑盒測定蛋白濃度，蛋白變性，上樣進(jìn)行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳（SDS-PAGE）1.5h，后用300mA 恒流轉(zhuǎn)膜1.5h。用PVDF膜孵育一抗，4℃過夜，次日PVDF膜室溫孵育二抗2h，洗膜，用發(fā)光液浸濕PVDF膜后放置于超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)樣品放置區(qū)運(yùn)行程序顯影成像。

1.6 統(tǒng)計方法：應(yīng)用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，定量結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。兩組之間定量數(shù)值比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組之間定量數(shù)值比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用S-N-K法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 EQD 對HL-7702 肝細(xì)胞凋亡影響：如圖1 所示，LPS、不同劑量EQD 分別處理人源HL-7702 肝細(xì)胞后，流式檢測各組細(xì)胞的凋亡情況，可以看出，與對照組相比，LPS 處理后，HL-7702 肝細(xì)胞凋亡率顯著上升（P＜0.05）。與LPS 組比較，加入低、中、高EQD 分別處理后，HL-7702 肝細(xì)胞凋亡率顯著下降（P＜0.05），且中、高劑量EQD 下降更顯著（P＜0.05）。說明EQD 可以顯著抑制LPS引起的HL-7702肝細(xì)胞凋亡。

圖1 流式檢測各組細(xì)胞凋亡率

2.2 EQD 對HL-7702 肝細(xì)胞中GSK3β 核易位的影響：如圖2所示，采用LPS及不同劑量EQD分別處理HL-7702肝細(xì)胞后，免疫熒光檢測各組細(xì)胞中GSK3β表達(dá)情況，可以看出，GSK3β 主要在HL-7702 的細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，細(xì)胞核有少量表達(dá)。且與對照組比較，LPS 處理后，HL-7702中GSK3β 表達(dá)顯著上升，且趨向于向細(xì)胞核中聚集（P＜0.05）。與LPS組相比，加入低、中、高EQD分別處理后，HL-7702 肝細(xì)胞中GSK3β 表達(dá)顯著下降，且中、高劑量下降更顯著，趨向于向細(xì)胞質(zhì)中聚集（P＜0.05）。說明EQD 可以顯著抑制HL-7702 肝細(xì)胞中LPS 誘導(dǎo)后的GSK3β表達(dá)。

圖2 免疫熒光檢測GSK3β核異位情況

2.3 EQD對HL-7702肝細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2和炎癥因子TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)水平的影響：如圖3所示，采用LPS 及不同劑量EQD 分別處理HL-7702 肝細(xì)胞后，qPCR 檢測各組細(xì)胞中Bax、Bcl-2 和TNF-α、IL-6 mRNA 表達(dá)水平情況，與對照組比較，LPS 處理后，HL-7702肝細(xì)胞中的Bax、TNF-α、IL-6顯著上升，Bcl-2 表達(dá)顯著下降（P＜0.05）。與LPS 組比較，加入低、中、高EQD分別處理后，HL-7702肝細(xì)胞中Bax、TNF-α、IL-6顯著下降，Bcl-2 表達(dá)顯著上升（P＜0.05）。說明EQD 可以抑制LPS引起的凋亡和炎癥反應(yīng)。

圖3 qPCR檢測各組小鼠肝組織中凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2 和炎癥因子TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)水平

2.4 EQD 對HL-7702 肝細(xì)胞中下游蛋白AKT、GSK3β 及其磷酸化表達(dá)水平的影響：如圖4 所示，LPS、不同劑量EQD 分別處理HL-7702 肝細(xì)胞后，Western-blot 檢測各組細(xì)胞的AKT、GSK3β及其磷酸化表達(dá)情況，可以看出，與對照組比較，LPS 處理后，AKT、GSK3β、p-AKT、p-GSK3β 表達(dá)顯著上升（P＜0.05）。與LPS 組比較，加入低、中、高EQD分別處理后，AKT、GSK3β表達(dá)顯著上升（P＜0.05），p-AKT、p-GSK3β 表達(dá)顯著下降（P＜0.05）。說明EQD可以顯著抑制HL-7702肝細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)后的p-AKT、p-GSK3β表達(dá)。

圖4 Western blot檢測各組細(xì)胞中GSK3β、p-GSK3β、AKT、p-AKT蛋白表達(dá)水平

3 討論

急性肝功能衰竭（ALF）的最主要病理形態(tài)學(xué)特征是肝細(xì)胞壞死，而肝細(xì)胞壞死的基礎(chǔ)是肝細(xì)胞凋亡，大量肝細(xì)胞凋亡導(dǎo)致ALF 的發(fā)生[4]。筆者經(jīng)前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，人源HL-7702 細(xì)胞內(nèi)有TLR4 介導(dǎo)PI3K/AKT/GSK3β 信號通路，并且TLR4 通過PI3K/AKT/GSK3β 通路介導(dǎo)了HL-7702 細(xì)胞凋亡的調(diào)控。目前尚未發(fā)現(xiàn)任何西藥可以有效地阻抑肝細(xì)胞凋亡的發(fā)生?；诟渭?xì)胞凋亡在ALF 中的作用，能否以TLR4 為靶點(diǎn)，通過其介導(dǎo)PI3K/AKT/GSK3β 信號通路來干預(yù)肝細(xì)胞凋亡的發(fā)生，從而為臨床治療ALF提供新的思路。臨床研究證實(shí)二草清肝湯EQD對治療ALF有較好療效。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，EQD能降低免疫性肝損害大鼠的血清TNF-α、IL-12 水平，抑制其肝細(xì)胞Bax的表達(dá)，促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)，對免疫性肝損害大鼠的肝細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用，其機(jī)制與肝細(xì)胞內(nèi)的PI3K/AKT/GSK3β 信號途徑的活化受抑制有關(guān)[2]。

本次流式細(xì)胞儀檢測的結(jié)果表明EQD 可以顯著抑制LPS 引起的HL-7702 細(xì)胞凋亡。同時，免疫熒光檢測GSK3β 核易位的結(jié)果說明EQD 可以顯著抑制HL-7702細(xì)胞中LPS 誘導(dǎo)后的GSK3β 表達(dá)，而GSK3β 是TLR4/PI3K/AKT/GSK3β 信號通道中重要的下游分子。TLR4/PI3K/AKT/GSK3β 通路是最重要的介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號通路，能夠介導(dǎo)多種生物學(xué)效應(yīng)，對細(xì)胞凋亡、存活起調(diào)節(jié)作用[5]。有研究表明，肝損傷和ALF時TLR4表達(dá)增加，TLR4/PI3K/AKT/GSK3β 通路呈激活狀態(tài)，肝細(xì)胞凋亡率增加[6]。而本次Western-blot 實(shí)驗(yàn)研究顯示，EQD可以顯著抑制HL-7702 細(xì)胞中LPS 誘導(dǎo)后的p-AKT、p-GSK3β 表達(dá)，提示加入EQD 后，TLR4/PI3K/AKT/GSK3β通路呈抑制狀態(tài)，小鼠HL-7702 細(xì)胞凋亡率下降，與流式細(xì)胞儀結(jié)果相一致。

Bcl-2 家族是TLR4/PI3K/AKT/GSK3β 信號通路重要的下游底物，主要包括抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax；TLR4/PI3K/AKT/GSK3β 信號通路激活的表現(xiàn)就是釋放大量的炎癥細(xì)胞因子，引起細(xì)胞凋亡，其中TNFα、IL-6是最典型的炎癥細(xì)胞因子[7，8]。而本次qPCR檢測結(jié)果顯示，EQD可以抑制LPS引起的凋亡和炎癥反應(yīng)，對HL-7702肝細(xì)胞凋亡有干預(yù)作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，EQD 預(yù)處理可以顯著降低由LPS 誘導(dǎo)的人源HL-7702 肝細(xì)胞凋亡率，這種作用可能是通過抑制TLR4/PI3K/AKT/GSK3β 信號通路中重要蛋白分子的表達(dá)，如TLR4、AKT、GSK3β、Bax、Bcl-2 等來實(shí)現(xiàn)的。有關(guān)EQD 的具體干預(yù)機(jī)制尚需進(jìn)一步動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究證實(shí)。