劉裴裴，丁世杰，宋文娟，唐長波，李惠俠，唐紅

NAC通過調(diào)控活性氧影響脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和分化

1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，南京 210095；2新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832000

【目的】細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中易受氧化應(yīng)激，細(xì)胞內(nèi)活性氧水平升高，影響細(xì)胞功能。通過探究N-乙酰-L半胱氨酸（N-Acetyl-L-cysteine, NAC）對(duì)豬脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose-derived mesenchymal stem cells, ADSCs）活性氧的調(diào)控作用，進(jìn)一步明確對(duì)其增殖和分化的影響，為培養(yǎng)脂肪種子細(xì)胞體外大量擴(kuò)增和提高分化效率提供理論基礎(chǔ)和參考依據(jù)。【方法】為建立ADSCs體外培養(yǎng)氧化應(yīng)激模型，在ADSCs增殖過程中加入不同濃度的H2O2(0、25、50、100 μmol·L-1)，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞活力、高通量高內(nèi)涵活細(xì)胞共聚焦成像系統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，確定H2O2的添加濃度。為了篩選NAC促進(jìn)ADSCs增殖的最佳添加濃度，在ADSCs增殖過程中加入不同濃度的NAC (0、1、2、3 mmol·L-1)，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果和細(xì)胞形態(tài)，確定NAC的適宜添加濃度。通過EdU染色和細(xì)胞計(jì)數(shù)分析不同處理?xiàng)l件下(Control、1 mmol·L-1NAC、50 μmol·L-1H2O2、1 mmol·L-1NAC + 50 μmol·L-1H2O2)的細(xì)胞增殖情況，為進(jìn)一步探究NAC對(duì)氧化應(yīng)激的ADSCs增殖的影響。為探究不同處理?xiàng)l件下ADSCs內(nèi)活性氧的水平，對(duì)不同處理?xiàng)l件下增殖3 d后的ADSCs進(jìn)行CellRox染色，通過高通量高內(nèi)涵活細(xì)胞共聚焦成像系統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，明確ADSCs增殖與細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的關(guān)系。為探究ADSCs內(nèi)活性氧水平對(duì)其分化的影響，ADSCs在不同處理?xiàng)l件下分化10 d，對(duì)其進(jìn)行油紅O染色，Image J分析染色面積評(píng)估ADSCs的分化脂質(zhì)積累量并通過RT-qPCR檢測(cè)ADSCs分化相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量?！窘Y(jié)果】ADSCs在增殖過程中，與對(duì)照組相比較，添加50 μmol·L-1H2O2組的ADSCs呈梭形，細(xì)胞內(nèi)活性氧含量顯著升高（＜0.05），氧化應(yīng)激模型成功建立。與對(duì)照組相比，ADSCs在增殖過程中添加50 μmol·L-1H2O2，ADSCs增殖數(shù)目顯著降低（＜0.05），但是在ADSCs分化過程中添加50 μmol·L-1H2O2，ADSCs的脂質(zhì)積累量顯著升高（＜0.05）。ADSCs在增殖過程中，與對(duì)照組相比較，添加1 mmol·L-1NAC組的ADSCs呈梭形，細(xì)胞內(nèi)活性氧含量顯著降低（＜0.05），ADSCs增殖數(shù)目顯著升高（＜0.05），但是1 mmol·L-1NAC的添加對(duì)ADSCs的脂質(zhì)積累沒有顯著影響（＞0.05）?！窘Y(jié)論】氧化應(yīng)激的產(chǎn)生提高ADSCs中活性氧水平，不利于ADSCs體外大量擴(kuò)增，誘導(dǎo)細(xì)胞分化，加速細(xì)胞衰老。在ADSCs體外擴(kuò)增體系中添加1 mmol·L-1NAC可以降低因長期培養(yǎng)、外源刺激等因素帶來的氧化應(yīng)激損傷，對(duì)氧化應(yīng)激的ADSCs具有保護(hù)作用，能有效促進(jìn)細(xì)胞的增殖，并且不會(huì)影響細(xì)胞的分化能力。

NAC；ADSCs；活性氧；增殖；分化；培養(yǎng)脂肪

0 引言

【研究意義】隨著人類生活水平的提高，對(duì)肉制品的需求量逐漸升高，根據(jù)聯(lián)合國糧食和農(nóng)業(yè)組織報(bào)告，預(yù)計(jì)到2025年，肉類產(chǎn)量將增加16%。為緩解畜牧業(yè)的生產(chǎn)壓力，因此，需要尋找一種更綠色的技術(shù)來生產(chǎn)肉類[1]。培養(yǎng)肉技術(shù)作為一項(xiàng)高效、環(huán)保、可持續(xù)的新型肉類生產(chǎn)的方式，是近年來興起的一項(xiàng)顛覆性肉類生產(chǎn)技術(shù)，逐漸成為研究熱點(diǎn)。目前，培養(yǎng)肉的研究主要集中在肌肉組織的生產(chǎn)，作為肉制品中不可缺少的脂肪組織，也是培養(yǎng)肉生產(chǎn)的重點(diǎn)，ADSCs具有易分離且易向成熟脂肪分化的特點(diǎn)，在培養(yǎng)脂肪的生產(chǎn)中具有一定的生產(chǎn)潛力[2]。但是，ADSCs隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，其增殖和分化能力會(huì)明顯下降，從而影響培養(yǎng)脂肪的生產(chǎn)效率，因此，種子細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中具備優(yōu)良增殖和分化能力是生產(chǎn)培養(yǎng)脂肪的關(guān)鍵?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】ADSCs從脂肪組織中分離，在體外培養(yǎng)過程中，其功能易受氧化應(yīng)激的影響，有研究表明，干細(xì)胞增殖與分化的過程受信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、氧化還原狀態(tài)及培養(yǎng)環(huán)境等因素的影響，其中氧化還原狀態(tài)對(duì)干細(xì)胞增殖及分化的影響尤為重要[3]?；钚匝跛皆谝欢ǔ潭壬峡梢员硎炯?xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)。已有研究證明，較低的活性氧使得細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，而過量的活性氧可能導(dǎo)致線粒體功能障礙和組織炎癥等問題[4]。Eto 等[5]研究表明ADSCs對(duì)活性氧的濃度非常敏感，過量的活性氧會(huì)使得細(xì)胞周期停滯，從而抑制細(xì)胞增殖，并作為信號(hào)分子誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞的分化和衰老。Turker等[6]研究發(fā)現(xiàn)，較高劑量的H2O2（10 μmol·L-1）可促進(jìn)3T3-L1小鼠前脂肪細(xì)胞向成熟脂肪分化。NAC是一種膳食補(bǔ)充劑，具有直接清除自由基的作用，能促進(jìn)谷胱甘肽的合成，谷胱甘肽是細(xì)胞對(duì)抗氧化應(yīng)激損傷的主要力量[7]。有研究表明，NAC可以通過降低細(xì)胞內(nèi)活性氧的含量，從而調(diào)節(jié)多種不同種類細(xì)胞的增殖、分化及凋亡[8]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】肌肉干細(xì)胞和ADSCs是兩種最主要的培養(yǎng)肉用種子細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)室前期探究了不同抗氧化劑對(duì)肌肉干細(xì)胞增殖分化的影響：如DING等[9]發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中添加P38抑制劑可促進(jìn)牛肌肉干細(xì)胞的增殖并提高干性基因的表達(dá)；胡榮蓉等[10]發(fā)現(xiàn)，水溶性維生素E的類似物（Trolox）通過調(diào)節(jié)豬肌肉干細(xì)胞中活性氧的含量，促進(jìn)豬肌肉干細(xì)胞增殖。脂肪組織是肉的重要組成部分，ADSCs在培養(yǎng)脂肪生產(chǎn)中也具有很大潛力，而抗氧化劑NAC在培養(yǎng)肉用ADSCs體外擴(kuò)增及分化方面的作用尚不清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問題】ADSCs在體外培養(yǎng)過程中，受氧化應(yīng)激的影響，細(xì)胞內(nèi)活性氧的含量升高，影響ADSCs在體外的擴(kuò)大培養(yǎng)，本研究通過添加抗氧化劑NAC，探究其對(duì)ADSCs內(nèi)活性氧水平的影響，進(jìn)一步研究細(xì)胞內(nèi)活性氧水平對(duì)ADSCs增殖和分化的影響，為培養(yǎng)脂肪種子細(xì)胞規(guī)?；a(chǎn)提供數(shù)據(jù)支撐和理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2021年在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及試劑

3日齡幼豬，由蘇食集團(tuán)生豬養(yǎng)殖基地提供。胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）、DMEMF/12培養(yǎng)基、重組人成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、磷酸鹽酸緩沖溶液（phosphate buffer saline, PBS），購于美國GIBCO公司；100×青霉素鏈霉素雙抗（penicillin-streptomycin, P.S.）、0.25%胰酶，購于上海貝博生物公司；CellRox ? Deep Red試劑，Trizol總RNA提取試劑，購于英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司；NAC、地塞米松（dexamethasone, DEX）、羅格列酮（rosiglitazone, Rosi）、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine, IBMX）、胰島素（insulin, INS）、吲哚美辛（indomethacin, IND），購于美國Abmole公司；分析純30% H2O2，購于上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；細(xì)胞總RNA提取試劑盒，購于天根生化科技（北京）有限公司；TB GreenTMPremix Ex TaqTMII、PrimeScript? RT Master Mix Perfect Real Time，均購于日本Takara公司；EdU染色試劑盒，購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。用于檢測(cè)脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因表達(dá)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR, RT-qPCR）引物（序列見表1）均合成于南京金斯瑞生物科技有限公司。

表1 RT-qPCR所用引物序列

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 豬ADSCs的培養(yǎng) 豬ADSCs的分離方法，參照李惠俠等[11]的分離方法。將原代ADSCs按照1.5×105個(gè)細(xì)胞的密度將細(xì)胞接種到直徑為10 cm培養(yǎng)皿中，用含有bFGF的完全培養(yǎng)基（DMEMF/12 + 10% FBS + 1% P.S.）在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞，生長因子與培養(yǎng)基的添加比例為1﹕2000，細(xì)胞增殖3 d，進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.2.2 豬ADSCs的分化 將原代ADSCs按照4×104個(gè)細(xì)胞的密度將細(xì)胞接種在24孔板中，細(xì)胞融合度達(dá)到85%—95%時(shí)，加入誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)基 + 1 μmol·L-1DEX + 10 μg·mL-1INS + 0.1 mmol·L-1IND + 2 μmol·L-1Rosi + 0.1 mmol·L-1IBMX）進(jìn)行誘導(dǎo)分化，5 d后換為維持分化培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)基+ 10 μg·mL-1INS），維持分化2 d后，換為完全培養(yǎng)基，分化到第10 天，收樣檢測(cè)，在分化過程中，進(jìn)行NAC和H2O2的處理。

1.2.3 氧化應(yīng)激模型的建立 用H2O2處理細(xì)胞建立氧化應(yīng)激模型，設(shè)置濃度梯度，分別為0、25、50、100 μmol·L-1，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞3 d，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞活力、細(xì)胞內(nèi)活性氧含量的測(cè)定，根據(jù)分析結(jié)果及顯微鏡下細(xì)胞狀態(tài)，確定H2O2的添加濃度。

1.2.4 EdU染色 將原代ADSCs以2×104/mL接種到3.5 cm培養(yǎng)皿中，ADSCs經(jīng)過不同的處理后，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，按照細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒的操作技術(shù)說明書進(jìn)行染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖像，并進(jìn)行EdU染色陽性細(xì)胞占比分析。

1.2.5 細(xì)胞計(jì)數(shù) 將原代ADSCs以1.5×105/mL接種到10 cm培養(yǎng)皿中，ADSCs經(jīng)過不同的處理后，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，PBS清洗1遍，0.25%的胰酶消化，收集細(xì)胞后使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.6 細(xì)胞內(nèi)活性氧含量的測(cè)定 將細(xì)胞以1×104個(gè)/mL接到96孔板中，培養(yǎng)3 d，更換添加含有 CellRox Deep Red和Hoechst試劑的新鮮培養(yǎng)基，CellRox Deep Red試劑與培養(yǎng)基的配制比為1﹕500，Hoechst試劑與培養(yǎng)基的配制比為1﹕1000，將細(xì)胞放置在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育30 min，PBS清洗3次，添加不同處理的100 μL新鮮培養(yǎng)基覆蓋細(xì)胞，在活細(xì)胞狀態(tài)下通過高通量高內(nèi)涵活細(xì)胞共聚焦成像系統(tǒng)采集圖像。

1.2.7 油紅O染色、異丙醇萃取、Image J分析 油紅O染色方法及提取法用來檢測(cè)細(xì)胞中甘油三酯的含量。參考脂肪細(xì)胞油紅O染色方法[11]。在每個(gè)視野下根據(jù)五點(diǎn)法，選取5張圖片，利用Image J軟件進(jìn)行油紅O染色面積的檢測(cè)。

1.2.8 RT-qPCR 收集不同試驗(yàn)組分化第10 天的細(xì)胞，加入Trizol試劑裂解細(xì)胞；按照RNA提取試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，微量分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度；按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA，并按照RT-qPCR的說明書，使用2-ΔΔCT的方法計(jì)算目的基因在不同cDNA模板中的相對(duì)表達(dá)量，以作為內(nèi)參基因。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

本研究中試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean ± SEM）表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異由SPSS 20軟件評(píng)估，在Duncan事后檢驗(yàn)下，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）和檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。每個(gè)處理組設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)（n = 3），其中*代表差異顯著（＜0.05），**代表差異極顯著（＜0.01），***代表差異極顯著（＜0.001）。圖由GraphPad Prism 8繪制。

2 結(jié)果

2.1 氧化應(yīng)激模型的建立

高濃度H2O2短時(shí)間處理細(xì)胞是構(gòu)建氧化應(yīng)激模型常見的方法，本研究篩選構(gòu)建氧化應(yīng)激模型的適宜添加濃度標(biāo)準(zhǔn)為在確保細(xì)胞中活性氧水平顯著升高，抑制細(xì)胞增殖但不會(huì)破壞細(xì)胞形態(tài)的條件下，選擇盡可能高濃度的H2O2，篩選出的此濃度將應(yīng)用到探究氧化應(yīng)激的細(xì)胞中活性氧水平升高對(duì)ADSCs分化的影響研究中，因?yàn)樵诜只^程中需要全程添加H2O2，所以本研究構(gòu)建氧化應(yīng)激模型采用低濃度緩慢應(yīng)激的方式。設(shè)置H2O2的濃度為0、25、50、100 μmol·L-1處理細(xì)胞3 d。細(xì)胞增殖3 d后，在顯微鏡下觀察到細(xì)胞的形態(tài)隨著H2O2濃度的升高變得細(xì)長，H2O2的添加濃度在25、50 μmol·L-1時(shí)視野中未見過多的死細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)正常，呈梭形，與從豬皮下脂肪組織中分離得到的細(xì)胞形態(tài)一致[12]。而H2O2的添加濃度在100 μmol·L-1時(shí)，顯微鏡下可觀察到較多的死細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)不正常，呈長條狀（圖1-A—D）。細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果表明，細(xì)胞增殖3 d后，H2O2的添加濃度為25、50、100 μmol·L-1時(shí)，較對(duì)照組相比，細(xì)胞增殖倍數(shù)為0.6倍、0.4倍、0.2倍（圖1-E），隨著H2O2添加濃度的升高，細(xì)胞數(shù)目顯著降低（＜0.05）（圖1-F）。本研究通過EdU染色檢測(cè)不同濃度H2O2處理下的細(xì)胞活力，結(jié)果顯示，未添加H2O2的組（Control）中EdU陽性細(xì)胞占比為32%，細(xì)胞經(jīng)過25、50、100 μmol·L-1處理后，EdU陽性細(xì)胞占比分別為23%、17%、5%，細(xì)胞經(jīng)過25 μmol·L-1處理后，細(xì)胞活力與Control組無顯著性差異（＞0.05），細(xì)胞經(jīng)過50、100 μmol·L-1H2O2處理后，細(xì)胞活力較Control組顯著降低（＜0.05）（圖1-G—K），細(xì)胞經(jīng)過100 μmol·L-1H2O2處理后，活細(xì)胞數(shù)量少，細(xì)胞活力差，無法在細(xì)胞分化過程中全程添加。結(jié)合顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞活力及細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，選擇H2O2的添加濃度為50 μmol·L-1。

A-D. 細(xì)胞培養(yǎng)基中添加0、25、50、100 μmol·L-1H2O2時(shí)細(xì)胞的明場(chǎng)圖；E. 添加不同濃度H2O2時(shí)細(xì)胞增殖倍數(shù)；F.添加不同濃度H2O2時(shí)細(xì)胞計(jì)數(shù)；G-J. 添加不同濃度H2O2時(shí)細(xì)胞EdU染色圖；K. 添加不同濃度H2O2時(shí)細(xì)胞EdU染色陽性細(xì)胞百分比；L-M. 對(duì)照組與50 μmol·L-1H2O2添加組中細(xì)胞CellRox染色；N. 單位面積CellRox平均熒光強(qiáng)度；O. CellRox染色面積；P. CellRox總熒光強(qiáng)度

A-D. Bright field images of cells when 0, 25, 50, and 100 μmol·L-1H2O2were added to the cell culture medium. E. Cell proliferation folds when different concentrations of H2O2were added. F. Cell count when different concentrations of H2O2were added. G-J. EdU staining graph of cells when different concentrations of H2O2were added. K. Percentage of cells positive for EdU staining when different concentrations of H2O2were added. L-M. CellRox staining in the control and 50 μmol·L-1H2O2addition group. N. CellRox: cell average intensity. O. All CellRox mean stain area. P. All CellRox stain integrated intensities

圖1 構(gòu)建氧化應(yīng)激細(xì)胞模型

Fig. 1 Construction of an oxidative stress model of cells

為進(jìn)一步確定，50 μmol·L-1H2O2添加時(shí)，ADSCs中活性氧水平是否顯著高于對(duì)照組，是否可以構(gòu)建氧化應(yīng)激模型。本研究通過CellRox熒光染料對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性氧染色，通過高通量高內(nèi)涵活細(xì)胞共聚焦成像系統(tǒng)檢測(cè)對(duì)照組和50 μmol·L-1H2O2添加組中ADSCs內(nèi)活性氧水平，結(jié)果表明，可以觀察到CellRox染色的陽性細(xì)胞（圖1-L、M），進(jìn)一步進(jìn)行CellRox染色定量分析，50 μmol·L-1H2O2添加組中ADSCs中單位面積CellRox平均熒光強(qiáng)度（圖1-N）、CellRox染色面積（圖1-O）、CellRox總熒光強(qiáng)度（圖1-P）顯著高于對(duì)照組（＜0.05），以上結(jié)果表明，50 μmol·L-1H2O2添加組中ADSCs中活性氧水平顯著升高，成功構(gòu)建氧化應(yīng)激模型。

2.2 NAC適宜添加濃度的篩選

為篩選NAC促進(jìn)ADSCs增殖最佳效果的添加濃度，用不同濃度梯度的NAC（0、1、2、3 mmol·L-1）處理細(xì)胞3 d。細(xì)胞增殖3 d后，通過顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)（圖2-A—D），通過細(xì)胞計(jì)數(shù)對(duì)細(xì)胞的增殖數(shù)量（圖2-E）和增殖倍數(shù)（圖2-F）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明，NAC的添加濃度為1、2、3 mmol·L-1時(shí)，與對(duì)照組相比，細(xì)胞數(shù)目分別為對(duì)照組的1.4倍、1倍、0.8倍，1 mmol·L-1處理組細(xì)胞數(shù)目顯著升高（＜0.05），細(xì)胞形態(tài)正常，呈梭形，NAC促進(jìn)ADSCs增殖最佳效果的添加濃度為1 mmol·L-1。

2.3 NAC通過降低ADSCs中活性氧水平促進(jìn)細(xì)胞增殖

為探究NAC對(duì)氧化應(yīng)激的ADSCs的增殖影響，在其培養(yǎng)過程中加入適宜濃度的NAC。試驗(yàn)共分為4個(gè)組別：對(duì)照組（Control）、1 mmol·L-1NAC組、50 μmol·L-1H2O2組和1 mmol·L-1NAC+50 μmol·L-1H2O2組。細(xì)胞增殖3 d后，通過EdU染色試劑盒和血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，結(jié)果如圖3-A—E所示，在對(duì)照組（Control）中，EdU陽性細(xì)胞占32%，在添加1 mmol·L-1NAC的組中，EdU陽性細(xì)胞占51%，在添加50 μmol·L-1H2O2的組中，EdU陽性細(xì)胞占17%，在添加1 mmol·L-1NAC + 50 μmol·L-1H2O2組中，EdU陽性細(xì)胞占29%。同時(shí)，細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示（圖3-F），添加1 mmol·L-1NAC組的細(xì)胞數(shù)目是對(duì)照組細(xì)胞數(shù)目的1.4倍（＜0.05），添加1 mmol·L-1NAC+50 μmol·L-1H2O2組的細(xì)胞數(shù)目較對(duì)照組的細(xì)胞數(shù)目沒有顯著性變化（＞0.05）。以上結(jié)果表明，1 mmol·L-1NAC可以促進(jìn)ADSCs增殖且對(duì)氧化應(yīng)激的ADSCs具有保護(hù)作用。

NAC是一種抗氧化劑，具有清除細(xì)胞內(nèi)活性氧的作用。為探究ADSCs經(jīng)過不同處理后，細(xì)胞內(nèi)活性氧含量的變化。本研究通過CellRox deep red對(duì)經(jīng)過不同處理的細(xì)胞進(jìn)行活性氧染色，通過高通量高內(nèi)涵活細(xì)胞共聚焦成像系統(tǒng)檢測(cè)熒光信號(hào)。如圖4-A—D所示，CellRox染色結(jié)果都呈陽性，經(jīng)過50 μmol·L-1H2O2處理后的ADSCs中CellRox熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，經(jīng)過1 mmol·L-1NAC處理后的ADSCs中CellRox熒光強(qiáng)度最弱。隨后利用高通量高內(nèi)涵活細(xì)胞共聚焦成像系統(tǒng)對(duì)CellRox染色進(jìn)行定量分析。

A-D．細(xì)胞培養(yǎng)基中添加0、1、2、3 mmol·L-1 NAC時(shí)細(xì)胞的明場(chǎng)圖；E. 添加不同濃度NAC時(shí)細(xì)胞計(jì)數(shù)；F. 添加不同濃度NAC時(shí)細(xì)胞增殖倍數(shù)

CellRox染料主要染細(xì)胞質(zhì)，染料熒光強(qiáng)度越強(qiáng)、熒光范圍越大，說明細(xì)胞內(nèi)活性氧的含量越高。本研究對(duì)ADSCs中單位面積CellRox平均熒光強(qiáng)度（圖4-E）、CellRox染色面積（圖4-F）和總熒光強(qiáng)度（圖4-G）進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果顯示，ADSCs經(jīng)過50 μmol·L-1H2O2處理后，細(xì)胞內(nèi)的單位面積CellRox平均熒光強(qiáng)度、CellRox染色面積和熒光強(qiáng)度顯著升高（＜0.05），說明細(xì)胞內(nèi)活性氧含量較高，進(jìn)一步說明，50 μmol·L-1H2O2的添加成功構(gòu)建氧化應(yīng)激模型。ADSCs經(jīng)過1 mmol·L-1NAC處理后，細(xì)胞內(nèi)的單位面積平均熒光強(qiáng)度、每個(gè)細(xì)胞染色面積和總熒光強(qiáng)度顯著降低（＜0.05），說明細(xì)胞內(nèi)活性氧含量較對(duì)照組降低，NAC清除了ADSCs內(nèi)的部分活性氧。氧化應(yīng)激的ADSCs經(jīng)過1 mmol·L-1NAC + 50 μmol·L-1H2O2處理后，細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平和對(duì)照組沒有顯著差異（＞0.05）。以上結(jié)果說明，1 mmol·L-1NAC可以降低ADSCs內(nèi)活性氧含量，保護(hù)ADSCs免受氧化應(yīng)激的損傷，從而促進(jìn)其增殖。

2.4 ADSCs中活性氧水平升高促進(jìn)細(xì)胞分化

有研究表明，NAC可以減少3T3-L1脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志物的產(chǎn)生從而抑制脂肪細(xì)胞的分化[13]。為探究NAC對(duì)氧化應(yīng)激的ADSCs分化的影響，在細(xì)胞分化過程中加入1 mmol·L-1NAC，試驗(yàn)共分為四個(gè)組別：對(duì)照組（Control）、1 mmol·L-1NAC組、50 μmol·L-1H2O2組和1 mmol·L-1NAC + 50 μmol·L-1H2O2組。細(xì)胞分化10 d后，進(jìn)行油紅O染色（圖5-A—D）和脂質(zhì)積累量分析，結(jié)果表明，在熒光顯微鏡下可以觀察到呈紅色的脂滴，與對(duì)照組相比，50 μmol·L-1H2O2組的脂滴數(shù)量更多。進(jìn)一步用異丙醇對(duì)油紅O染料進(jìn)行提取，酶標(biāo)儀檢測(cè)OD510吸光度，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，1 mmol·L-1NAC組脂質(zhì)積累量沒有顯著性差異（＞0.05），而50 μmol·L-1H2O2組脂質(zhì)積累量顯著升高（＜0.05），1 mmol·L-1NAC+50 μmol·L-1H2O2組脂質(zhì)積累量沒有顯著性差異（＞0.05）（圖5-E）。通過Image J軟件對(duì)50×顯微鏡下油紅O染色圖片的面積進(jìn)行分析（圖5-F），結(jié)果與對(duì)照組相比，1 mmol·L-1NAC組油紅O染色面積沒有顯著性差異（＞0.05），50 μmol·L-1H2O2組油紅O染色面積顯著高于對(duì)照組（＜0.05），1 mmol·L-1NAC + 50 μmol·L-1H2O2組油紅O染色面積沒有顯著性差異（＞0.05），與脂質(zhì)積累量的檢測(cè)結(jié)果一致。

A-D.不同處理組的EdU染色結(jié)果；E. 不同處理組的EdU染色陽性細(xì)胞百分比；F. 不同處理組的細(xì)胞計(jì)數(shù)

通過RT-qPCR檢測(cè)ADSCs在不同處理?xiàng)l件下分化相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量，在分子水平上進(jìn)一步探究NAC對(duì)氧化應(yīng)激的ADSCs分化的影響。PPARγ和C/EBPα是脂肪生成的關(guān)鍵調(diào)控因子[14]，與對(duì)照組相比， 50 μmol·L-1H2O2組中（圖6-A）和（圖6-B）的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高（＜0.05），而1 mmol·L-1NAC組和1 mmol·L-1NAC + 50 μmol·L-1H2O2組中和的mRNA相對(duì)表達(dá)量沒有顯著性變化（＞0.05）。是已知的分化脂肪細(xì)胞的標(biāo)志物[15]，50 μmol·L-1H2O2組中的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他處理組（圖6-C）。在脂肪分化過程中是必不可少的，它可以在成熟脂肪細(xì)胞的脂滴表面表達(dá)[16]。本研究中50 μmol·L-1H2O2組中的的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組和1 mmol·L-1NAC組（圖6-D）。以上結(jié)果表明，50 μmol·L-1H2O2的添加使得ADSCs內(nèi)的活性氧含量升高，有利于ADSCs的分化，而1 mmol·L-1NAC對(duì)ADSCs的分化沒有影響。

A-D. 不同處理組的CellRox染色；E. 不同處理組單位面積CellRox平均熒光強(qiáng)度；F. 不同處理組CellRox染色面積；G. 不同處理組CellRox總熒光強(qiáng)度

3 討論

3.1 氧化應(yīng)激抑制ADSCs的增殖

多種干細(xì)胞在長期體外培養(yǎng)的過程中，出現(xiàn)干性衰退的問題[17]，其影響因素有很多，如細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境、細(xì)胞內(nèi)因子和信號(hào)通路的調(diào)節(jié)等。L'HONORE等[18]發(fā)現(xiàn)小鼠肌肉干細(xì)胞在體外短期培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞內(nèi)活性氧的含量逐漸增加，其增殖能力隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加而不斷降低。在培養(yǎng)肉研究初期發(fā)現(xiàn)，ADSCs在體外擴(kuò)增時(shí)其增殖和分化能力會(huì)隨著傳代次數(shù)的增加而逐漸降低，不利于種子細(xì)胞的大量獲取，成為制約培養(yǎng)肉大規(guī)模生產(chǎn)的重要因素。

A-D. 不同處理組的油紅O染色圖；E. 不同處理組的脂質(zhì)積累分析；F. 不同處理的油紅O染色面積分析

活性氧是一種重要的高活性分子，其來源主要包括線粒體呼吸系統(tǒng)、NADPH氧化酶、黃嘌呤氧化還原酶和黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)等[19]。在正常情況下，有氧代謝產(chǎn)生的活性氧是各種生理過程的重要信號(hào)。然而，當(dāng)細(xì)胞中活性氧濃度較高時(shí)，會(huì)影響氧化還原介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞命運(yùn)，損害細(xì)胞DNA、蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂質(zhì)，影響原代細(xì)胞的功能，如黏附、增殖、遷移和分化[20]。有研究表明，活性氧可誘導(dǎo)JNK、p38MAPK和ERK等MAPK途徑的激活，以及凋亡蛋白的活化和抗凋亡途徑的抑制[21]。YAHATA等[22]研究發(fā)現(xiàn)活性氧積累至超出生理水平時(shí)造成DNA損傷并誘導(dǎo)細(xì)胞周期抑制劑的表達(dá)，導(dǎo)致造血干細(xì)胞增殖停滯，細(xì)胞發(fā)生老化和凋亡。本研究通過外源添加H2O2模擬ADSCs在體外培養(yǎng)過程中所受氧化應(yīng)激，建立氧化應(yīng)激模型。有研究表明，在ADSCs培養(yǎng)過程中，通過添加500 μmol·L-1H2O2處理細(xì)胞24 h建立氧化應(yīng)激模型，除此之外，研究中還說明H2O2在超過正常生理狀態(tài)（＞100 nmol·L-1）的濃度下，會(huì)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激[23]。高濃度短期處理是構(gòu)建氧化應(yīng)激模型常用的方法，本研究篩選用于構(gòu)建氧化應(yīng)激模型的添加濃度同時(shí)用在細(xì)胞分化過程中，所以采用低濃度長期處理的方法構(gòu)建氧化應(yīng)激模型。本研究通過添加50 μmol·L-1H2O2處理細(xì)胞3 d，ADSCs中活性氧水平顯著升高，細(xì)胞增殖顯著被抑制，細(xì)胞活力顯著降低，細(xì)胞形態(tài)呈梭形，成功建立氧化應(yīng)激模型。

3.2 NAC可以降低細(xì)胞內(nèi)活性氧含量促進(jìn)ADSCs增殖

正常條件下，細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)處在一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡中，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的活性氧濃度升高時(shí)，細(xì)胞強(qiáng)大的抗氧化系統(tǒng)進(jìn)行活性氧的清除[3]。但有時(shí)候，細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，易受環(huán)境影響，產(chǎn)生氧化應(yīng)激，然而抗氧化酶系統(tǒng)的抗氧化能力有限，細(xì)胞易造成損傷，增殖停滯，進(jìn)而凋亡，這就需要?jiǎng)?chuàng)造低氧環(huán)境或加入抗氧化劑，保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的影響。目前調(diào)控細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的方法主要有三種，第一種是通過為細(xì)胞生長提供一個(gè)低氧環(huán)境，有研究表明，造血干細(xì)胞在可創(chuàng)造低氧環(huán)境兩性離子水凝膠中進(jìn)行體外培養(yǎng)，可以減緩其分化并促進(jìn)其自我更新[24]。第二種是通過基因編輯調(diào)控細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，但基因編輯可能在培養(yǎng)脂肪開發(fā)中引發(fā)消費(fèi)者的不滿。第三種是通過添加具有清除活性氧的抗氧化劑，常用的抗氧化劑包括維生素C[25]、維生素E[26]、黃酮類化合物[27]、白藜蘆醇[28]等。

圖6 脂肪分化相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量

NAC通過促進(jìn)機(jī)體內(nèi)谷胱甘肽的生物合成來有效減少自由基的累積效應(yīng)對(duì)不同干細(xì)胞發(fā)揮抗氧化作用，包括造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞。MARTACIC等[29]研究發(fā)現(xiàn)，NAC在體外可以保護(hù)人乳牙組織干細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷，從而保持這些細(xì)胞的再生潛力。對(duì)于NAC對(duì)脂肪細(xì)胞增殖的研究較少，有研究表明，NAC可以促進(jìn)人來源的ADSCs增殖并且還可以抑制其凋亡和壞死[30]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞培養(yǎng)基中添加1 mmol·L-1NAC可以顯著降低ADSCs內(nèi)活性氧的含量，同時(shí)促進(jìn)ADSCs增殖，與XIONG等[30]的研究結(jié)果一致。NAC通過降低氧化應(yīng)激的ADSCs中活性氧水平，逆轉(zhuǎn)了ADSCs的氧化損傷，對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的ADSCs生長起到了保護(hù)作用。有研究表明，NAC發(fā)揮抗氧化作用是通過NF-κB介導(dǎo)的信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)的[31]，對(duì)于NAC促進(jìn)ADSCs增殖的作用機(jī)制尚不明確，還需要進(jìn)一步探究。

3.3 ADSCs內(nèi)活性氧水平升高有利于細(xì)胞成脂分化

脂肪細(xì)胞分化形成成熟脂肪是一個(gè)極其精密和復(fù)雜的過程，涉及許多脂肪信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)。初始誘導(dǎo)后，轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ和C/EBPδ作為脂肪生成的主要早期調(diào)節(jié)因子，靶向C/EBPα和PPARγ的啟動(dòng)子，當(dāng)進(jìn)一步刺激成為成熟的脂肪細(xì)胞時(shí)，PPARγ和C/EBPα一起調(diào)控，以驅(qū)動(dòng)數(shù)百個(gè)下游脂肪基因的表達(dá)。最終，誘導(dǎo)晚期脂肪生成的因子如FABP4、PLIN 1等賦予脂肪細(xì)胞的生理功能并促進(jìn)脂滴的進(jìn)一步成熟[32]。有研究表明，脂肪細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平與其成脂分化能力息息相關(guān)，在人脂肪來源的干細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中添加100 μmol·L-1H2O2，可以促進(jìn)細(xì)胞中脂質(zhì)的積累，有利于其分化。在本研究中，在ADSCs分化過程中添加50 μmol·L-1H2O2，與對(duì)照組相比，細(xì)胞中的脂質(zhì)積累量顯著升高，調(diào)控脂肪分化的關(guān)鍵因子C/EBPα、PPARγ的mRNA的相對(duì)表達(dá)量也顯著升高，除此之外，表征成熟脂肪生成的因子FABP4、PLIN 1的mRNA的相對(duì)表達(dá)量也顯著升高，以上結(jié)果說明，ADSCs中活性氧水平的升高有利于其分化。本研究與HIGUCHI等的研究結(jié)果一致。活性氧可以調(diào)節(jié)干細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞，但潛在的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制尚不清楚。有研究表明，胰島素信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)合成，胰島素信號(hào)激活A(yù)kt-mTORC1途徑，從而通過轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1和PPARγ增強(qiáng)成脂酶的表達(dá)?；钚匝蹩赏ㄟ^抑制磷酸酯酶與張力蛋白同源物來增強(qiáng)胰島素觸發(fā)的Akt信號(hào)傳導(dǎo)。此外，有證據(jù)表明，活性氧可能促進(jìn)C/EBPβ的二聚化，導(dǎo)致C/EBPβ的DNA結(jié)合活性增加，導(dǎo)致下游脂肪效應(yīng)子C/EBPα的表達(dá)[33]。活性氧與脂肪細(xì)胞分化的調(diào)控機(jī)制，還需要進(jìn)一步研究。反之，也有研究表明，NAC可以降低小鼠脂肪細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平從而抑制脂質(zhì)積累，這主要是通過抑制ERK/JNK-MAPK信號(hào)通路的表達(dá)來抑制脂肪細(xì)胞分化[34]。HIGUCHI等[33]發(fā)現(xiàn)，人脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞在100 μmol·L-1H2O2氧化應(yīng)激條件下添加10 mmol·L-1NAC，脂肪細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積累量顯著降低。在本研究中ADSCs在50 μmol·L-1H2O2創(chuàng)造的氧化應(yīng)激下添加1 mmol·L-1NAC，ADSCs中脂質(zhì)積累量沒有顯著性變化，可能是因?yàn)楸狙芯恐蠳AC添加濃度較低，降低的活性氧的水平對(duì)脂肪細(xì)胞的分化不足以產(chǎn)生顯著性影響。

4 結(jié)論

本研究證明，在氧化應(yīng)激環(huán)境下豬脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)活性氧含量升高，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖，不利于培養(yǎng)脂肪種子細(xì)胞大量擴(kuò)增。在豬脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞增殖過程中添加1 mmol·L-1N-乙酰-L半胱氨酸，細(xì)胞中活性氧水平降低，可有效緩解由于氧化應(yīng)激造成豬脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力下降的問題，為培養(yǎng)脂肪種子細(xì)胞的擴(kuò)增奠定基礎(chǔ)。在活性氧對(duì)豬脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分化能力的影響研究中，本研究證明，豬脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞中活性氧的升高，可以更好地誘導(dǎo)豬脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化，有利于脂質(zhì)的積累。本研究可以為實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)脂肪種子細(xì)胞的擴(kuò)大培養(yǎng)和提高培養(yǎng)脂肪種子細(xì)胞的分化效率提供理論依據(jù)，但N-乙酰-L半胱氨酸促進(jìn)豬脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的作用機(jī)制和活性氧對(duì)豬脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分化調(diào)控機(jī)制尚不明確，還需要進(jìn)一步探究。

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NAC Affects Proliferation and Differentiation of Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells by Regulating Reactive Oxygen Species

1College of Animal Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095;2Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Sciences/State Key Laboratory for Sheep Genetic Improvement and Healthy Production, Shihezi 832000, Xinjiang

【Objective】 Cells are sensitive to oxidative stress and elevated levels of intracellular reactive oxygen species during in vitro culture, which affects cell function. In this research, the regulation of reactive oxygen species in porcine adipose mesenchymal stem cells by N-acetyl-L cysteine (NAC) was evaluated, and the effects on their proliferation and differentiation were further clarified, which could provide a theoretical basis and reference for cultured fat seed cells to expand in vitro in large numbers and improve differentiation efficiency. 【Method】 In this research, to model oxidative stress, the different concentrations of H2O2(0, 25, 50, and 100 μmol·L-1) were added during the proliferation of adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSCs). The added concentration of H2O2was identified by cell counting results, cell morphology, cell viability and intracellular reactive oxygen species levels detected by a High-throughput High-content Live Cells Confocal Imaging System. To select the appropriate addition concentration of NAC to promote the proliferation of ADSCs, the different concentrations of NAC (0, 1, 2, and 3 mmol·L-1) were added during the proliferation of ADSCs, and the appropriate addition concentration of NAC was determined by cell counting results and cell morphology. To further explore the effect of NAC on the proliferation of oxidatively stressed ADSCs, cell proliferation under different treatment conditions (Control, 1 mmol·L-1NAC, 50 μmol·L-1H2O2, and 1 mmol·L-1NAC + 50 μmol·L-1H2O2) was analyzed by EdU staining and cell counting. To investigate the level of reactive oxygen species in ADSCs under different treatment conditions, ADSCs proliferated under different treatment conditions for 3 d were stained by CellRox, and the intracellular reactive oxygen species content was detected by High-throughput High-inclusion Live Cell Confocal Imaging System to clarify the relationship between ADSCs proliferation and intracellular reactive oxygen species level. To explore the effect of reactive oxygen species levels within ADSCs on their differentiation, ADSCs were stained with Oil Red O after 10 d of differentiation under different treatment conditions, and the amount of differentiated lipid accumulation in ADSCs was assessed by Image J analysis of stained area, and the relative expression of ADSCs differentiation-related genes was examined by RT-qPCR. 【Result】 During the proliferation of ADSCs, ADSCs in the group with 50 μmol·L-1H2O2were shuttle-shaped and had significantly higher intracellular reactive oxygen species content compared with the control group (＜0.05), and the oxidative stress model was successfully established. Compared with the control group, when 50 μmol·L-1H2O2was added during proliferation of ADSCs, the number of ADSCs proliferation was significantly decreased (＜0.05), but the lipid accumulation of ADSCs was significantly higher (＜0.05) when 50 μmol·L-1H2O2was added during the differentiation of ADSCs. During the proliferation of ADSCs, ADSCs in the group with the addition of 1 mmol·L-1NAC had a shuttle shape, the intracellular reactive oxygen species content was significantly lower (＜0.05), and proliferation number of ADSCs was significantly higher (＜0.05) compared with the control group, but the addition of 1 mmol·L-1NAC during the differentiation of ADSCs had no significant effect on the lipid accumulation of ADSCs (＞0.05). 【Conclusion】 When ADSCs were affected by oxidative stress, the level of reactive oxygen species in ADSCs increases, which was detrimental to the massive expansion of ADSCs in vitro, inducing cell differentiation and accelerating cellular senescence. The addition of 1 mmol·L-1NAC to the in vitro expansion system of ADSCs could reduce the oxidative stress damage brought about by long-term culture and exogenous stimulation, and had a protective effect on oxidatively stressed ADSCs, which could effectively promote cell proliferation and did not affect the differentiation ability of the cells.

NAC; ADSCs; reactive oxygen species; proliferation; differentiation; cultured fat

2022-05-09；

2023-09-17

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2021YFC2101403）、國家自然科學(xué)基金（32172725）

劉裴裴，E-mail：1563398259@qq.com。通信作者李惠俠，E-mail：lihuixia@njau.edu.cn。通信作者唐紅，E-mail：urblockhead@163.com

（責(zé)任編輯 林鑒非）