郭晗玥，王東升，阮楊，喬亦鑄，張蕓滔，李玲，黃啟為，郭世偉，凌寧，沈其榮

西瓜連作根際土壤微生物群落演替特征

1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院/國(guó)家有機(jī)肥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇省固體有機(jī)廢物利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210095；2南京市蔬菜科學(xué)研究所，南京210042

【目的】研究連作對(duì)西瓜根際土壤中細(xì)菌、真菌群落構(gòu)建和潛在功能的影響，明確根際微生物對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)性，為西瓜連作障礙的生態(tài)防治和農(nóng)田土壤的健康保持提供理論基礎(chǔ)。【方法】以未連作（對(duì)照）、連作2茬和連作 6茬的西瓜根際土壤為研究對(duì)象，利用16S rRNA和ITS高通量測(cè)序技術(shù)解析西瓜連作對(duì)根際土壤細(xì)菌、真菌群落特征和演替的影響?！窘Y(jié)果】隨著連作茬次的增加，西瓜根際土壤中細(xì)菌多樣性指數(shù)呈現(xiàn)先下降后上升趨勢(shì)，真菌多樣性指數(shù)顯著下降。在細(xì)菌屬水平，多茬次的連作降低了西瓜根際土壤中鞘氨醇單胞菌屬（）和溶桿菌屬（）的相對(duì)豐度；在真菌屬水平，鐮刀菌屬（）相對(duì)豐度隨連作茬次增加呈增加趨勢(shì)。與對(duì)照相比，連作的網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜度更高，但網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性低。此外，相比于對(duì)照，連作6茬顯著減少有害物質(zhì)的生物降解途徑以及氨基酸的代謝途徑的相對(duì)豐度，并且在連作6茬后真菌群落中病原真菌相對(duì)豐度顯著增多。在群落演替過(guò)程中，隨機(jī)性過(guò)程主導(dǎo)連作下西瓜根際細(xì)菌群落構(gòu)建，而確定性過(guò)程主導(dǎo)連作下西瓜根際真菌群落構(gòu)建?！窘Y(jié)論】連作引起根際細(xì)菌和真菌的群落特征、功能組成和演替過(guò)程變化，細(xì)菌群落關(guān)鍵功能的減少、病原真菌相對(duì)豐度的增加以及微生物群落網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定性的減小可能是導(dǎo)致西瓜連作障礙發(fā)生的重要因素。

西瓜；連作土壤；根際微生物群落；功能預(yù)測(cè)；群落演替

0 引言

【研究意義】西瓜（Thunb. Matsum and Naka）是我國(guó)乃至世界主要的夏季水果之一[1]，其具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值以及巨大的市場(chǎng)需求，促使農(nóng)戶(hù)利用現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)進(jìn)行集約化生產(chǎn)。然而西瓜連年單作現(xiàn)象十分普遍[2]，導(dǎo)致西瓜連作障礙愈發(fā)嚴(yán)重且成為了限制西瓜產(chǎn)業(yè)持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展的重要因素[3]。長(zhǎng)期連作也會(huì)引起土壤理化性質(zhì)改變、土壤病原菌富集以及自毒物質(zhì)的積累，最終導(dǎo)致作物生長(zhǎng)受限[4-5]。土壤微生物在保持土壤功能和根際生態(tài)系統(tǒng)可持續(xù)性方面起著至關(guān)重要的作用，且通常被認(rèn)為是土壤健康的敏感生物指標(biāo)[6-7]。研究連作對(duì)西瓜根際土壤中細(xì)菌、真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響，對(duì)防治西瓜連作障礙和保持農(nóng)田土壤的健康具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】有研究表明，對(duì)連作土壤進(jìn)行滅菌能夠顯著提高植物的生長(zhǎng)和品質(zhì)[8]，這表明生物因素是植物連作土壤病害發(fā)生的主要原因。植物根際擁有大量微生物，它們參與土壤養(yǎng)分循環(huán)，影響植物對(duì)養(yǎng)分的吸收與利用，對(duì)于植物生長(zhǎng)起著至關(guān)重要的作用[9-10]。植物根際同時(shí)也是土傳病原菌進(jìn)入植物的必經(jīng)之地，在入侵植物體之前，病原菌會(huì)先與土著微生物競(jìng)爭(zhēng)生態(tài)位，再?gòu)母H感染植物體[5,11]。過(guò)往研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期的單一作物栽培所引起的土壤性質(zhì)惡化以及植物根系分泌物在內(nèi)的化感作用會(huì)改變根際微生物群落特征[12-14]。有研究表明，連作會(huì)簡(jiǎn)化土壤微生物群落生態(tài)網(wǎng)絡(luò)并降低網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定性，這可能與土壤理化性質(zhì)惡化、土壤肥力下降密切相關(guān)[15]。此外，了解微生物群落組裝的生態(tài)過(guò)程有助于識(shí)別微生物群落組成如何響應(yīng)環(huán)境變化，其中確定性過(guò)程和隨機(jī)性過(guò)程基于生態(tài)位理論和中性理論，通常用于解釋微生物群落構(gòu)建[16]。確定性過(guò)程包括非生物（pH、鹽度、有機(jī)碳含量[17-18]）和生物（捕食、共生和寄生等[19]）因素，決定物種的存在與否和相對(duì)豐度，與生態(tài)選擇相關(guān)；隨機(jī)過(guò)程包括不可預(yù)測(cè)的擾動(dòng)、概率性的散布和隨機(jī)的出生-死亡事件等，這些變化不是由環(huán)境決定的適應(yīng)性結(jié)果。確定性過(guò)程和隨機(jī)過(guò)程在構(gòu)建生態(tài)群落中同時(shí)起作用來(lái)調(diào)節(jié)群落構(gòu)建[20-21]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前對(duì)西瓜長(zhǎng)期連作體系下根際土壤微生物群落特征及其構(gòu)建過(guò)程研究較少，這對(duì)于預(yù)測(cè)根際微生物在調(diào)節(jié)植物-微生物生態(tài)系統(tǒng)功能中的作用是至關(guān)重要的?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究以不同連作茬次的西瓜為研究對(duì)象，采用16S rRNA和ITS高通量測(cè)序技術(shù)，研究連作對(duì)西瓜根際土壤細(xì)菌和真菌群落組成的影響，同時(shí)結(jié)合PICRUSt2和FUNGuild分別分析連作土壤細(xì)菌群落功能和真菌營(yíng)養(yǎng)型變化，并探究連作對(duì)根際微生物分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜性和穩(wěn)定性的影響，最后通過(guò)計(jì)算Modified Stochasticity Ratio（校正的隨機(jī)率）來(lái)解析根際微生物群落構(gòu)建機(jī)制?？傊芯坑兄诮沂疚鞴线B作的障礙機(jī)制，從而為西瓜的種植和產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 研究地點(diǎn)概況

在南京市蔬菜花卉科學(xué)研究所（31°43′N(xiāo)，118°47′E）建立了一個(gè)長(zhǎng)期試驗(yàn)大棚。試驗(yàn)地土壤為黃棕壤，年平均日照時(shí)數(shù)2 016.4 h，年均氣溫14.7℃。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和土壤樣品采集

本試驗(yàn)在同一地塊種植品種為8424西瓜，種植面積為28 m2，共種植32株，種植間距為0.45 m，其生長(zhǎng)期間日均溫度38℃，夜均溫度24℃。自2014年，每年進(jìn)行春（3月）、秋（8月）兩茬種植。本試驗(yàn)共設(shè)置3個(gè)連作時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行采樣，分別于2014（西瓜未連作，對(duì)照組CK）、2015（連作2茬，CC2）、2017年（連作6茬，CC6）的5月采集西瓜根際土壤樣品。在每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)采取9株長(zhǎng)勢(shì)相似西瓜的根際土，其中每3株合并為一個(gè)混合樣本，即每個(gè)時(shí)間點(diǎn)有3個(gè)重復(fù)樣本。共獲得9個(gè)樣本（3個(gè)時(shí)間點(diǎn)×3次重復(fù)）。對(duì)于根際土壤的采集，將根部完整取出，并輕微搖動(dòng)去除松散的可見(jiàn)土壤[22]。將根樣品切成約2 cm小段，裝入50 mL無(wú)菌無(wú)酶離心管中，加入適量無(wú)菌蒸餾水，置于搖床中以180 r/min轉(zhuǎn)速振蕩30 min，洗滌緊貼根部表面的土壤，之后將離心管中的根取出，并以8 000 r/min離心10 min得到根際土壤樣品[23]，將收集的根際土壤保存在-80℃冰箱中進(jìn)行后續(xù)分析。

1.3 DNA提取和Illumina MiSeq測(cè)序

使用FastDNA?（MP Biomedicals, Cleveland, OH, USA）土壤DNA提取試劑盒從0.5 g濕重土壤中提取根際土壤微生物總DNA。之后使用Qubit?DNA濃度檢測(cè)試劑盒測(cè)定提取的DNA質(zhì)量。分別使用引物515F/907R和ITS1F/ITS2R引物擴(kuò)增細(xì)菌基因V4—V5區(qū)和真菌基因ITS1區(qū)。使用Illumina Miseq系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用MOTHUR軟件對(duì)下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制[24]。具體而言，將短序列以及低質(zhì)量序列進(jìn)行去除，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，去除存在的嵌合體序列。將剩余的高質(zhì)量序列以97%的閾值生成可操作分類(lèi)單元（operational taxonomic units，OTUs）并選取代表序列進(jìn)行分類(lèi)學(xué)分析，再基于樣本最小序列數(shù)對(duì)所有樣本抽平后計(jì)算chao1、richness和shannon多樣性指數(shù)?；?Bray-Curtis 距離用“R（v4.0.2）”中的“vegan”包進(jìn)行主坐標(biāo)分析（PCoA）。使用“pheatmap”和“ggplot2”包在R環(huán)境中揭示不同土壤樣品中細(xì)菌和真菌物種在門(mén)水平和屬水平上的差異。采用PICRUSt2軟件對(duì)細(xì)菌OTU豐度表進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行功能基因預(yù)測(cè)分析，將OTU信息與KEGG（Kyoto Encyclo-pediaof Genesand Genomes）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得三級(jí)功能基因的豐度，參考KEGG的二級(jí)代謝通路的功能基因類(lèi)別劃分歸類(lèi)，獲得功能基因組成。為了確定真菌營(yíng)養(yǎng)模式分類(lèi)群，使用FUNGuild進(jìn)行注釋[25]，并保留probable和highly probable置信度的數(shù)據(jù)，以及single mode和mixed mode的數(shù)據(jù)。

使用隨機(jī)矩陣?yán)碚摚≧MT）自動(dòng)確定合適的網(wǎng)絡(luò)閾值[26]，基于所有處理的細(xì)菌和真菌總OTU豐度矩陣進(jìn)行物種共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)分析并使用Gephi0.9.2得到細(xì)菌總網(wǎng)絡(luò)和真菌總網(wǎng)絡(luò)。之后從總節(jié)點(diǎn)和邊文件中抽提出每個(gè)處理所擁有的節(jié)點(diǎn)和邊，得到每個(gè)處理的細(xì)菌子網(wǎng)絡(luò)和真菌子網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)計(jì)算網(wǎng)絡(luò)各節(jié)點(diǎn)的模塊內(nèi)連通性（）和模塊間連通性（），識(shí)別網(wǎng)絡(luò)中潛在關(guān)鍵物種[27]。通過(guò)計(jì)算和值的大小，將網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵物種劃分為三類(lèi)：模塊中心（模塊內(nèi)高度連接的節(jié)點(diǎn)，＞2.5和＜0.62）、網(wǎng)絡(luò)中心（整個(gè)網(wǎng)絡(luò)內(nèi)高度連接的節(jié)點(diǎn)，＞2.5和＞0.62）和網(wǎng)絡(luò)連接節(jié)點(diǎn)（連接不同模塊的節(jié)點(diǎn)，＜2.5和＞0.62）[26]。使用Gephi0.9.2繪制網(wǎng)絡(luò)圖。使用自然連通度指標(biāo)確定網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[28]，通過(guò)去除網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)來(lái)模擬受到的外界擾動(dòng)，并計(jì)算節(jié)點(diǎn)去除后網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性，以評(píng)估網(wǎng)絡(luò)在受到隨機(jī)攻擊后穩(wěn)定性下降的速度。最后，使用校正的隨機(jī)率（modified stochasticity ratio，MST）來(lái)量化確定性和隨機(jī)過(guò)程在群落組裝過(guò)程中的相對(duì)重要性，以50%作為更確定性（MST＜50%）和更隨機(jī)（MST＞50%）集合之間的分界點(diǎn)[16]。

2 結(jié)果

2.1 連作對(duì)西瓜根際細(xì)菌和真菌群落多樣性和組成的影響

不同連作茬次下西瓜根際細(xì)菌群落的chao1、richness和shannon指數(shù)隨著連作茬次的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)（圖1-A），而真菌群落的相應(yīng)指數(shù)顯著降低（圖1-B）。這表明，連作在一定程度上有利于細(xì)菌群落豐富度的增加，而降低了真菌群落豐富度。基于Bray-Curtis距離的主坐標(biāo)分析（PCoA）對(duì)對(duì)照、連作2茬、連作6茬的根際細(xì)菌和真菌群落組成特征進(jìn)行可視化，結(jié)果表明，不同連作茬次中根際細(xì)菌和真菌群落聚集成不同的簇，也說(shuō)明了隨著連作茬次的增加，微生物群落組成發(fā)生顯著改變（圖2-A，Adonis2=0.71，=0.003；圖2-B，Adonis2=0.84，=0.004）。

我們將平均相對(duì)豐度大于1%的細(xì)菌門(mén)和真菌門(mén)劃分為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，3種不同連作茬次的根際土壤中細(xì)菌優(yōu)勢(shì)門(mén)分別是變形菌門(mén)（Proteobacteria）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria）（圖2-C）。在細(xì)菌群落中，變形菌門(mén)在3種不同連作茬次中土壤的比例均最高，占比為83.3%—47.1%，并且隨著連作茬次增加呈先減少后增加趨勢(shì)。相比于對(duì)照，擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度在連作2茬中增加了22.2%和11.2%，而在連作6茬中分別增加了5.1%和0.76%（圖2-C）。屬于優(yōu)勢(shì)真菌門(mén)的是子囊菌門(mén)（Ascomycota）、擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）、壺菌門(mén)（Chytridiomycota）（圖2-D）。真菌群落中，子囊菌門(mén)和擔(dān)子菌門(mén)不僅相對(duì)豐度最高，且隨連作茬次表現(xiàn)出不同的差異變化。在真菌群落中，子囊菌門(mén)在3個(gè)不同連作茬次土壤中的占比均最高，為32.16%—66.1%，并且其相對(duì)豐度隨連作茬次增加呈先減少后增加趨勢(shì)。而擔(dān)子菌門(mén)的相對(duì)豐度呈先增加后減少趨勢(shì)（圖2-D）。在屬水平，相比于對(duì)照，連作2茬和6茬細(xì)菌群落中鞘氨醇單胞菌屬（）相對(duì)豐度分別減少了4.5%和0.6%，鞘氨醇菌屬（）相對(duì)豐度分別減少了7.6%和7.2%，溶桿菌屬（）相對(duì)豐度分別減少了2.5%和1.6%；連作6茬與對(duì)照相比，劍菌屬（）和芽孢桿菌屬（）相對(duì)豐度分別減少了1.1%和0.2%（圖2-E）。真菌群落中，相比于對(duì)照，連作2茬和6茬的鐮刀菌屬（）相對(duì)豐度分別增加了4.1%和60.6%（圖2-F）。這些結(jié)果表明連作過(guò)程明顯改變了根際細(xì)菌、真菌群落結(jié)構(gòu)，且群落組成相似度隨連作茬次的增加而降低。

A：不同連作茬次下根際細(xì)菌群落chao1、richness和shannon指數(shù)；B：不同連作茬次下根際真菌群落chao1、richness和shannon指數(shù)。不同的字母表示不同處理間細(xì)菌、真菌豐度的顯著差異（P＜0.05）

2.2 連作對(duì)西瓜根際細(xì)菌和真菌群落預(yù)測(cè)功能的影響

采用PICRUSt2對(duì)各個(gè)連作茬次中根際細(xì)菌群落進(jìn)行功能預(yù)測(cè)。在三級(jí)功能水平的預(yù)測(cè)功能中，對(duì)照的西瓜根際細(xì)菌群落共得到297個(gè)代謝通路，相較于其他兩個(gè)時(shí)期，富集了50個(gè)代謝通路；連作2茬共得到295個(gè)代謝通路，相較于其他兩個(gè)時(shí)期，富集了41個(gè)代謝通路；連作6茬共得到298個(gè)代謝通路，相較于其他兩個(gè)時(shí)期，富集了26個(gè)代謝通路（圖3-a）。將所獲得相對(duì)豐度高的代謝通路進(jìn)行二級(jí)功能水平歸類(lèi)，結(jié)果顯示，除其他次生代謝物的生物合成外，其余功能基因的相對(duì)豐度隨連作茬次變化均有不同的響應(yīng)（圖3-c）。相比于對(duì)照，連作2茬會(huì)顯著減少碳水化合物、萜類(lèi)和多酮類(lèi)化合物的代謝、細(xì)胞生長(zhǎng)和死亡等代謝途徑相對(duì)豐度，而增加了復(fù)制和修復(fù)、輔助因子和維生素的代謝、運(yùn)輸和分解代謝等途徑；連作6茬會(huì)顯著減少有害物質(zhì)的生物降解和代謝及其他氨基酸的代謝等途徑的相對(duì)豐度，反而增加了多糖的生物合成和代謝途徑（圖3-c）。真菌功能群使用FUNGuild進(jìn)行預(yù)測(cè)，其中連作6茬會(huì)顯著富集病理型（pathotroph）真菌（圖3-b）。其中相比于對(duì)照，連作6茬會(huì)顯著富Plant pathogen（植物病原體）類(lèi)型真菌，而Soil saprotroph（土壤腐生生物）會(huì)顯著減少（圖3-d）。

A：不同連作茬次下根際細(xì)菌群落主坐標(biāo)分析（PCoA）；B：不同連作茬次下根際真菌群落主坐標(biāo)分析（PCoA）；C：不同連作茬次下根際細(xì)菌群落門(mén)水平組成；D：不同連作茬次下根際真菌群落門(mén)水平組成；E：不同連作茬次下根際細(xì)菌群落屬水平組成；F：不同連作茬次下根際真菌群落屬水平組成

a：不同連作茬次中KEGG三級(jí)代謝通路相對(duì)豐度差異變化。括號(hào)中的數(shù)字分別代表著比其他兩個(gè)處理顯著富集的代謝通路數(shù)量和預(yù)測(cè)得到的代謝通路總數(shù)；b：不同連作茬次中根際真菌營(yíng)養(yǎng)型相對(duì)豐度的差異分析，括號(hào)中的數(shù)字代表著比其他兩個(gè)處理顯著富集的真菌營(yíng)養(yǎng)型數(shù)量；c：餅圖表示將圖a中富集的三級(jí)代謝通路歸類(lèi)于二級(jí)代謝通路；d：不同連作茬次中根際真菌營(yíng)養(yǎng)亞型相對(duì)豐度的差異分析

2.3 連作對(duì)西瓜根際細(xì)菌和真菌群落共生網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和關(guān)鍵物種的影響

基于OTU豐度矩陣進(jìn)行物種共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)分析并得到細(xì)菌總網(wǎng)絡(luò)和子網(wǎng)絡(luò)以及真菌總網(wǎng)絡(luò)和子網(wǎng)絡(luò)（圖4-a）（見(jiàn)方法2.4）。結(jié)果顯示，連作2茬與連作6茬的根際細(xì)菌和真菌網(wǎng)絡(luò)比對(duì)照具有更多的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)、平均度和種間相互作用，而模塊化指數(shù)隨著連作茬次增加而下降（表1）。變形菌門(mén)在3個(gè)連作茬次（對(duì)照組、連作2茬和連作6茬，分別占62.6%、63.4%和65.9%）的網(wǎng)絡(luò)互作關(guān)系中占主導(dǎo)地位，與其他物種相互聯(lián)系的數(shù)量最多（圖4-a）。這表明與對(duì)照相比，連作增加了網(wǎng)絡(luò)中變形菌門(mén)物種的比例。在真菌群落網(wǎng)絡(luò)中，子囊菌門(mén)在3個(gè)連作茬次中（對(duì)照組、連作2茬和連作6茬，分別占73.2%、70.7%和69.6%）的網(wǎng)絡(luò)互作關(guān)系中占主導(dǎo)地位，與其他物種相互聯(lián)系的數(shù)量最多（圖4-d）。這表明與對(duì)照相比，連作減少了網(wǎng)絡(luò)中子囊菌門(mén)物種的比例。此外，對(duì)照、連作2茬與連作6茬的真菌共生網(wǎng)絡(luò)中正相關(guān)連接數(shù)占比分別為41.33%、51.48%和55.30%（表1），表明在連作過(guò)程中根際真菌間趨于競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系而不是合作關(guān)系。

表1 不同連作茬次下西瓜根際細(xì)菌和真菌網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)

網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的結(jié)果顯示，在細(xì)菌群落中，雖然連作6茬的根際初始網(wǎng)絡(luò)自然連通性最高（0.0078），其次是連作2茬（0.0075）和對(duì)照網(wǎng)絡(luò)（0.0068），但是當(dāng)去除20%的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)時(shí)，連作6茬的自然連通性急劇降至0.0028；當(dāng)去除40%的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)時(shí)，連作2茬的自然連通性急劇降至0.0024（圖4-b）。隨著節(jié)點(diǎn)不斷被移除，對(duì)照網(wǎng)絡(luò)的連通度下降趨勢(shì)（Slope=-0.004）比連作2茬（Slope=-0.005）和連作6茬（Slope=-0.006）更加平穩(wěn)（圖4-b）。而真菌群落中，連作6茬的根際初始網(wǎng)絡(luò)自然連通性仍是最高（0.085），其次是對(duì)照組（0.023）和連作2茬（0.013）網(wǎng)絡(luò)，但是當(dāng)去除40%的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)時(shí)，連作6茬的自然連通性急劇降至0.0071，而連作2茬網(wǎng)絡(luò)隨著節(jié)點(diǎn)不斷被移除，其自然連通性下降趨勢(shì)（Slope=-0.011）比連作2茬（Slope=-0.021）和連作6茬（Slope=-0.077）更加平穩(wěn)（圖4-e）；對(duì)照網(wǎng)絡(luò)在去除20%的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)后，其自然連通性穩(wěn)定在一定水平（圖4-e）。這些結(jié)果表明在移除網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)后，對(duì)照的根際微生物網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)仍保持相對(duì)較高的穩(wěn)定性。

對(duì)照的細(xì)菌群落共擁有9個(gè)關(guān)鍵物種（圖4-c），網(wǎng)絡(luò)模塊中心（module hubs）主要來(lái)源于變形菌門(mén)和厚壁菌門(mén)，其中主要來(lái)自于假單胞菌屬（）、芽孢桿菌屬（）和鞘氨醇單胞菌屬（）等。對(duì)照的真菌群落共擁有1個(gè)關(guān)鍵物種（圖4-f），網(wǎng)絡(luò)模塊中心（module hubs）主要來(lái)源于子囊菌門(mén)的閉小囊菌屬（）。

2.4 連作對(duì)西瓜根際細(xì)菌和真菌群落構(gòu)建過(guò)程的影響

使用校正的隨機(jī)率（MST）定量生態(tài)過(guò)程中的隨機(jī)性和確定性。結(jié)果表明，在細(xì)菌群落中，隨機(jī)性過(guò)程在對(duì)照和連作6茬的細(xì)菌群落內(nèi)占主導(dǎo)，而在連作2茬的細(xì)菌群落中確定性過(guò)程占主導(dǎo)（圖5-A）；在真菌群落中，確定性過(guò)程在連作2茬和連作6茬中占主導(dǎo)（圖5-B）。

A：不同連作茬次下根際細(xì)菌群落的MST柱狀圖；B：不同連作茬次下根際真菌群落的MST柱狀圖。不同的字母表示不同處理間的顯著差異（P＜0.05）

3 討論

3.1 西瓜連作對(duì)根際土壤細(xì)菌和真菌群落組成和功能的影響

在本研究中，利用Illumina Miseq高通量技術(shù)分析了連作后西瓜根際土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)。我們發(fā)現(xiàn)隨著連作茬次的增加，細(xì)菌和真菌群落特征差異較大。這可能是由于在連作系統(tǒng)中，相同的田間管理模式、植物化感物質(zhì)的長(zhǎng)期累積以及同類(lèi)型根系分泌物長(zhǎng)期釋放的生態(tài)效應(yīng)，會(huì)使微生物區(qū)系發(fā)生顯著改變[13,29]。具體來(lái)說(shuō)，相比于對(duì)照，西瓜根際細(xì)菌群落的richness和shannon指數(shù)在連作2茬和6茬中表現(xiàn)出先下降后上升的趨勢(shì)，而chao1指數(shù)沒(méi)有顯著的變化，這與部分前人的研究結(jié)果一致[30-31]。多樣性指數(shù)出現(xiàn)下降的原因可能是在2茬的連作過(guò)程中肥料的添加會(huì)暫時(shí)的增加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，土壤中的部分物種對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的添加反應(yīng)迅速，進(jìn)而通過(guò)快速繁殖占領(lǐng)寡營(yíng)養(yǎng)微生物的生態(tài)位，導(dǎo)致微生物多樣性立即下降[32]。而連作6茬過(guò)程中，隨著養(yǎng)分長(zhǎng)期大量的積累，包括肥料的連續(xù)性投入和植物分泌物和殘?bào)w遺留，土壤中生態(tài)位會(huì)在一定程度上擴(kuò)張，會(huì)有更多的有機(jī)物質(zhì)和養(yǎng)分易被微生物利用，從而促進(jìn)了細(xì)菌的生長(zhǎng)，有利于根際土壤中細(xì)菌多樣性的提高。有研究表明，變形菌門(mén)和酸桿菌門(mén)在養(yǎng)分循環(huán)中起重要作用，并且也與抑制病害等功能相關(guān)[33-35]。其中鞘氨醇單胞菌屬（變形菌門(mén)）具有降解多環(huán)芳烴和降低纖維素的能力[36]，溶桿菌屬（變形菌門(mén)）對(duì)真菌、革蘭氏陰性細(xì)菌、革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和線(xiàn)蟲(chóng)都有突出的拮抗作用[37]。而本研究結(jié)果中，相對(duì)于對(duì)照，連作后的變形菌門(mén)和酸桿菌門(mén)的相對(duì)豐度都呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，而且鞘氨醇單胞菌屬和芽孢桿菌屬等的相對(duì)豐度降低，從而導(dǎo)致植物抵御病原菌感染的能力下降，并且這種降低也會(huì)增加發(fā)生土壤病害的風(fēng)險(xiǎn)。而連作后的真菌群落相比于對(duì)照，chao1、richness和shannon指數(shù)顯著降低，這與吳鳳芝等的研究結(jié)果相一致[38]。有研究指出，微生物多樣性的減少是發(fā)生土壤病害的重要原因[5]，而在本研究中真菌群落的多樣性指數(shù)在連作后顯著降低，可能增加發(fā)生土壤病害的風(fēng)險(xiǎn)。在真菌群落中，有研究表明鐮刀菌屬（子囊菌門(mén)）為致病菌，會(huì)引起西瓜、黃瓜枯萎病的發(fā)生[39-40]，而本研究結(jié)果顯示出鐮刀菌屬的相對(duì)豐度在連作6茬后顯著增加。在CHEN等[41]的研究中得出，真菌病原體的增加和有益真菌的減少可能是導(dǎo)致連作植物生長(zhǎng)和產(chǎn)量下降的重要因素。因此，連作會(huì)改變微生物群落多樣性和組成，破壞根際生態(tài)平衡，從而更加容易引起連作障礙。

我們利用PICRUSt2對(duì)不同連作茬次下根際細(xì)菌群落進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)根際細(xì)菌群落積極參與了基本的代謝過(guò)程。其中碳水化合物代謝途徑與固氮、溶磷等作用有著密切的關(guān)聯(lián)，而且該途徑的產(chǎn)物為其他物質(zhì)的合成提供了原料[42]；有害物質(zhì)的生物降解和代謝途徑包括了苯甲酸降解、多環(huán)芳烴降解和二甲苯降解途徑，這些途徑與植物抗逆能力密切相關(guān)；氨基酸代謝與脫氨和轉(zhuǎn)氨等作用息息相關(guān)，并且主要參與了植物氮素循環(huán)[43]。而本研究的結(jié)果表明，連作會(huì)減少根際細(xì)菌對(duì)碳源的利用、有害物質(zhì)的降解及次生代謝物的合成代謝途徑。尤其是相比于對(duì)照，連作6茬后的根際細(xì)菌氨基酸代謝相對(duì)豐度顯著降低，這可能表明連作后根際環(huán)境不利于細(xì)菌的繁殖、代謝和合成物質(zhì)，并且土壤養(yǎng)分循環(huán)可能受到一定程度的抑制。因此，在連作下，一些比較重要的代謝功能（如，碳水化合物代謝途徑，有害物質(zhì)的降解和次生代謝物的合成代謝途徑）的減少或者喪失會(huì)是形成連作障礙的主要原因之一[44]。此外，我們利用FUNGuild來(lái)確定真菌分類(lèi)群的營(yíng)養(yǎng)模式。結(jié)果顯示，相比于對(duì)照，連作6茬會(huì)顯著增加病原真菌，這種真菌會(huì)通過(guò)損害宿主細(xì)胞而獲取營(yíng)養(yǎng)[45]，并且營(yíng)養(yǎng)亞型中植物病原體（如鐮刀菌屬）的相對(duì)豐度也會(huì)顯著增加，這些也可能是引起連作障礙的主要原因之一。

3.2 西瓜連作對(duì)根際土壤細(xì)菌和真菌群落網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的影響

物種間相互作用是影響土壤病害的發(fā)生一種重要的生物因素，在群落構(gòu)建過(guò)程中發(fā)揮重要作用[46]，與關(guān)鍵生態(tài)過(guò)程和宿主健康密切相關(guān)[47]。本研究結(jié)果表明，多茬次的連作使細(xì)菌和真菌群落產(chǎn)生更復(fù)雜的潛在相互作用，這可能是因?yàn)橹参餁報(bào)w量的增加，以及前茬作物產(chǎn)生的各種分泌物和遺傳效應(yīng)影響土壤微生物群落[48]。對(duì)照的網(wǎng)絡(luò)直徑和模塊化均大于連作2茬和連作6茬，并且有研究指出具有更高模塊化的微生物網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更能抵抗環(huán)境干擾[44,49]。因此，連作會(huì)導(dǎo)致根際微生物對(duì)環(huán)境變化的抵抗力減弱，容易引起連作障礙的發(fā)生。另外，本研究結(jié)果表明，在去除一定比例的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)后，連作6茬的網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定性指數(shù)急劇下降，表明連作使西瓜根際網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加脆弱。因此，連作時(shí)長(zhǎng)可能是影響根際網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素。

網(wǎng)絡(luò)中潛在的關(guān)鍵物種在維持多物種共存和生態(tài)系統(tǒng)功能方面可能至關(guān)重要[50-51]。我們觀察到，在對(duì)照的西瓜根際微生物網(wǎng)絡(luò)中，關(guān)鍵類(lèi)群有芽孢桿菌屬（）、鞘氨醇菌屬（）、劍菌屬（）和鞘氨醇單胞菌（）等菌屬。據(jù)報(bào)道芽孢桿菌屬具有分解土壤中有機(jī)物的能力，如纖維素和木質(zhì)素[52]；鞘氨醇單胞菌屬的成員具有降解復(fù)雜有機(jī)物質(zhì)、拮抗植物病原真菌以及分泌胞外多糖等多種生態(tài)功能[53]；鞘氨醇菌屬能降解多環(huán)芳烴或酚類(lèi)有機(jī)物[54]，適應(yīng)環(huán)境能力強(qiáng)[55]；劍菌屬能夠作為有益菌接種至土壤中促進(jìn)植物的生長(zhǎng)[56]，有助于維持植物激素平衡、控制根系發(fā)育、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)獲取以及預(yù)防宿主植物疾病[57]。而在連作6茬后這些關(guān)鍵類(lèi)群的相對(duì)豐度相比于對(duì)照發(fā)生了明顯的減少，因此連作土壤病害的發(fā)生可能是由于關(guān)鍵類(lèi)群的減少或者缺失。

3.3 西瓜連作對(duì)根際土壤細(xì)菌和真菌群落組裝的影響

為了更好地了解微生物群落組成如何響應(yīng)環(huán)境變化，我們探究了西瓜根際微生物群落組裝的生態(tài)過(guò)程。在本研究中，當(dāng)短期連作時(shí)（連作2茬），一些非生物環(huán)境因素（如pH、鹽度、有機(jī)碳含量）的選擇（環(huán)境過(guò)濾和物種間相互的拮抗與協(xié)同作用）會(huì)使細(xì)菌群落構(gòu)建過(guò)程從隨機(jī)性轉(zhuǎn)變?yōu)榇_定性[20]；但在較長(zhǎng)連作茬次下，細(xì)菌種群更容易受到隨機(jī)性事件的影響，這可以用體型-可塑性假說(shuō)來(lái)解釋[58]，即較小的生物更可能受到擴(kuò)散限制而不是物種分類(lèi)的影響，因?yàn)檩^小的生物（如，細(xì)菌類(lèi)群）具有更大的代謝可塑性和更大的環(huán)境耐受性，因此可以生活在不同的棲息地[59]；相對(duì)于真菌的生活史策略而言，細(xì)菌類(lèi)群的生存策略更加傾向于r策略，且在長(zhǎng)期連作下，養(yǎng)分較為充足，細(xì)菌的生長(zhǎng)沒(méi)有受到環(huán)境的限制，趨向于隨機(jī)性過(guò)程。而在真菌群落中，隨機(jī)性過(guò)程在對(duì)照中更為突出，但連作后逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榇_定性過(guò)程。這可能是一些環(huán)境變量對(duì)根際微生物群落的組裝的潛在影響，如植物分泌物和殘?bào)w的增加、土壤理化性質(zhì)的變化等。環(huán)境因素的差異也可能隨著連作茬次的增加而增加，并在根際微生物群落構(gòu)建中發(fā)揮關(guān)鍵作用[60]。值得注意的是，當(dāng)?shù)丨h(huán)境的變化逐漸增加了真菌群落的確定性選擇的重要性，而細(xì)菌群落的隨機(jī)性卻占主導(dǎo)，這可能是因?yàn)殚L(zhǎng)期連作引起環(huán)境變化是由真菌性病害引起的（即由尖孢鐮刀菌引起的西瓜枯萎?。参锟赡軙?huì)向環(huán)境釋放特定的次生物質(zhì)來(lái)招募更多的病原性真菌[12-14]，真菌群落因此會(huì)受到更強(qiáng)的環(huán)境選擇。同時(shí)細(xì)菌和真菌群落的MST值也呈現(xiàn)先降低后增大的趨勢(shì)，表明隨機(jī)性和確定性過(guò)程共同調(diào)控著連作環(huán)境下根際微生物群落的構(gòu)建。

4 結(jié)論

多茬次的連作顯著影響了西瓜根際細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)，包括有益菌屬的相對(duì)豐度減少和致病菌屬的相對(duì)豐度增加，也會(huì)導(dǎo)致微生物群落網(wǎng)絡(luò)的相互作用更加復(fù)雜，但群落穩(wěn)定性和對(duì)環(huán)境變化的抵抗性減弱。此外，細(xì)菌群落功能組成發(fā)生顯著變化，包括有害物質(zhì)的生物降解和代謝，氨基酸的代謝等功能基因相對(duì)豐度在長(zhǎng)期連作后降低；而真菌群落中病原真菌的相對(duì)豐度在連作6茬后顯著增多。多茬次的連作也會(huì)使微生物群落組裝的機(jī)制發(fā)生變化，隨機(jī)性和確定性過(guò)程共同調(diào)控著連作環(huán)境下根際微生物群落的構(gòu)建。因此，在實(shí)際生產(chǎn)中，應(yīng)注意通過(guò)輪作或施用微生物肥料來(lái)維持西瓜根際土壤微生態(tài)的穩(wěn)定，以緩解連作障礙。本研究結(jié)果為理解連作與微生物群落結(jié)構(gòu)差異的關(guān)系提供了新視角，并揭示了長(zhǎng)期連作下微生物群落構(gòu)建過(guò)程和潛在機(jī)制，同時(shí)為開(kāi)發(fā)微生物肥料進(jìn)行土壤改良，進(jìn)而緩解連作障礙提供理論依據(jù)。

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Characteristics and Succession of Rhizosphere Soil Microbial Communities in Continuous Cropping Watermelon

GUO HanYue1, WANG DongSheng2, RUAN Yang1, QIAO YiZhu1, ZHANG YunTao1, LI Ling1, HUANG QiWei1, GUO ShiWei1, LING Ning1, SHEN QiRong1

1College of Resources and Environment Science, Nanjing Agricultural University/Key Laboratory of Organic-based Fertilizers of China/Jiangsu Provincial Key Laboratory for Solid Organic Waste Utilization, Nanjing 210095;2Nanjing Institute of Vegetable Science, Nanjing 210042

【Objective】The aim of this study was to investigate the effects of continuous cropping on the construction and potential functions of bacterial and fungal communities in the rhizosphere soil of watermelon, and to clarify the adaptability of rhizosphere microorganisms to environmental changes, so as to provide a theoretical basis for ecological control of watermelon continuous cropping obstacles and healthy maintenance of farmland. 【Method】In this study, the rhizosphere soil of watermelon without continuous cropping (CK), continuous cropping for 2 times and continuous cropping for 6 times was used as the research object. 16S rRNA and ITS high-throughput sequencing were used to analyze the effects of continuous cropping on the bacterial and fungal communities of rhizosphere soil of watermelon. 【Result】With the increasing continuous cropping times, the bacterial diversity index in the rhizosphere soil of watermelon showed a trend of first decreasing and then increasing, while the fungal diversity index decreased significantly. At the bacterial genus level, multiple times of continuous cropping decreased the relative abundance ofandin watermelon rhizosphere soil; at the fungal genus level, the relative abundance ofincreased with the continuous cropping times. Compared with CK, the network complexity of continuous cropping was higher, but the stability of network structure was lower. In addition, compared with CK, the relative abundance of biodegradation pathways of harmful substances and metabolic pathways of amino acids could be significantly reduced after continuous cropping for 6 times; the relative abundance of pathogenic fungi significantly increased in the fungal community after continuous cropping for 6 times. During community succession, the stochastic processes dominated rhizosphere bacterial community construction in watermelon under continuous cropping, while the deterministic processes dominated rhizosphere fungal community construction in watermelon. 【Conclusion】Continuous cropping caused changes in community characteristics, functional composition and succession process of rhizosphere bacteria and fungi. The decrease of key functions of bacterial community, the increase of pathologic fungi and the decrease of stability of microbial community network might be the important factors leading to occurrence of watermelon continuous cropping obstacles.

watermelon; continuous cropping soil; rhizosphere microbial community; function prediction; community succession

2022-11-19；

2023-01-09

國(guó)家自然科學(xué)基金（31972506）

郭晗玥，E-mail：2020103110@stu.njau.edu.cn。通信作者凌寧，E-mail：nling@njau.edu.cn

（責(zé)任編輯 李云霞）