何蕾，郭錦晨，韓輝，宋宇琪，夏澤華，李子龍

1 安徽中醫(yī)藥大學(xué) 安徽合肥 230038

2 新安醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室 安徽合肥 230038

3 安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 安徽合肥 230031

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）又稱老年性癡呆，以認知功能惡化和行為改變?yōu)橹饕R床特征的神經(jīng)退行性疾病，影響全球近5000 多萬人，是導(dǎo)致死亡的第五大原因[1]。目前治療AD 的策略集中在緩解癥狀上，常以膽堿能和谷氨酸能神經(jīng)傳遞為靶向改善癥狀，但無法解決神經(jīng)退化的根本問題[2]。隨著人口老齡化的深入，AD 的潛在患者愈發(fā)增多，給家庭及社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔(dān)[3]，因此尋找行之有效并且相對價廉的治療方法迫在眉睫[4]。研究顯示，中醫(yī)藥在治療AD 上具有一定優(yōu)勢，且不良反應(yīng)少[5]。補腎生髓法是中醫(yī)治療AD 的經(jīng)典治法之一，龜鹿二仙膠作為補腎生髓法的代表方劑，可以有效改善AD 的癥狀，但由于龜鹿二仙膠成分較復(fù)雜，其治療AD 的具體作用機制仍缺乏有力證據(jù)證明。而隨著AD 機制研究的深入，越來越多證據(jù)顯示氧化應(yīng)激是AD 形成與發(fā)展的重要機制之一，然筆者在綜述龜鹿二仙膠治療AD 的進展情況時尚未發(fā)現(xiàn)龜鹿二仙膠改善AD 氧化應(yīng)激指標及影響相關(guān)蛋白表達等研究。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與中醫(yī)整體觀念具有共通性，可以預(yù)測草藥中存在的化合物的多個靶點與特定疾病相關(guān)的多個基因之間的相互作用，是研究中藥藥理的方法之一[6]。分子對接可以通過評估網(wǎng)絡(luò)中組分與靶點的結(jié)合能來揭示網(wǎng)絡(luò)中組分與靶點之間的相互作用，提高網(wǎng)絡(luò)的準確性[7]。筆者試用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)分析龜鹿二仙膠干預(yù)AD 氧化應(yīng)激的機制，以期為未來研究龜鹿二仙膠治療AD 的作用機制提供參考。

龜鹿二仙膠治療AD 的研究進展

1 補腎生髓法治療AD 的中樞機制研究概況

中醫(yī)學(xué)認為腎虛是AD 發(fā)病的重要原因[8]，人體腦部思維活動及意識形態(tài)等皆可能與腎精關(guān)系密切[9]，正如唐容川《中西匯通醫(yī)經(jīng)精義·五臟所藏》所言：“事物之所以不忘，賴此記性，記在何處，則在腎精”。《靈樞·海論》指出“腦為髓之?！?，惟有髓海充足時腦絡(luò)才能得到充分滋養(yǎng)。補腎生髓法是中醫(yī)治療AD 的經(jīng)典治法之一，腎為先天之本，可藏精生髓，而髓由精化，故腎精充盈，則腦髓充滿，髓生則益腦充腦，從而達到改善AD 癥狀的作用。研究發(fā)現(xiàn)，補腎生髓法治療AD的作用機制包括通過各種信號通路調(diào)節(jié)突觸蛋白的表達[10-11]、減弱神經(jīng)炎性反應(yīng)[12]、抗氧化應(yīng)激[13-14]、營養(yǎng)大腦神經(jīng)、改善大腦代謝[15]以及改善腦部血液循環(huán)[16-18]。從現(xiàn)代藥理學(xué)、生物學(xué)等角度詮釋了“腎生髓，腦為髓?！钡闹嗅t(yī)理論。

2 龜鹿二仙膠治療AD 的藥理作用研究進展

補腎生髓法的代表方劑龜鹿二仙膠出自于明代王三才的《醫(yī)便》，由龜板膠、鹿角膠、枸杞子、人參4味中藥組成，方中以血肉有情之品龜板膠及鹿角膠陰陽雙補并為君藥，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)二膠含有大量蛋白質(zhì)、多種氨基酸以及各種微量元素等多種化學(xué)成分，具有顯著補腦、調(diào)節(jié)代謝、延緩衰老等多重作用[19-20]，配合人參、枸杞子益氣養(yǎng)陰，健脾補血，助君藥滋補肝腎精血?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，人參具有抗衰老[21-22]、益智[23-24]、增強學(xué)習(xí)記憶能力[25-26]等作用，可通過影響突觸功能可塑性及神經(jīng)發(fā)生、β 淀粉樣蛋白水平、線粒體功能及氧化應(yīng)激、Tau 蛋白神經(jīng)毒纏結(jié)、神經(jīng)炎癥過程等多個途徑減輕AD 患者癥狀[27]；枸杞具有抗氧化[28-29]、抗衰老[30-31]、神經(jīng)保護[32-33]等作用，其提取物可顯著降低皮層神經(jīng)元中Aβ 寡聚體水平及Aβ 誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性，從而改善AD 程度[34]。

龜鹿二仙膠具有補血、抗疲勞、抗氧化、抗衰老、增強免疫、保護中樞神經(jīng)系統(tǒng)等作用，能夠改善AD 患者炎癥指標、腦部血液循環(huán)[16-18]。此外，在治療其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病中龜鹿二仙膠亦顯示出良好效果，如其可改善帕金森病患者睡眠質(zhì)量[35-36]；通過影響下丘腦-垂體-腎上腺軸的功能，龜鹿二仙膠可調(diào)節(jié)創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙模型大鼠的行為學(xué)異常[37-38]。

3 龜鹿二仙膠治療AD 的臨床實驗研究情況

研究表明[39-41]，龜鹿二仙膠與常規(guī)西藥相比對AD 癥狀改善更加顯著。然而關(guān)于其作用機制的研究較少，目前主要從改善腦血流、消除Aβ 沉積和tau 蛋白入手。

經(jīng) 顱 多 普 勒 超 聲（Transcranial Doppler Ultrasound，TCD）作為一種新型超聲檢查技術(shù)，可以直接獲得患者血流速度、阻力等血流動力學(xué)指標，故可用于監(jiān)測AD 腦血液循環(huán)[42]。馬俊杰團隊[16]引入TCD 監(jiān)測龜鹿二仙膠對患者腦部血液循環(huán)的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果顯示該方對腦血管TCD 各參數(shù)指標皆有顯著改善作用，且治療組結(jié)果優(yōu)于安理申組，說明龜鹿二仙膠補腎生髓與改善腦部血液循環(huán)之間可能存在邏輯關(guān)系。在此基礎(chǔ)上，該團隊運用MRI 進一步觀察龜鹿二仙膠對血管周圍間隙（Perivascular Spaces，PVS）、Virchow-Robin 腔（VRS）數(shù)目及直徑的影響[17-18]。結(jié)果顯示運用龜鹿二仙膠治療第31 天無明顯改善，第61 天與治療前及對照組比較PVS、VRS 的數(shù)目無變化，而直徑顯著縮小。PVS 以及VRS 的分布與血管走行一致，可協(xié)助AD 腦部相關(guān)代謝產(chǎn)物β-淀粉樣蛋白（Aβ）及Tau 蛋白等的循環(huán)及清除[43]。此外，該團隊發(fā)現(xiàn)龜鹿二仙膠亦可改善TNF-α、IL-6及IL-1 等炎性因子水平。

近年來，越來越多的證據(jù)表明，氧化應(yīng)激可能是導(dǎo)致認知衰老和AD 的關(guān)鍵機制之一[44]。氧化應(yīng)激可通過促進Aβ 沉積、tau 蛋白過度磷酸化以及突觸和神經(jīng)元的丟失參與了AD 的發(fā)展[45]。改善氧化應(yīng)激可以明顯改善AD[46]。已有研究顯示補腎生髓法可以改善AD 的氧化應(yīng)激相關(guān)指標[47-48]，但筆者尚未發(fā)現(xiàn)龜鹿二仙膠干預(yù)AD 氧化應(yīng)激機制的研究，故試從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接探討其發(fā)生機制，以供臨床進一步研究。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接分析

1 龜鹿二仙膠化學(xué)成分及相關(guān)靶點的獲取及篩選

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫及分析平臺TCMSP（http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/ tcmsp.php）檢索人參、枸杞子的化學(xué)成分，因檢測不到龜板和鹿角膠的化學(xué)成分，故于BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）、Herb 數(shù)據(jù)庫（http：//herb.ac.cn/）中檢索，并基于口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18 進行篩選，但龜板和鹿角膠含有的化合物大多不符合篩選標準，因此結(jié)合相關(guān)文獻納入數(shù)據(jù)庫未收納的化學(xué)成分[49-51]，最終確定其活性成分。將活性成分輸入TCMSP 和Drug Bank 數(shù)據(jù)庫以查詢與之對應(yīng)的靶標蛋白，再將靶標蛋白輸入UnitProt 數(shù)據(jù)庫（https：//www. uniprot. org/）以查詢其對應(yīng)的基因名稱。共得到96 個化學(xué)成分，其中人參22 個，枸杞子45 個，龜板17 個，鹿角12 個。篩去無對應(yīng)靶點的成分，最終去除重復(fù)值后共獲得龜鹿二仙膠67 個潛在的有效成分，靶點79 個。

2 AD 氧化應(yīng)激靶點篩選

分 別 以“Alzheimer’s disease”“Oxidative stress”為關(guān)鍵詞在GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）收集相關(guān)靶點并取交集，得到AD 氧化應(yīng)激的相關(guān)靶標信息。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，阿爾茨海默病及氧化應(yīng)激靶點在Genecards 數(shù)據(jù)庫中分別找到相關(guān)靶點11501、9629 個。將AD 氧化應(yīng)激的靶點導(dǎo)入Venny2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）作圖，共有交集靶點6100 個，見圖1。

圖1 AD 與氧化應(yīng)激共同靶點Venn 圖

3 龜鹿二仙膠-AD 氧化應(yīng)激的靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化

利用Venny2.1.0 導(dǎo)入AD 與氧化應(yīng)激的交集，再導(dǎo)入龜鹿二仙膠相關(guān)靶點，得到疾病與藥材共有靶點。使用Cytoscape3.9.1 軟件進行龜鹿二仙膠干預(yù)AD 氧化應(yīng)激的“活性成分-交集靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)可視化分析。疾病與藥材交集68 個，見圖2。將成分-靶點、疾病-靶點關(guān)系表導(dǎo)入Cytoscape3.9.1 中，選出核心靶點構(gòu)建成分-交集靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)，見圖3。

圖2 龜鹿二仙膠與AD 氧化應(yīng)激共同靶點Venn 圖

圖3 龜鹿二仙膠有效成分與AD 氧化應(yīng)激的成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

3.1 龜鹿二仙膠干預(yù)AD 氧化應(yīng)激的蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 在String 在線平臺數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）上傳2.1.3 篩選得到的藥物與疾病的交集靶點，在項目欄中選擇研究物種為“Homo sapiens”，設(shè)置交互得分＞0.4，其余參數(shù)均保持默認，進行蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）分析，并導(dǎo)出PPI 網(wǎng)絡(luò)（見圖4）及TSV 文件。運用Cytoscape軟件中的CytoNCA 插件從導(dǎo)入的TSV 文件中利用Degree 大小篩選龜鹿二仙膠干預(yù)AD 氧化應(yīng)激的關(guān)鍵靶蛋白，篩選過程及結(jié)果見圖4，度值最高的主要包括IL6、PPARG、CASP3、ESR1、RELA 等。

圖4 龜鹿二仙膠干預(yù)AD 氧化應(yīng)激的PPI 網(wǎng)絡(luò)

3.2 龜鹿二仙膠干預(yù)AD 氧化應(yīng)激的PPI 網(wǎng)絡(luò)聚類可視化 將龜鹿二仙膠與AD 的交集靶點導(dǎo)入Cytoscape 軟件，應(yīng)用MCODE 插件進行聚類分析。結(jié)果顯示，龜鹿二仙膠干預(yù)AD 氧化應(yīng)激的相關(guān)靶點主要有3 個聚類簇，聚類網(wǎng)絡(luò)圖根據(jù)評分的高低分別導(dǎo)出，可視化結(jié)果見圖5（A-C）。

圖5 龜鹿二仙膠干預(yù)AD 氧化應(yīng)激的關(guān)鍵靶點聚類圖

4 GO 功能分析及KEGG 通路富集分析

將龜鹿二仙膠的有效作用靶點上傳至David 數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/），限定人源，通過基因功能（gene ontology，GO）分析結(jié)果獲取靶點主要作用過程信息。最終得到GO 條目304 條，包括生物過程（biological process，BP）203 條，細胞組成（cellular component，CC）43 條，分子功能（molecular function，MF）58 條，生物過程中排名靠前的有細胞內(nèi)類固醇激素受體信號通路、乙醇反應(yīng)、藥物反應(yīng)等；細胞組成分析中靠前的主要是突觸前膜的組成成分、線粒體、突觸后膜的組成成分、軸突末端等；分子功能分析靠前的主要是RNA 聚合酶II 轉(zhuǎn)錄因子活性，配體激活的序列特異性DNA 結(jié)合、類固醇結(jié)合、酶結(jié)合等。將BP、CC、MF 排名前10 的條目導(dǎo)入微生信網(wǎng)站（http：//www.bioinformatics.com.cn/）獲得GO 富集分析柱狀圖，見圖6。

圖6 龜鹿二仙膠干預(yù)AD 氧化應(yīng)激的GO 富集分析柱狀圖

同樣在David 數(shù)據(jù)庫中90 條獲取KEGG 通路信息，富集分析結(jié)果比較靠前的主要是脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、化學(xué)致癌作用-受體活化、癌癥通路、腫瘤壞死因子信號通路等。將富集結(jié)果導(dǎo)入微生信網(wǎng)站（http：//www.bioinformatics.com.cn/），對排名前20 位的結(jié)果繪制氣泡圖（見圖7）。

5 活性成分與關(guān)鍵靶點的分子對接分析

使用TCMSP 數(shù)據(jù)庫獲取龜鹿二仙膠活性成分的2D 結(jié)構(gòu)，利用AutoDock Tools 1.5.7 軟件優(yōu)化小分子結(jié)構(gòu)、添加極性氫原子，使其還原為最低能量形式，更貼近對接時的狀態(tài)。使用RSCB PDB 數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org/pdb/home/home.do）獲取關(guān)鍵靶點的三維結(jié)構(gòu)，應(yīng)用PyMOL 2.3.0 軟件對關(guān)鍵靶點進行預(yù)處理，包括去除水分子和原有配體。應(yīng)用AutoDock Vina 1.2.0 軟件將處理好的成分配體與靶點蛋白進行分子對接操作，最后對對接結(jié)果進行可視化分析（圖8）。

圖8 龜鹿二仙膠核心成分與疾病關(guān)鍵靶點的分子對接示意圖

選取網(wǎng)絡(luò)圖中度值排名靠前的3 個核心靶點IL6、PPARG、CASP3 以及排名前三的小分子山柰酚、β-谷甾醇和豆甾醇，結(jié)合能均＜-5.0（見表1）。

表1 核心靶點與主要成分的結(jié)合能

討 論

本文綜述了龜鹿二仙膠治療AD 的研究進展，發(fā)現(xiàn)龜鹿二仙膠的藥理研究和臨床應(yīng)用較少，在治療AD 上目前主要研究了其腦代謝與腦血流機制。氧化應(yīng)激途徑是AD 的重要發(fā)病機制之一，已有實驗表明補腎生髓法可以改善AD 患者氧化應(yīng)激指標，然而尚未有補腎生髓代表方龜鹿二仙膠干預(yù)AD 氧化應(yīng)激的相關(guān)研究。故本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)探究其干預(yù)AD 氧化應(yīng)激的具體作用機制。

研究結(jié)果顯示，龜鹿二仙膠干預(yù)AD 氧化應(yīng)激的核心化學(xué)成分包括山柰酚、β-谷甾醇和豆甾醇，這與目前有關(guān)研究結(jié)果一致。山柰酚具有抗氧化[52]、保護大腦[53]等作用，可降低脂質(zhì)過氧化和增加腦中的內(nèi)源性抗氧化酶[54]，可通過抑制細胞凋亡保護腦細胞[55]，調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB 等通路表達發(fā)揮神經(jīng)保護作用[56]，誘導(dǎo)細胞自噬發(fā)揮對多巴胺能神經(jīng)元的保護作用[57]。山奈酚可通過減輕氧化應(yīng)激和炎癥，降低aβ 誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性，調(diào)節(jié)膽堿能系統(tǒng)等途徑改善AD認知障礙[58-59]。β-谷甾醇可干擾多種細胞信號通路，包括細胞周期、凋亡、增殖、抗氧化、血管生成等，且無明顯毒性[60]。Ayaz 等人[61]對β-谷甾醇進行了體外、體內(nèi)、行為和分子對接研究，研究顯示，β-谷甾醇具有強大的抗膽堿酯酶和抗氧化潛能，能充分到達大腦并抑制參與膽堿酯酶代謝的酶，并起到自由基清除劑的作用，而在SWM、y-迷宮和平衡木測試中發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇可以改善認知缺陷，短期記憶和運動障礙，可用于治療AD 記憶缺陷障礙。豆甾醇具有抗氧化、抗炎癥、抗腫瘤、保護精神狀況等作用[62]，Yadav 等人[63]對氯胺酮誘導(dǎo)的小鼠精神病模型進行行為學(xué)研究及生化檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)豆甾醇可以改善模型小鼠的自發(fā)活動、刻板行為等行為表現(xiàn)，增加γ-氨基丁酸、谷胱甘肽水平，減少多巴胺、丙二醛、TNF-α 水平并降低乙酰膽堿酯酶的活性，顯示了其在治療精神病癥狀方面的潛在作用。

PPI 網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示IL6、PPARG、CASP3 為PPI 網(wǎng)絡(luò)中度值排名前3 的靶點，提示其可能是龜鹿二仙膠干預(yù)AD 氧化應(yīng)激的核心靶點。IL-6 是參與調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)免疫應(yīng)答和炎性反應(yīng)的重要細胞因子之一，可促進單核細胞產(chǎn)生多種炎性細胞因子，作用于多種神經(jīng)系統(tǒng)的靶細胞[64]。AD 患者大腦中Aβ 沉積會引起一些免疫分子參與炎性反應(yīng)，使IL6 等炎性因子水平增加，同時IL-6 的增加也可促進Aβ 的積累，破壞神經(jīng)完整性[65]。此外，IL-6 還可通過影響下游信號通路炎性因子的表達，加劇氧化應(yīng)激對腦組織的損害，導(dǎo)致神經(jīng)元萎縮凋亡[66]。PPARG 主要在脂肪、肌肉以及神經(jīng)系統(tǒng)中表達，可調(diào)控與脂肪代謝相關(guān)的轉(zhuǎn)運蛋白和脂肪酶的表達[67]，介導(dǎo)抗血管生成過程[68]，在控制炎癥、改善動脈粥樣硬化和調(diào)節(jié)免疫過程中發(fā)揮重要作用[69]。研究顯示[70]，PPARG 激動劑可改善AD 動物模型的認知行為，可能是治療AD 的一種有潛力的方法。CASP3 為細胞凋亡途徑中最關(guān)鍵的酶，大量研究證實CASP3 介導(dǎo)的淀粉樣前體蛋白切割是AD中淀粉樣變和神經(jīng)元細胞死亡的潛在機制[71]。

本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接的角度闡釋了龜鹿二仙膠干預(yù)AD 氧化應(yīng)激的機制是多成分-多通路-多靶點的網(wǎng)狀復(fù)合協(xié)同作用的結(jié)果，而得出的核心成分、靶點及通路為進一步探討其發(fā)揮效用的活性成分的物質(zhì)基礎(chǔ)和具體作用機制研究提供了方向，后續(xù)尚需系統(tǒng)的體內(nèi)外實驗以及具體的靶點驗證進一步證實龜鹿二仙膠干預(yù)AD 氧化應(yīng)激作用的網(wǎng)狀內(nèi)在聯(lián)系及具體準確的靶向機制。