黃淑燕, 江龍

福建林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建 南平 353000

雷公藤（Tripterygium wilfordiiHook.f.），衛(wèi)矛科（Celastraceae）雷公藤屬（Tripterygium），又稱黃藤根、黃臘藤、水莽草、紅藥、斷腸草、菜蟲藥等，多年生落葉蔓性灌木[1]。植物體內(nèi)的碳素營養(yǎng)狀況常以糖含量作為重要的指標(biāo)，可溶性糖是植物光合作用的主要產(chǎn)物，在植物細(xì)胞內(nèi)作為一種能源消耗及儲藏物質(zhì)，屬于非結(jié)構(gòu)性碳水化合物，參與著多種代謝活動，為代謝活躍的胚性細(xì)胞提供充足的能源[2,3]?？扇苄蕴侵械恼崽鞘侵参镉袡C(jī)物運輸、貯藏及積累的主要形式[4]，其代謝含量的變化反映了植物細(xì)胞對碳源及能源的吸收和利用情況。組織培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基中可溶性糖的消耗與植物種類、培養(yǎng)體系及所處生長狀態(tài)狀況密切相關(guān)，含量因生長階段的不同而有所差異[5]。相關(guān)研究表明，碳水化合物中的可溶性糖類，可為大量植物不定根的形成提供必需的營養(yǎng)物質(zhì)[6]，是生根過程不可或缺的。目前，研究證明糖在細(xì)胞內(nèi)是以一種信號分子存在的，其在植物的生長發(fā)育等許多過程中均發(fā)揮著調(diào)控的作用，其還可以作為細(xì)胞內(nèi)許多基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因子。因此，對植物組織培養(yǎng)各階段的可溶性糖含量的測定，可為今后的研究工作提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

雷公藤組織培養(yǎng)無菌外植體:即雷公藤外植體置于事先配制好的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至0、7、14、21、28、35 d時，取不同培養(yǎng)時期的外植體進(jìn)行重復(fù)3次的可溶性糖含量測定。

1.2 試驗方法

2011年8月，采用蒽酮法作為可溶性糖含量測定的方法[10]，樣品溶液測定方法見表1。

表1 樣品溶液制定方法Tab. 1 Methods for preparing sample solution

表2 組織培養(yǎng)各階段培養(yǎng)基配方Tab. 2 Culture medium formula in different stages of tissue culture

表3 不同碳源對可溶性糖含量影響培養(yǎng)基配方Tab. 3 Effects of different carbon sources on soluble sugar content in culture medium formula

說明：1. 溫度控制在100℃；2. 從100℃開始準(zhǔn)確計時20 min，然后迅速冷卻，于室溫中平衡10 min；3. 蒽酮注意避光保存，當(dāng)天配制當(dāng)天使用；4. 試管干燥清潔；5. 在冰浴條件下加入蒽酮，生成的顏色較穩(wěn)定，在4 h內(nèi)無明顯變化；6. 每個試驗重復(fù)3次[10]。

1.3 試驗方案

以雷公藤組織培養(yǎng)各過程最佳配方對無菌外植體進(jìn)行培養(yǎng)，每培養(yǎng)7 d，測定各處理可溶性糖含量變化，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)公式計算出可溶性糖含量值。經(jīng)過35 d的6次測定后，對結(jié)果進(jìn)行分析對比，探討可溶性糖含量的變化。

1.3.1 組織培養(yǎng)各階段培養(yǎng)基配方

基本培養(yǎng)基為：MS+蔗糖∶30 g·L-1+瓊脂∶8 g·L-1；pH=5.8；處理號Hy、Hyy、Hyz、Hld、Hzc、Hbd對應(yīng)組織培養(yǎng)階段中芽體誘導(dǎo)、愈傷組織誘導(dǎo)芽、芽體增殖培養(yǎng)、壯苗培養(yǎng)、1號生根培養(yǎng)和2號生根培養(yǎng)的培養(yǎng)階段。

1.3.2 生根培養(yǎng)階段不同碳源配方

基本培養(yǎng)基為：1/2 MS+瓊脂8 g·L-1；碳源：蔗糖、葡萄糖；pH值5.8；激素：NAA、KT。根據(jù)試驗需要，建立6種培養(yǎng)基組合方式，對比可溶性糖含量變化，以處理號Z1、Z2、Z3、P1、P2、P3表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同組織培養(yǎng)階段外植體可溶性糖含量變化

雷公藤芽誘導(dǎo)分化階段，對培養(yǎng)0、7、14、21、28、35 d的外植體進(jìn)行可溶性糖含量測定。據(jù)圖1顯示，當(dāng)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)至第7 d時，可溶性糖含量上升，表明此時外植體正儲備營養(yǎng)物質(zhì)來滿足芽體誘導(dǎo)；第14 d時，含量最低，表明在7～14 d時間段內(nèi)，已完成芽體誘導(dǎo)過程；在第21 d出現(xiàn)第二次峰值表明此時外植體的分化增值需要大量營養(yǎng)物質(zhì)。在14～21 d期間，外植體通過光合作用及培養(yǎng)基中的糖含量為可溶性糖合成提供一定基礎(chǔ)，因而，第21 d出現(xiàn)峰值要高于第7d含量。第21～35 d期間，可溶性糖含量呈下降的趨勢，表明此期間芽體營養(yǎng)和增粗生長同步進(jìn)行。

圖1 不同組織培養(yǎng)階段可溶性糖含量變化曲線圖Fig. 1 Variation curve of soluble sugar content at different tissue culture stages

愈傷組織誘導(dǎo)芽階段，可溶性糖含量出現(xiàn)三次高峰值，當(dāng)外植體培養(yǎng)至7 d過程中，愈傷組織逐漸吸收營養(yǎng)物質(zhì)，表明愈傷組織誘導(dǎo)芽初期需要大量可溶性糖；當(dāng)?shù)降?4 d時愈傷組織逐漸變大且愈傷組織表面有許多小芽分化，因而這兩個時間段可溶性糖先上升后下降。由于芽體縱向生長需大量營養(yǎng)物質(zhì)，因此14 d～21 d期間，外植體處于營養(yǎng)物資積累準(zhǔn)備階段而出現(xiàn)第二個峰值。

Hy、Hyz及Hld階段可溶性糖含量比較發(fā)現(xiàn)，與芽體培養(yǎng)相關(guān)的這三個階段，可溶性糖含量變化趨勢基本是一致的，其峰值及低谷出現(xiàn)時間是一樣的，所不同的是在第21～28 d培養(yǎng)時間段內(nèi)，芽誘導(dǎo)可溶性糖含量下降幅度大于增殖及壯苗培養(yǎng)，而壯苗下降幅度大于增殖培養(yǎng)?？芍矿w處于營養(yǎng)生長時期的芽誘導(dǎo)階段需要的糖含量大于增殖及壯苗培養(yǎng)階段，壯苗培養(yǎng)對糖含量的需求大于增殖培養(yǎng)。圖1所示，培養(yǎng)35 d后，壯苗培養(yǎng)的可溶性糖含量最低，其次為增殖培養(yǎng)，最后為芽誘導(dǎo)，因而在營養(yǎng)生長后期，應(yīng)及時適度地增加營養(yǎng)物質(zhì)以保證芽體的快速良好生長。

圖1 Hzc和Hbd曲線所示，生根初期，可溶性糖是外植體進(jìn)行正常的新陳代謝及保證根原基分化必不可少的營養(yǎng)及能量物質(zhì)來源，該階段，植物體內(nèi)將淀粉轉(zhuǎn)化為可溶性糖，引起第一次上升即培養(yǎng)的第7 d；根系誘導(dǎo)過程，對可溶性糖含量的吸收導(dǎo)致其下降，培養(yǎng)的第7 d-14 d；當(dāng)根系誘導(dǎo)完成后，其需要吸收培養(yǎng)基內(nèi)的碳源即將蔗糖轉(zhuǎn)化為可溶性糖，同時植株本身進(jìn)行正常的新陳代謝，隨著光合作用增強(qiáng)，體內(nèi)的可溶性糖的含量逐漸上升，且比第一次的峰值高。隨著不定根的迅速伸長及增粗，促進(jìn)了呼吸作用，加快外植體內(nèi)可溶性糖轉(zhuǎn)化利用，此時可溶性糖應(yīng)處下降趨勢，但1號生根培養(yǎng)在培養(yǎng)第21 d后，可溶性糖含量繼續(xù)上升，比較兩個生根方案發(fā)現(xiàn)，較高濃度外源激素對根系增殖分化起到促進(jìn)作用，促使兩種生根方案可溶性糖變化趨勢不同。這也表明在21～28 d期間，1號生根培養(yǎng)外植體繼續(xù)進(jìn)行根系誘導(dǎo)過程。

2.2 不同碳源及濃度對生根培養(yǎng)階段外植體可溶性糖含量影響

雷公藤生根培養(yǎng)階段不同碳源及濃度處理，外植體生長結(jié)果如表4所示，可溶性糖含量趨勢變化如圖2所示。

圖2 不同碳源及濃度處理可溶性糖含量變化曲線圖Fig. 2 Variation curve of soluble sugar content under different carbon sources and concentrations

表4 各處理組織培養(yǎng)觀察結(jié)果Tab. 4 Observation results of tissue culture treatment

據(jù)表4數(shù)據(jù)可得，生根培養(yǎng)周期內(nèi)，葡萄糖的添加雷公藤生根效果（生根率、最早生根時間）不佳且外植體長勢差、根量低。且生根培養(yǎng)的最佳碳源是蔗糖，濃度以30 g·L-1最佳。

圖2所示，除P2（20 g·L-1葡萄糖）處理外，其余處理均在0-35 d培養(yǎng)期間出現(xiàn)可溶性糖含量的雙峰值，但峰值出現(xiàn)的時間不同。除Z3（30 g·L-1蔗糖）處理外，其余四個處理雙峰值出現(xiàn)時間為培養(yǎng)的第14 d及第28 d，而Z3處理峰值出現(xiàn)于培養(yǎng)第7 d以及培養(yǎng)第28 d。第一個峰值出現(xiàn)時間意味著第一次根系誘導(dǎo)的開始。如表4所示，Z3處理的生根時間最早（培養(yǎng)第11 d）。培養(yǎng)第28 d峰值的出現(xiàn)是為了提供根系的增殖及營養(yǎng)生長，因而其可溶性糖含量高。同時，由圖2可得，葡萄糖添加處理的在0-14 d培養(yǎng)時間段內(nèi)，可溶性糖含量明顯高于蔗糖處理，因而，葡萄糖是雷公藤組織培養(yǎng)前期的優(yōu)質(zhì)碳源來源，其利用轉(zhuǎn)化率高。

可溶性糖雖能為外植體提供大量營養(yǎng)物質(zhì)，但應(yīng)處于最佳含量，過高或過低均不利于生根。P2（20 g·L-1葡萄糖）處理可溶性糖一直呈上升趨勢，原因在于過高含糖量，導(dǎo)致植物細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境滲透壓失調(diào)，抑制了植物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，導(dǎo)致了外植體因營養(yǎng)缺失而生長發(fā)育不良。同時從以上圖2及表4可知，可溶性糖含量的變化7 d為一個周期，因而，對于雷公藤組織培養(yǎng)來說，7 d為其植物體生長發(fā)育的小周期，應(yīng)適時根據(jù)實際情況更換培養(yǎng)基。

3 結(jié)論與討論

3.1 可溶性糖含量變化與愈傷組織誘導(dǎo)芽之間關(guān)系

愈傷組織不管是增殖生長還是分化生長，其必須有一個內(nèi)外糖含量趨于平衡的濃度，因為只有細(xì)胞內(nèi)外糖濃度處于平衡狀態(tài)，細(xì)胞培養(yǎng)方能處于最佳生長狀態(tài)，此時也正是愈傷組織生長分化最有利時期[11-12]。觀察發(fā)現(xiàn)，雷公藤外植體中糖濃度一個時間段的上升就伴隨著另一時間段的下降以求平衡。研究表明，隨培養(yǎng)天數(shù)增加，外植體中可溶性糖總體趨勢處于上升而非下降趨勢，因而在后期培養(yǎng)中，外植體需要更多的營養(yǎng)物質(zhì)來提供其生長發(fā)育。本試驗中，利用愈傷組織誘導(dǎo)所得的芽體進(jìn)行光合作用來為其提供更多的養(yǎng)分，因而培養(yǎng)天數(shù)增加，糖含量不僅不減少，反而增加，但若只有愈傷組織而沒有芽體的存在，外植體將會缺失營養(yǎng)，此時應(yīng)及時更換培養(yǎng)基。

3.2 可溶性糖含量變化與不定芽分化、增殖及生長發(fā)育之間關(guān)系

當(dāng)外植體接種到芽生長發(fā)育培養(yǎng)基上后，有關(guān)碳水化合物合成的酶活性增強(qiáng)，促進(jìn)了植物組織細(xì)胞內(nèi)可溶性糖的合成。導(dǎo)致可溶性糖含量在一段時間內(nèi)，呈迅速增長趨勢。芽體分化及增殖階段的完成伴隨著可溶性糖含量隨著上升—下降—上升?？扇苄蕴呛糠从沉梭w內(nèi)作為有效態(tài)營養(yǎng)物的碳水化合物和能量水平，高濃度的糖可能會抑制芽點的增多，如果芽點數(shù)量過多會消耗大量的可溶性糖，使得分化較好的處理可溶性糖含量降到最低。只有適量的糖含量才能更好地促進(jìn)芽的生成，這與郭維明研究花燭愈傷組織不同繼代培養(yǎng)的再分化差異的結(jié)果是一致的[14]。

3.3 可溶性糖含量變化與生根培養(yǎng)之間關(guān)系

生根前期，莖段根部有愈傷組織生成，因而必須進(jìn)行細(xì)胞分裂，此時植物體內(nèi)的淀粉溶解，為其提供了大量營養(yǎng)物質(zhì)，因而植物體內(nèi)可溶性糖含量上升；根系誘導(dǎo)過程中，隨著莖段基部對可溶性糖的吸收，體內(nèi)糖含量便不斷下降；隨后植物體對培養(yǎng)環(huán)境的適應(yīng)及外植體葉片進(jìn)行光合作用，令外植體內(nèi)可溶性糖含量上升；不定根伸長增粗及增殖生長，令植物體呼吸作用增強(qiáng)，便消耗了大量營養(yǎng)物質(zhì)，因而糖含量再次下降且不再上升。

觀察發(fā)現(xiàn)，1號生根培養(yǎng)中，外植體在培養(yǎng)至第7d時及28d時，可溶性糖含量達(dá)峰值，在培養(yǎng)至第14d及35d時，可溶性糖含量最低，可能由于較高外源激素添加，使得培養(yǎng)基中糖含量在21d時上升，進(jìn)而呈現(xiàn)的生根效果優(yōu)于2號生根培養(yǎng)。

3.4 不同碳源及濃度添加對雷公藤生根培養(yǎng)可溶性糖含量變化影響

外源糖類的存在與否及使用濃度的大小對生根產(chǎn)生的影響我們解釋為是由于碳源缺乏引起異養(yǎng)無根苗的饑餓和或滲透壓處于亞最適水平或超最適水平。在植物組織培養(yǎng)中，不同植物種類的不同培養(yǎng)階段，需要的糖濃度及種類不同。據(jù)報道，如果向發(fā)育階段幼苗的外部環(huán)境提供過量的葡萄糖會引起幼苗生長的停滯和分化的中斷，這可能和ABA合成的增多和一些ABA信號基因活化有關(guān)[15]。本文中，最佳碳源的使用濃度及種類為30 g·L-1蔗糖，其次為20 g·L-1蔗糖，再者是10 g·L-1蔗糖。葡萄糖的使用，外植體不僅生根效果差，還令植物體處于營養(yǎng)缺乏狀態(tài)，抑制其生長發(fā)育。