劉玉佳，王淑君

（1.沈陽(yáng)藥科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110016；2.華北制藥股份有限公司，河北 石家莊 050000）

阿莫西林克拉維酸鉀片是世界上第一個(gè)含β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的抗生素復(fù)合制劑，其可有效抑制由多種耐藥細(xì)菌產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶，加強(qiáng)阿莫西林的抗菌活性，擴(kuò)大其抗菌譜[1]。在對(duì)該藥品進(jìn)行仿制研究過(guò)程中，采用溶出曲線測(cè)定產(chǎn)品體外溶出行為是常用的篩選處方和提高體內(nèi)生物等效試驗(yàn)通過(guò)率的方法，能最大程度地促使仿制藥與原研制劑體內(nèi)生物利用度一致[2]。因此，建立一種準(zhǔn)確靈敏的溶出曲線分析方法對(duì)仿制藥研究過(guò)程意義重大。本文開(kāi)發(fā)了一種用于測(cè)定阿莫西林克拉維酸鉀片溶出曲線的方法，采用槳法 75 rpm·min-1[3]，以水為溶出介質(zhì)，在 5、10、15、30、45 分鐘時(shí)經(jīng)自動(dòng)取樣儀取樣后，使用一次性濾膜過(guò)濾，注入液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)該方法進(jìn)行濾膜吸附、專屬性、線性范圍、回收率、定量限、精密度、穩(wěn)定性等項(xiàng)目驗(yàn)證[4]。結(jié)果表明，本方法濾膜吸附低、專屬性好、靈敏度高、溶出范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，精密度與準(zhǔn)確度均符合要求，能夠用于仿制藥處方工藝開(kāi)發(fā)期間的溶出曲線檢測(cè)。

1 主要儀器與試藥

安捷倫 1200 serious 高效液相色譜儀，島津 LC-2010AHT 高效液相色譜儀，Sartorius BP211D 電子天平（德國(guó)塞多利斯集團(tuán)），F(xiàn)E28 型 pH 計(jì)（梅特勒 METTLER-TOLEDO），HANSON VISION G2 Elite 8 型溶出儀（美國(guó) Hanson）。

克拉維酸化學(xué)對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：130429-201307，含量 95.0%）；阿莫西林化學(xué)對(duì)照品（中檢所，批號(hào)：130409-201011，含量 85.8%）；阿莫西林克拉維酸鉀系統(tǒng)適用性對(duì)照品（中檢所，批號(hào)：130588-201202）；磷酸二氫鈉（天津永大，批號(hào)：20140728，優(yōu)級(jí)純）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶出及檢驗(yàn)方法

溶出方法：槳法，溶出介質(zhì)：水，體積：900 L，轉(zhuǎn)速75 rpm·min-1[5]，取樣時(shí)間點(diǎn)：5、10、15、30、45 min，溶出介質(zhì)溫度：（37±0.5）℃，每個(gè)取樣點(diǎn)時(shí)，自動(dòng)取樣儀吸取溶出杯內(nèi)溶液約4 mL。經(jīng)在線過(guò)濾器過(guò)濾后，加入到預(yù)先放置的試管內(nèi)。然后，自動(dòng)補(bǔ)充相同體積相同溫度的溶出介質(zhì)。取試管內(nèi)液體經(jīng) 0.45 μm 水系過(guò)濾器（津騰）過(guò)濾后，加入液相進(jìn)樣瓶?jī)?nèi)，待檢。

檢驗(yàn)方法：色譜柱為 Welch ultimate AQ-C18（4.6×250 mm,5 μm），流動(dòng)相為甲醇—磷酸鹽緩沖液（7.8 g·L-1磷酸二氫鈉溶液，調(diào)節(jié) pH 值至 (4.4±0.1)）=5∶95，檢測(cè)器波長(zhǎng)為 220 nm，進(jìn)樣體積為 20 μL。

系統(tǒng)適用性要求：系統(tǒng)適用性溶液色譜圖應(yīng)與中檢院該批系統(tǒng)適用性對(duì)照品所附標(biāo)準(zhǔn)圖譜一致。

2.2 溶液配制

供試液：通過(guò)自動(dòng)取樣儀取溶出液 4 mL，使用 0.45 μm 濾膜濾過(guò)后作為供試液。

對(duì)照溶液：精密稱取克拉維酸對(duì)照品和阿莫西林對(duì)照品約 14、28 mg，置 100 mL 量瓶中，加水超聲溶解并定容，即得。

系統(tǒng)適用性溶液：精密稱取阿莫西林克拉維酸鉀系統(tǒng)適用性對(duì)照品約 8 mg，置 10 mL 量瓶中，加流動(dòng)相溶解并定容，即得。

2.3 濾膜吸附試驗(yàn)

過(guò)濾溶出液時(shí)，使用的濾膜如果對(duì)主成分有吸附，會(huì)使過(guò)濾后的供試液濃度低于實(shí)際溶出液的濃度，從而造成檢驗(yàn)誤差。因此，設(shè)計(jì)濾膜吸附試驗(yàn)應(yīng)確認(rèn)使用的濾膜對(duì)主成分沒(méi)有吸附。如果濾膜有吸附，則初濾液濃度會(huì)與棄去部分初濾液后的續(xù)濾液濃度有明顯差異。取本品研細(xì)后，精密稱取細(xì)粉適量，置 100 mL 量瓶中，加水溶解并定容，制成含阿莫西林約 0.06 mg·mL-1和0.28 mg·mL-1的溶液（即相當(dāng)于全部溶出 20% 和 100%）。用一次性無(wú)菌注射器吸取溶液適量，經(jīng) 0.45 μm 水系過(guò)濾器（津騰）過(guò)濾，分別取棄去初濾液 0、1、2、3 mL 后的續(xù)濾液作為供試液。分別精密量取各供試液 20 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖，試驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

Table 1 Results of adsorption test of filter membrane to solution表1 濾膜對(duì)溶液吸附性試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明，沒(méi)有棄去初濾液時(shí)，主成分的峰面積與棄去部分初濾液后主成分的峰面積無(wú)明顯差異。說(shuō)明濾膜對(duì)本品溶出 20% 和 100% 的溶液中主成分均無(wú)吸附。

2.4 在線過(guò)濾器的吸附試驗(yàn)

精密稱取本品細(xì)粉適量，用水溶解并稀釋制成相當(dāng)于溶出 20% 和 100% 的溶液。將溶出儀自動(dòng)取樣器管路潤(rùn)洗體積設(shè)為 7 mL，將溶液經(jīng)自動(dòng)取樣器取出 4 mL，經(jīng)濾膜過(guò)濾，棄去初濾液1 mL，取續(xù)濾液作為供試品溶液①；同時(shí)用一次性注射器吸取同一溶液4 mL，同法操作，取續(xù)濾液作為供試品溶液②。分別精密量取供試品溶液①和供試品溶液②各 20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

Table 2 Results of 20% solution adsorption test dissolved by on-line filter表2 在線過(guò)濾器對(duì)溶出20%的溶液吸附試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明，溶出儀自動(dòng)取樣器管路潤(rùn)洗體積設(shè)為7 mL，在線過(guò)濾器對(duì)本品溶出 20% 和 100%的溶液均無(wú)吸附，故溶出試驗(yàn)方法設(shè)置管路潤(rùn)洗體積為7 mL。

2.5 專屬性試驗(yàn)

按照制劑處方比例以水為溶劑配制相當(dāng)于阿莫西林和克拉維酸溶出均為 100% 的空白輔料，作為空白輔料溶液。取空白輔料溶液和空白溶劑按“2.1”項(xiàng)方法檢測(cè)。結(jié)果表明，空白溶劑和空白輔料均未在主成分出峰位置有干擾峰，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1～圖2。說(shuō)明該方法專屬性良好。

Fig.1 Blank excipient solution chromatogram圖1 空白輔料溶液色譜圖

Fig.2 Blank solvent chromatogram圖2 空白溶劑色譜圖

2.6 線性范圍考察

精密稱取阿莫西林對(duì)照品和克拉維酸對(duì)照品約 45、22.5 mg，置于 25 mL 量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，作為儲(chǔ)備液。吸取儲(chǔ)備液適量，逐步稀釋制成線性溶液 1～線性溶液 6，濃度分別為0.018、0.072、0.144、0.216、0.288 和0.360 mg·mL-1。

取線性溶液 1～6 按“2.1”項(xiàng)方法進(jìn)行檢測(cè)，記錄各主成分的峰面積 A 為縱坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度 C 為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到線性回歸方程為：阿莫西林：A=2.92×107C+5.55×104（R2=0.999 9），克拉維酸：A=3.35×107C+5.75×104（R2=0.999 8），兩主成分的線性圖見(jiàn)圖3～4。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在驗(yàn)證濃度范圍內(nèi)主成分峰面積與濃度均呈良好的線性關(guān)系，各質(zhì)量濃度下樣品的峰面積結(jié)果見(jiàn)表3。

Fig.3 Linear plot of amoxicillin in water圖3 阿莫西林在水中線性關(guān)系圖

Fig.4 Linear plot of clavulanate acid in water圖4 克拉維酸在水中線性關(guān)系圖

Table 3 Peak area results of samples at each mass concentrations表3 各質(zhì)量濃度下樣品的峰面積結(jié)果

2.7 回收率試驗(yàn)

評(píng)估溶出曲線各取樣點(diǎn)實(shí)際溶出量后，選取阿莫西林和克拉維酸全部溶出的 20%、50%、80%、100% 和 120% 五個(gè)濃度進(jìn)行回收率測(cè)定。精密稱取阿莫西林約 35、42.5 mg 和克拉維酸對(duì)照品約 17.5、20 mg，置于 25 mL 量瓶中，分別加水溶解并定容，作為儲(chǔ)備液①和儲(chǔ)備液②。按照表4 配制回收率試驗(yàn)溶液。

Table 4 The preparation of recovery solution表4 回收率試驗(yàn)溶液的配制

精密量取供試液和對(duì)照溶液各 20 mL，注入液相色譜儀。測(cè)定供試液中主成分的含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表5。

Table 5 Determination results of the recovery percent表5 回收率測(cè)定結(jié)果

結(jié)果表明，阿莫西林在溶出 20%～120% 范圍內(nèi)的平均回收率均在 98.5%～101.5%，RSD 均小于 1.0%；克拉維酸在溶出 20%～120% 范圍內(nèi)的平均回收率均在 98.5%～101.5%，RSD 均小于 1.0%。說(shuō)明用本方法測(cè)定溶出曲線各溶出濃度的阿莫西林和克拉維酸準(zhǔn)確度好。

2.8 定量限試驗(yàn)

精密稱取阿莫西林和克拉維酸對(duì)照品約 15 mg，置于 50 mL 量瓶中，加水溶解并定容，搖勻；精密量取適量加水逐級(jí)稀釋至主成分信噪比 S/N 約為 10∶1，阿莫西林定量限溶液濃度為 0.050 2 μg·mL-1，經(jīng)計(jì)算定量限為 1.006 ng，克拉維酸定量限溶液的濃度為 0.033 1 μg·mL-1。計(jì)算定量限為0.662 ng。

2.9 精密度試驗(yàn)

（1）重復(fù)性

將本品研細(xì)，精密稱取細(xì)粉適量，置于 50 mL 量瓶中，加水溶解并定容制成全部溶出 100%濃度的溶液（即每 1 mL 中含阿莫西林約為 0.28 mg 的溶液），重復(fù)配制 6 份，作為重復(fù)性試驗(yàn)溶液。精密稱取阿莫西林對(duì)照品和克拉維酸對(duì)照品約 28、14 mg，置于 100 mL 量瓶中，加水并定容制成與供試液相同濃度的溶液，作為對(duì)照溶液。精密量取對(duì)照溶液和重復(fù)性試驗(yàn)溶液各 20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果見(jiàn)表6。結(jié)果表明該方法的重復(fù)性良好。

Table 6 Repetitive test results表6 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

（2）中間精密度

按照重復(fù)性試驗(yàn)項(xiàng)下的方法，由兩個(gè)不同試驗(yàn)人員在不同時(shí)間分別使用 Agilent1200 和島津LC-2010AHT 液相色譜儀，選取同一批樣品進(jìn)行溶出曲線測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表7。結(jié)果表明該方法的中間精密度良好。

Table 7 Intermediate precision test results表7 中間精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.10 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將本品研細(xì)，取細(xì)粉適量，置 50 mL 量瓶中，加水溶解并定容制成每 1 mL 中含阿莫西林約為0.28 mg 的溶液，作為穩(wěn)定性試驗(yàn)溶液。于室溫放置，間隔 8 h 精密量取 20 μL，注入液相色譜儀，記錄各供試液中主成分的峰面積，結(jié)果見(jiàn)表8。結(jié)果表明，供試液在 8 h 內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

Table 8 Room temperature stability of the test products dissolved in water表8 溶出測(cè)定供試品在水中的室溫穩(wěn)定性結(jié)果

3 樣品測(cè)定

分別取三批樣品，按照以上確定的溶出曲線檢驗(yàn)方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表9。

Table 9 Results of the dissolution curve investigation of self-made preparations表9 自制制劑溶出曲線考察結(jié)果

4 結(jié)語(yǔ)

本文建立了一種阿莫西林克拉維酸鉀片水中溶出曲線的測(cè)定方法。該方法采用自動(dòng)溶出儀槳法使片劑崩解溶出，在 5、10、15、30、45 min 時(shí)，使用自動(dòng)取樣儀取樣，并經(jīng)取樣儀濾芯和一次性濾膜過(guò)濾后，使用高效液相色譜儀檢測(cè)。我們對(duì)該方法進(jìn)行了專屬性、準(zhǔn)確度、精密度等項(xiàng)目驗(yàn)證，結(jié)果符合要求，能夠滿足仿制藥研發(fā)過(guò)程中處方篩選的需要。