儲茂然,劉 娟,修朝博,孫 宇

鎂基合金作為一種新型生物醫(yī)用金屬,其壓縮屈服強度和彈性模量比其他常用的金屬生物材料更接近天然骨骼,被譽為新一代“革命性醫(yī)用金屬材料”。而且其具有良好的骨誘導性能、抗菌性能以及生物降解性,目前被應用于骨科固定螺釘、接骨板、骨充填材料的多孔支架及縫線等方面,也被應用于血管支架及口腔等領域[1-6]。Mn-3Sn-0.5Mn作為一種新型鎂合金在口腔領域中有巨大的應用潛力。本研究將通過金黃地鼠急性全身毒性實驗和小鼠黏膜刺激實驗評價該鎂合金的生物相容性,通過體外抗菌實驗和掃描電鏡的觀察,探究其抗菌性能。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

1.1.1 實驗動物 14只60～70 d鼠齡的金黃地鼠,頰囊黏膜完整健康,雌雄均可;純系昆明種小白鼠14只,體質量20～25 g,雌雄均可。均購自遼寧長生生物技術股份有限公司。所有動物實驗均經過哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準(編號:2021059)。

1.1.2 實驗材料 黏膜刺激實驗組將Mg-3Sn-0.5Mn合金線切割成直徑5 mm厚1 mm的圓片,牙膠加熱后充填入直徑5 mm厚1 mm的模具中固化后獲得陰性對照組試件,用牙科高速手機在各試件上制備間距1 mm孔徑1 mm的圓孔;抗菌實驗組將鎂合金線切割成直徑6 mm厚1 mm的圓片(Mg-3Sn-0.5Mn鎂合金由哈爾濱工程大學提供),對照組316不銹鋼(江蘇鴻辰金屬制品有限公司,中國)規(guī)格同上。鎂合金及316不銹鋼均用1 000目和2 000目SiC砂紙打磨,經丙酮和無水乙醇超聲蕩洗,環(huán)氧乙烷消毒后備用?？咕鷮嶒炘嚰褂们敖涀贤饩€燈每面照射1 h后立即使用。LB瓊脂培養(yǎng)液(北京保藏生物科技,中國)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)菌株及大腸埃希菌(Escherichiacoli,E.coli)菌株(哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院微生物教研室提供)。

1.1.3 實驗儀器 Tescan離子雙束電鏡(Tescan有限公司,捷克);電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠,中國);超聲波清洗機(深圳云奕科技股份有限公司,中國);生物安全柜(蘇州賽默飛世爾儀器有限公司,中國);組織切片機(萊卡,德國);光學顯微鏡(萊卡,德國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 黏膜刺激實驗 以鎂合金為實驗組,牙膠作為陰性對照組,對側作為空白對照組。參照YY/T0 127.13—2 018的標準[7],將14只健康金黃地鼠隨機分成2組,每組7只。腹腔注射麻醉后將其仰臥位固定,頰囊黏膜及面部皮膚消毒,鋪巾。將實驗試件縫合于地鼠頰囊內黏膜表面,使試件與黏膜組織保持緊密接觸且無壓迫,縫合貫通頰囊組織全層,口外打結。術后14 d處死動物,取出材料后對接觸的局部組織進行大體及組織學觀察。

1.2.2 急性全身毒性實驗 根據GB/T 16886．11—2011[8],按照浸提介質與試件表面積為3 cm2/mL的比例在37 ℃恒溫水浴鍋中浸提72 h,以0.9%生理鹽水作為浸提介質,0.22 μm濾膜濾菌后121 ℃高壓滅菌0.5 h,放置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?4只小白鼠分為2組,每組7只。實驗組為鎂合金組,對照組為生理鹽水,尾靜脈注射浸提液,速度不超過0.1 mL/s,每只小鼠注射劑量為50 mL/kg。注射后即刻、4 h、24 h、48 h和72 h觀察小鼠的狀態(tài)及其是否出現毒性表現,同時對小鼠在注射前與注射后24 h、48 h及72 h的體質量進行測量,比較體質量的變化。

1.2.3 體外抗菌實驗 以鎂合金作為實驗組,316不銹鋼作為對照組。將實驗材料置于12孔板中,用LB培養(yǎng)液將S.aureus及E.coli菌液濃度調整為1×106CFU/mL后,每孔加入3 mL菌液靜置于37 ℃細菌培養(yǎng)箱中。菌液與樣品共培育1 d和3 d后,收集樣品表面黏附菌及培養(yǎng)基中游離菌并各自測定活菌數。在2 mL EP管中加入1 mL PBS,將樣品放入EP管中180 W超聲振動5 min,然后用所得的細菌懸液計數黏于樣品表面的活菌。將孔板中菌液吹打均勻,用所得的細菌懸液計數培養(yǎng)基中游離活菌。逐級稀釋后,取菌液用涂布平板法涂于LB培養(yǎng)皿表面,37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后拍照、計數。通過以下公式計算抗菌率:R=(B-A)/B×100%,其中R是抗菌率,A為實驗組菌落數的平均值,B為對照組菌落數的平均值。

1.2.4 掃描電鏡觀察實驗 將材料置于12孔板中,用LB培養(yǎng)液將S.aureus菌液濃度調整為1×106CFU/mL后,每孔加入3 mL菌液靜置于37 ℃細菌培養(yǎng)箱中。菌液與樣品共培育1 d和3 d后,PBS溶液沖洗后固定,梯度乙醇脫水,自然風干,噴金觀察。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 黏膜刺激實驗

大體觀:實驗組與對照組實驗動物頰囊黏膜均未出現糜爛、出血、膿腫及結痂等異常表現。組織學觀察:陰性對照組及空白對照組中黏膜組織分層清晰,角化層較厚,未見棘層增生,固有層未見炎性細胞浸潤(圖1)。實驗組與陰性對照組及空白對照組相比未見明顯異常。結果表明鎂合金樣品對地鼠頰囊黏膜無刺激性。

A:Mg-3Sn-0.5Mn組;B:陰性對照組;C:空白對照組

2.2 急性全身毒性實驗

在72 h觀察期內,實驗組與對照組動物均未出現任何異常表現,無實驗小鼠死亡,且實驗組和對照組動物體質量均逐漸增長,體質量變化無統(tǒng)計學意義(P24 h=0.590,P48 h=0.257,P72 h=0.558,均大于0.05)(表1)。

表1 急性全身毒性實驗動物體質量變化表

2.3 抗菌實驗

共培養(yǎng)1 d和3 d實驗組黏附菌和游離菌的菌落數明顯少于對照組。各組P均小于0.05,抗菌效果明顯(圖2～3、表2)。

表2 菌落中位數及統(tǒng)計值表

第一行實驗組,第二行對照組

第一行實驗組,第二行對照組

共培養(yǎng)1 d的S.aureus的黏附菌抗菌率為57.08%;游離菌抗菌率為45.74%;共培養(yǎng)3 d的S.aureus的黏附菌抗菌率74.99%,游離菌抗菌率為85.65%。

共培養(yǎng)1 d的E.coli的黏附菌抗菌率為81.73%,游離菌抗菌率為74.50%;共培養(yǎng)3 d的E.coli黏附菌抗菌率為98.96%,游離菌抗菌率為99.62%。抗菌效果明顯。

掃描電鏡觀察:鎂合金表面3 d的黏附菌明顯少于1 d,與對照組相比黏附菌數量明顯較少(圖4)。正常金黃色葡萄球菌呈圓球狀,鎂合金表面1 d組表現為皺縮狀,3 d組皺縮狀更為明顯(圖5)。

圖4 兩組表面S.aureus黏附情況

圖5 鎂合金表面黏附的S. aureus的形態(tài)

3 討 論

生物醫(yī)用材料是用來對生物體進行診斷、治療、修復或替換其病損組織、器官或增進其功能的材料。生物醫(yī)用材料因其在用途上的特殊性,所以對其生物相容性方面要求更加嚴格。在應用于臨床前要經過細胞實驗、動物實驗及臨床前研究等體內外的研究評價該材料的生物相容性。

前期課題組通過對固溶處理(T4)、軋制、擠壓等不同工藝加工的Mg-3Sn-0.5Mn合金進行了組織結構及性能的對比,結果表明擠壓態(tài)Mg-3Sn-0.5Mn晶粒發(fā)生了細化,其強度及延伸率也明顯提高,同時血液相容性也表現良好;電化學實驗及浸泡實驗表明擠壓態(tài)Mg-3Sn-0.5Mn合金表現出更好的耐腐蝕性。所以在此基礎上,選擇擠壓態(tài)Mg-3Sn-0.5Mn合金進行兔股骨骨干及背部肌肉的植入,研究其體內生物相容性及降解性能,結果表明該鎂合金具有較好的體內生物相容性[9]。但對于該鎂合金的急性全身毒性、黏膜刺激性及抗菌性能尚未研究,所以我們對于這些性能進行研究,更加全面地對Mg-3Sn-0.5Mn合金作出評價。

黏膜刺激實驗是評價短期或長期接觸口腔組織的口腔醫(yī)用材料是否具有黏膜刺激性的實驗方法。本實驗選擇金黃地鼠作為實驗動物,是由于其頰囊中腺體組織和淋巴組織較少,有利于切片觀察黏膜組織的改變,同時將實驗材料縫合于頰囊,不會影響實驗動物的進食,能更好地模擬口腔環(huán)境。本實驗結果顯示實驗組與對照組大體下觀察均未出現水腫、糜爛等異常表現。組織學觀察實驗組及陰性對照組與空白對照組相比無明顯差異,HE染色均表現為黏膜分層明顯,角化層較厚,無棘層增生,固有層無炎性細胞浸潤。

急性全身毒性實驗是將材料的浸提液滅菌后經靜脈直接注射入動物體內,并在觀察期內觀察其一般表現及毒性反應,從而對實驗材料是否具有急性全身毒性作出評價[10]。實驗動物多為大白鼠和小白鼠。小白鼠因其容易飼養(yǎng),繁殖速度較快,體型小容易控制,有明確的質量標準且價格相對便宜,所以是急性、慢性及亞急性毒性實驗的首選[11]。本實驗通過小鼠尾靜脈注射的方式給藥,實驗組與對照組觀察期內均未出現任何毒性反應,兩組小鼠體質量均逐漸增長,體質量增長無差異(P>0.05)。表明Mg-3Sn-0.5Mn無急性全身毒性。

Mg-3Sn-0.5Mn合金表現出較好的生物相容性可能歸因于不含Ni、Cr等高致敏性元素,Mg元素是人體內第四豐富的礦物質,Mg主要存在于細胞內充當富含能量的三磷酸腺苷(ATP)和核酸的反離子。鎂是300多種酶系統(tǒng)的輔助因子,這些酶系統(tǒng)調節(jié)體內各種生化反應[12];Mg大部分在小腸處被吸收,多余鎂通過腎臟或是糞便排出,具有良好的生物相容性[13]。Mn為人體必需的元素,參與多種酶的合成,適當的Mn水平可以促進骨骼的生長發(fā)育,改善機體的造血功能[14]。同時Sn也是公認的具有較好生物相容性的合金元素[15]。

本實驗通過體外平板法測定其抗菌性能,同時還通過掃描電鏡觀察細菌的黏附情況及細菌的形態(tài),更全面地對鎂合金的抗菌性能作出評價。實驗結果表明該鎂合金對于金黃色葡萄球菌及大腸桿菌都具有較好的抗菌作用,同時掃描電鏡觀察到黏附菌的形態(tài)發(fā)生改變,共培養(yǎng)3 d后細菌形態(tài)較1 d組皺縮更為明顯。鎂合金的抗菌機制尚不明確,有研究表明可能與局部的pH值的變化有關[16],也可能是高濃度鎂離子產生較大的滲透壓破壞細胞壁,而產生了抗菌的作用[17]。但有研究表明鎂合金在體外表現出良好的抗菌性能,與pH值的增加有密切的關系,但在動物體內卻沒表現出令人滿意的抗菌能力,可能與體液強大的緩沖能力導致pH的變化減小,同時鎂合金表面形成碳酸鹽/磷酸鹽沉淀物,使其降解速率減慢,該層沉淀物還有利于細菌的附著等因素有關,從而導致鎂合金在體內的抗菌性能減弱[18-20]。所以對于Mn-3Sn-0.5Mn合金的體內抗菌性能還需進一步研究。

綜上所述,新型鎂合金(Mg-3Sn-0.5Mn)無急性全身毒性及黏膜刺激性,具有良好的生物相容性,體外抗菌性能明顯,可初步滿足作為口腔醫(yī)用材料的基本要求。