周 榮，劉嘉超,，楊鳳璽

（1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東 佛山 528000；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境園藝研究所/廣東省園林花卉種質(zhì)創(chuàng)新綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640）

【研究意義】墨蘭（Cymbidiumsinense）是我國(guó)國(guó)蘭的典型代表之一，在福建、廣東、臺(tái)灣廣泛分布。墨蘭葉型獨(dú)特，花姿優(yōu)美，花香馥郁，花期長(zhǎng)（9 月至翌年3 月），具有很高的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值［1-3］，產(chǎn)品遠(yuǎn)銷韓國(guó)、日本等地。開花性狀是墨蘭最重要的育種目標(biāo)，而APETALA1（AP1）基因在植物成花轉(zhuǎn)變和花器官發(fā)育過程中具有非常關(guān)鍵的作用［4］。開展墨蘭AP1基因的克隆和表達(dá)分析研究，對(duì)探究墨蘭開花過程中的分子調(diào)控機(jī)制具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】MADS-box 基因家族是一類在植物中廣泛存在的轉(zhuǎn)錄因子家族，可與其他轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)控因子相互作用，共同在植物花器官分化、果實(shí)發(fā)育和開花調(diào)控等方面起作用。MADSbox 基因家族通常分為兩個(gè)亞家族（Type Ⅰ和Type Ⅱ），其中Type Ⅱ亞家族基因編碼的蛋白質(zhì)均有1 個(gè)特征性結(jié)構(gòu)域K，能夠折疊形成3 個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)，介導(dǎo)MADS-box 蛋白之間形成二聚體，通過蛋白復(fù)合體共同調(diào)控下游靶基因。以Type Ⅱ類MADS-box 基因?yàn)楹诵臉?gòu)成的花發(fā)育ABCDE模型決定植物花器官的發(fā)育［5-6］。A 類基因主要影響花朵的外輪花器官發(fā)育，同時(shí)與E 類基因共同參與萼片的發(fā)育，并與B 類基因和E 類基因共同調(diào)控花瓣的形成和特化。AP1屬于A 類基因，其突變或過表達(dá)都會(huì)對(duì)植物的開花時(shí)間和花器官產(chǎn)生顯著影響［7-8］。在擬南芥中，過表達(dá)AP1可使擬南芥提前1 周左右開花［9］。AP1同時(shí)可以抑制最外輪花器官萼片葉腋處形成更多花原基。另外，AP1可以分別通過抑制細(xì)胞分裂素合成基因和激活細(xì)胞分裂素降解酶，減少AP1基因表達(dá)區(qū)域的細(xì)胞分裂素含量，從而維持正常花分生組織的有限生長(zhǎng)。目前，建蘭（C.ensifolium）［10］、石 斛（DendrobiumChao Praya Smile）［11］、萼脊蘭（Sedireajaponica）［8］、牡丹（Paeonia suffruticosa）［12］、荔枝（Litchichinensis）［13］、大豆（Glycinemax）［14］等多種植物的AP1基因已被成功克隆，研究發(fā)現(xiàn)，它們?cè)诨ㄆ鞴俚男纬珊突ㄆ谡{(diào)控中起著非常重要的作用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前關(guān)于墨蘭AP1基因的研究報(bào)道甚少，該基因在墨蘭上的功能表現(xiàn)也尚未清楚。因此，本研究以墨蘭為研究對(duì)象，克隆并鑒定到1 個(gè)墨蘭AP1基因（命名為CsAP1-A），并進(jìn)行基因表達(dá)模式分析［15］?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究克隆墨蘭CsAP1-A基因，通過生物信息學(xué)分析其基因結(jié)構(gòu)、蛋白結(jié)構(gòu)域和進(jìn)化關(guān)系，利用RTqPCR 方法分別檢測(cè)CsAP1-A在墨蘭不同器官、不同花發(fā)育階段和不同花組織部位的表達(dá)情況，通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析CsAP1-A在5 個(gè)不同花型墨蘭品種花組織部位的表達(dá)情況，并采用蛋白互作預(yù)測(cè)軟件分析CsAP1-A 與其他蛋白的互作關(guān)系，為進(jìn)一步研究CsAP1-A 在墨蘭花發(fā)育過程的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

基因克隆、表達(dá)分析供試的墨蘭品種為‘小香’，栽培于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境園藝研究所國(guó)家墨蘭種質(zhì)資源圃內(nèi)。挑選3 株長(zhǎng)勢(shì)良好的墨蘭，采集其花芽、成熟花器官及根、莖、葉和果各3 g 左右，用液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

不同花型轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析供試的5 個(gè)墨蘭品種為‘瑞金’（WT 普通花型）、‘安康梅’（花瓣蕊柱化的梅瓣花型，Gynostegium-like petal variety，GPV）、‘大圣’（重瓣花型，Multi perianth variety，MPV）、‘金鳳蝶’（花瓣唇瓣化花型，Labellum -like petal variety，LaPV）和‘六瓣花’（唇瓣萼片化花型，Null-labellum variety，NLV），均來源于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境園藝研究所國(guó)家墨蘭種質(zhì)資源圃。采集的花朵立即用液氮速凍處理。

DH5α 化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞、熒光定量試劑盒（Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix）、高保真酶試劑盒（2×Phanta Flash Master Mix）、產(chǎn)物純化試劑盒（FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit）、克隆載體試劑盒（5 min TA/Blunt Cloning Kit）和RNA 提取試劑盒（FastPure Universal Plant Total RNA Isolation Kit），均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2 總RNA 提取及反轉(zhuǎn)錄

用多糖多酚植物RNA 提取試劑盒提取墨蘭花芽的RNA，操作過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。使用蛋白核酸分析儀檢測(cè)RNA 濃度，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 質(zhì)量，將檢測(cè)合格的RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA。

1.3 目的基因克隆

以前期基因組測(cè)序得到的CsAP1-ACDS 為參考序列，使用NCBI 設(shè)計(jì)基因克隆的PCR 引物：CsAP1-A-F 5'ATGGGAAGAGGGAGGGTT3'、CsAP1-A-R 5'TTATCCATTCATATGAGTGAGC3'。以墨蘭花芽cDNA 為模板，按照高保真酶試劑盒說明書操作進(jìn)行CsAP1-A基因克隆，PCR 體系為50 μL，反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性30 s；98 ℃預(yù)變性10 s、58 ℃退火5 s、72 ℃延伸5 s，34 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸1 min。擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后與TA 克隆載體連接，轉(zhuǎn)化到DH5α 化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞中培養(yǎng)，次日挑選陽性菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，得到CsAP1-A基因完整序列。

1.4 CsAP1-A 生物信息學(xué)分析

使用Expasy-ProtParam（https://www.expasy.org/）分析CsAP1-A 蛋白的分子量大小、親水性等理化性質(zhì)；使用NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析CsAP1-A 的保守結(jié)構(gòu)域；使用DNAMAN 軟件將CsAP1-A 與6 個(gè)同源蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)；使用Mega6.0 軟件的鄰接法構(gòu)建CsAP1-A 系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 CsAP1-A 基因表達(dá)分析

使用RT-qPCR 方法對(duì)CsAP1-A在墨蘭不同器官（根、莖、葉、花、果）、不同花發(fā)育階段（花芽分化初期S1、花芽分化發(fā)育期S2、花梗伸長(zhǎng)期S3、排鈴期S4 和開花期S5）和不同花組織部位（萼片、花瓣、唇瓣、合蕊柱）的表達(dá)進(jìn)行分析。以CsActin作為內(nèi)參基因（表1），PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)?；虮磉_(dá)試驗(yàn)重復(fù)3 次，使用2-ΔΔCt公式計(jì)算CsAP1-A相對(duì)表達(dá)量［16］。

表1 CsAP1-A 基因熒光定量PCR 引物Table 1 Primers for fluorescence quantitative PCR of CsAP1-A gene

1.6 不同花型轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析

采集5 個(gè)不同花型（WT、GPV、MPV、LaPV、NLV）墨蘭品種（‘瑞金’‘安康梅’‘大圣’‘金鳳蝶’‘六瓣花’）的花朵，立即液氮速凍處理，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。對(duì)CsAP1-A的FPKM 值進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)換，并利用R 語言中的Pheatmap 工具包生成熱圖。

1.7 CsAP1-A 蛋白互作關(guān)系

通過STRING 數(shù)據(jù)庫（https://cn.string-db.org/）預(yù)測(cè)可能與CsAP1-A 發(fā)生互作的蛋白質(zhì)，并以水稻作為參考，構(gòu)建CsAP1-A 與其他蛋白的互作關(guān)系圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 CsAP1-A 基因全長(zhǎng)克隆

以墨蘭花芽為材料提取RNA，并將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA 為模板，以墨蘭基因組參考序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增得到約750 bp 的單一片段（圖1）。將回收的DNA 片段與TA 克隆載體進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，最后通過測(cè)序得到CsAP1-A基因序列，全長(zhǎng)744 bp，編碼248 個(gè)氨基酸（圖2）。

圖1 CsAP1-A 基因克隆PCR 產(chǎn)物Fig.1 PCR product of CsAP1-A gene cloning

圖2 CsAP1-A 基因的核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide acid sequence of CsAP1-A gene and deduced amino sequence

2.2 CsAP1-A 生物信息學(xué)分析

2.2.1 CsAP1-A 蛋白理化性質(zhì)分析根據(jù)Expasy-ProtParam 預(yù)測(cè)分析結(jié)果，CsAP1-A 蛋白的分子式為C1242H2038N370O376S9，蛋白分子量為28.4 kD，總原子數(shù)為4 035，脂肪系數(shù)為83.40，平均親水性為-0.762，說明CsAP1-A 是一個(gè)親水蛋白。選擇模型一致性高達(dá)98.38%的同源蛋白AOA1P8SCC5.1A 作為模板，通過SWISS-MODEL在線軟件構(gòu)建CsAP1-A 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)包含4 個(gè)保守的α-螺旋和2 個(gè)β 折疊結(jié)構(gòu)（圖3）。

圖3 CsAP1-A 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3 Tertiary structure prediction of CsAP1-A protein

2.2.2 CsAP1-A 蛋白保守域分析與同源序列比對(duì) 通過NCBI 數(shù)據(jù)庫分析蛋白序列可知，CsAP1-A 擁有保守的MADS-box 結(jié)構(gòu)域和K-box結(jié)構(gòu)域（圖4），屬于MADS-box轉(zhuǎn)錄因子家族成員。此外，通過NCBI 數(shù)據(jù)庫得到多個(gè)與CsAP1-A 同源性很高的蛋白序列，其中，CsAP1-A 與春蘭（C.goeringii）AP1/FUL（APY18447.1）和蕙蘭（C.faberi）MADS1（AGE15496.1）的同源性均高達(dá)98.38%，與金釵石斛（D.nobile）MADSbox protein 1（ABQ08573.1）、蝴蝶蘭（Phalaenopsis amabilis）AP1-related protein（AAZ76263.1）、華山姜（Alpiniaoblongifolia）APETALA1-like protein（ABS83558.1）、銀合歡（Nelumbonucifera）APETALA1（AGY54940.1）的同源性分別為85.83%、82.19%、66.27%和60.32%（圖5）。

圖4 CsAP1-A 蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.4 Analysis of conserved domains of CsAP1-A protein

圖5 CsAP1-A 蛋白同源序列比對(duì)Fig.5 Homologous sequence alignment of CsAP1-A protein

2.2.3 CsAP1-A 氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化 為進(jìn)一步了解CsAP1-A 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化情況，從NCBI數(shù)據(jù)庫中挑選20 條與CsAP1-A 氨基酸序列具有一定同源性的氨基酸序列，利用MEGA6.0 軟件的NJ 法構(gòu)建進(jìn)化樹。結(jié)果（圖6）表明，CsAP1-A的進(jìn)化樹可以分為單子葉植物和雙子葉植物兩類［17］，其中在單子葉植物中，CsAP1-A 與其他蘭科植物親緣關(guān)系較近，并聚類一起。

圖6 CsAP1-A 蛋白NJ 系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 Neighbor-joining phylogenetic tree of CsAP1-A protein

2.3 CsAP1-A 基因時(shí)空表達(dá)分析

為研究CsAP1-A的表達(dá)模式，用RT-qPCR方法分別檢測(cè)其在墨蘭根、莖、葉、花、果不同器官，不同花發(fā)育階段，以及萼片、花瓣、唇瓣、合蕊柱不同花朵組織部位的表達(dá)情況。結(jié)果（圖7）表明，CsAP1-A在墨蘭不同器官中均有表達(dá)，在花中表達(dá)量最高，其次分別為莖、果、根和葉。

圖7 CsAP1-A 在墨蘭不同器官中的相對(duì)表達(dá)量Fig.7 Relative expression of CsAP1-A in different organs of Cymbidium sinense

在墨蘭花芽分化發(fā)育的不同階段，CsAP1-A集中在花發(fā)育早期階段表達(dá)，在S1階段的表達(dá)量最高，之后逐漸下降，在S3 階段的表達(dá)量降至60%，在S5 階段的表達(dá)量降至最低。此外，對(duì)墨蘭不同花組織部位的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，CsAP1-A在合蕊柱中的表達(dá)量最高，其次分別是唇瓣、花瓣和萼片（圖8）。

圖8 CsAP1-A 在墨蘭花中的相對(duì)表達(dá)量Fig.8 Relative expression of CsAP1-A in flower of Cymbidium sinense

2.4 不同花型墨蘭CsAP1-A 表達(dá)模式分析

分析墨蘭不同花型轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集，用熱圖形式顯示不同花型CsAP1-A基因的表達(dá)情況。結(jié)果（圖9）表明，CsAP1-A在WT、MPV、LAPV 和NLV 4 種花型［18］中均以合蕊柱中的表達(dá)量最高、萼片中的表達(dá)量最低；在合蕊柱異常發(fā)育的MPV中，CsAP1-A在合蕊柱的表達(dá)量顯著提高，而在GPV 中的整體表達(dá)量最高，且表達(dá)區(qū)域從合蕊柱擴(kuò)展到花瓣。

2.5 CsAP1-A 蛋白互作預(yù)測(cè)分析

使用String 在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)CsAP1-A 蛋白與其他蛋白之間的互作可能性，并以水稻作為參考，結(jié)果（圖10）表明，CsAP1-A 可能與MADS1（A類基因）、MADS6（D 類基因）、MADS47（B 類基因）、MADS8（C 類基因）等10 個(gè)蛋白存在互作關(guān)系。MADS1 與MADS47 的綜合得分較高，推測(cè)CsAP1-A 與它們互作的可能性更大。而在水稻中，OsMADS1 和OsMADS6 蛋白均屬于MADSbox 轉(zhuǎn)錄因子家族成員，且這些蛋白在花器官發(fā)育和花期調(diào)控方面發(fā)揮重要作用［19］。因此，推測(cè)CsAP1-A 蛋白參與墨蘭花的發(fā)育。

圖10 CsAP1-A 蛋白互作關(guān)系預(yù)測(cè)Fig.10 Prediction of CsAP1-A protein interactions

3 討論

MADS-box 轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物花的形態(tài)和發(fā)育過程方面扮演著重要角色，而AP1基因是MADS-box 轉(zhuǎn)錄因子家族的重要成員，被歸類為擬南芥ABCDE 開花模型中的A 類基因，在許多植物中均被證實(shí)能夠發(fā)揮調(diào)控植物開花、調(diào)控花器官發(fā)育的作用［20］。五峰玉蘭MawuAP1基因可以使擬南芥提前開花，并在花序頂端產(chǎn)生頂生花［21］。過表達(dá)麻風(fēng)樹JcAP1基因能夠顯著縮短擬南芥的生長(zhǎng)周期并導(dǎo)致提前開花［22］。過表達(dá)月季RcAP1也可以使擬南芥提前開花［23］。

本研究從墨蘭花芽中克隆出CsAP1-A基因，該基因編碼區(qū)為744 bp，編碼248 個(gè)氨基酸，含有MADS-box 和K-box 結(jié)構(gòu)域，表明CsAP1-A是典型MADS-box 轉(zhuǎn)錄因子。通過與其相似度較高的蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)它們的保守結(jié)構(gòu)域相同。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，CsAP1-A 蛋白與春蘭AP1/FUL3 蛋白聚為一支，說明二者親緣關(guān)系最近。

大多數(shù)A 類基因在生殖器官的表達(dá)量均高于營(yíng)養(yǎng)器官［24］。本研究比較了CsAP1-A基因在墨蘭根、莖、葉、花、果5 個(gè)器官的相對(duì)表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)CsAP1-A在花中的表達(dá)量最高，在其他器官的表達(dá)量較低，說明CsAP1-A與花的發(fā)育和形成有關(guān)。在墨蘭花芽分化的5 個(gè)時(shí)期中，CsAP1-A在花芽分化初期（S1）的表達(dá)量最高，然后逐漸下降，在開花期（S5）的表達(dá)量降到最低，這與大部分的A 類基因在不同花發(fā)育時(shí)期表達(dá)規(guī)律相似，如山茶的CjAPL1［25］、麻風(fēng)樹的JcAP1［22］和洋桔梗的EgAP1［26］，因?yàn)镾1 期是花器官形成的起始階段和關(guān)鍵階段，AP1作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，可以在此階段啟動(dòng)信號(hào)來激活其他基因促進(jìn)花的形成，而隨著花芽的不斷發(fā)育，其他相互作用的調(diào)控因子和信號(hào)通路逐漸介入，AP1的表達(dá)量就會(huì)逐漸降低。在墨蘭花朵的不同組織部位中，CsAP1-A在合蕊柱的表達(dá)量最高，其次是唇瓣，推測(cè)CsAP1-A主要參與墨蘭合蕊柱的發(fā)育。對(duì)墨蘭不同花型進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)CsAP1-A在WT、MPV、LaPV 和NLV 4 種花型的合蕊柱中表達(dá)量均最高，這與RT-qPCR 檢測(cè)WT 花型中CsAP1-A的表達(dá)結(jié)果相一致。AP1作為A 類基因主要在第一、二輪花器官中表達(dá)，誘導(dǎo)花瓣和萼片的發(fā)育［7］；但在蘭科植物中，AP1不在第一、二輪花器官表達(dá)，而是在內(nèi)輪的合蕊柱中表達(dá)［27］。

根據(jù)蛋白互作關(guān)系的預(yù)測(cè)結(jié)果可知，CsAP1-A 大多與MADS-box 蛋白家族存在相互作用，而這些蛋白均與花器官發(fā)育和花期相關(guān)，因此預(yù)測(cè)CsAP1-A 蛋白在墨蘭花器官發(fā)育過程中起重要作用，這為進(jìn)一步研究墨蘭花器官發(fā)育分子調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究在墨蘭花芽中克隆得到CsAP1-A基因，該基因編碼248 個(gè)氨基酸，含有MADS-box轉(zhuǎn)錄因子家族的MADS-box 和K-box 結(jié)構(gòu)域。墨蘭CsAP1-A與春蘭和蕙蘭的親緣關(guān)系最近，且可能與MADS1、MADS6、MADS47、MADS8 等蛋白具有相互作用。CsAP1-A在墨蘭花中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他器官，且在花芽分化初期的表達(dá)量最高，并隨著花朵發(fā)育而逐漸下降；在墨蘭花朵不同組織部位中，CsAP1-A在合蕊柱的表達(dá)量最高，其次是唇瓣、花瓣和萼片。通過對(duì)不同花型的墨蘭品種轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，CsAP1-A在WT、MPV、LaPV 和NLV 4 種花型的合蕊柱中表達(dá)量均最高。綜上所述，CsAP1-A可能在墨蘭花發(fā)育和合蕊柱形成中具有重要作用。