劉 昆，吳春玲，宋小亞，蔣 俊，路新彥，應(yīng)國(guó)華

（麗水市農(nóng)林科學(xué)研究院，浙江 麗水 323000）

我國(guó)約有大型真菌資源17 000 種，僅有少量類型被發(fā)現(xiàn)，大部分類群尚未發(fā)現(xiàn)[1]。我國(guó)有可食大型真菌近1 000 種，可商業(yè)規(guī)模栽培的僅60 種左右，大量大型真菌資源未被挖掘利用[2]。野生資源需要經(jīng)過(guò)分離、鑒定、馴化栽培，才能將其由野生生長(zhǎng)狀態(tài)變?yōu)榭扇斯ぴ耘嗟臓顟B(tài)。從大型真菌的無(wú)性、有性組織或其生長(zhǎng)基質(zhì)中分離到的菌絲體，是食（藥）用菌產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)利用的基礎(chǔ)。但由于野外環(huán)境復(fù)雜，容易滋生多種真菌，因此分離過(guò)程中常因其他絲狀真菌的影響而出現(xiàn)分離錯(cuò)誤、菌種污染等情況，造成培養(yǎng)的菌株與最初標(biāo)本不符，從而影響后續(xù)馴化利用。因此，明確分離培養(yǎng)所獲得菌株的準(zhǔn)確名稱，是后續(xù)研究的基礎(chǔ)。

麗水市地處浙江省西南端山區(qū)，位于118°41′～120°26′E，27°25′～28°57′N，面積1.73 × 106hm2，境內(nèi)90%以上地區(qū)是山地，分布有甌江、錢塘江、閩江、飛云江、靈江、福安江等眾多水系，以中亞熱帶海洋性季風(fēng)氣候與丘陵山地立體氣候?yàn)橹?，森林覆蓋率為81.7%，是華東的重要生態(tài)屏障，物種多樣性居全省之冠[3]。得天獨(dú)厚的自然資源與氣候條件，孕育出豐富的物種和植被類型。大型真菌作為麗水市生態(tài)循環(huán)的分解者，在生態(tài)平衡中占有不可或缺的地位，是生物多樣性的重要組成部分。對(duì)麗水市野生大型真菌資源進(jìn)行調(diào)查，摸清資源概況，不僅有益于當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境，也可為大型真菌資源保護(hù)利用提供理論基礎(chǔ)。

目前，在海南、山東、貴州等地均開(kāi)展過(guò)大型真菌資源的調(diào)查研究，期望大型真菌資源在生態(tài)保護(hù)、農(nóng)業(yè)資源利用、食品藥品生產(chǎn)等方面發(fā)揮作用。如MA 等[4]對(duì)海南的木腐大型真菌資源進(jìn)行了報(bào)道，共發(fā)現(xiàn)702 種木生大型真菌，包括食用菌22 種、藥用菌71 種、有毒蘑菇6 種。王敏等[5]、鄧春英等[6]分別對(duì)貴州省內(nèi)的食用菌與有毒蘑菇資源進(jìn)行調(diào)查，共發(fā)現(xiàn)481 種野生食用菌，140 種有毒蘑菇。蘇陽(yáng)等[7]報(bào)道，山東省有大型真菌資源557 種，其中食用菌118 種、藥用菌184 種、食（藥） 兼用菌57 種。據(jù)文獻(xiàn)記載，自1980 年起，麗水市已經(jīng)開(kāi)始對(duì)大型真菌資源進(jìn)行調(diào)查，但當(dāng)時(shí)僅收集了部分木腐菌標(biāo)本，并未對(duì)生態(tài)環(huán)境、真菌生活習(xí)性、有毒蘑菇的危害及價(jià)值進(jìn)行詳細(xì)研究[8]。1997 年，孫培基等[9]報(bào)道，浙西地區(qū)（包括浙江泰順縣） 有大型真菌468種。2012 年，顧新偉等[10]調(diào)查顯示，浙南山區(qū)（包括永嘉縣、文成縣、泰順縣） 擁有大型真菌1 100多種。近年來(lái)，隨著資源調(diào)查方法與標(biāo)本鑒定技術(shù)的迅速更新，部分學(xué)者開(kāi)始利用網(wǎng)絡(luò)化調(diào)查與分子鑒定技術(shù)對(duì)麗水轄區(qū)內(nèi)的大型真菌資源進(jìn)行更加詳細(xì)與科學(xué)的研究。如趙端林等[11]在景寧縣的望東垟、大仰湖2 個(gè)保護(hù)區(qū)內(nèi)采集標(biāo)本1 018 份，鑒定出195種大型真菌，包括8 個(gè)國(guó)內(nèi)新記錄種和4 個(gè)新種或新亞種。孫其偉等[12]在慶元縣采集到標(biāo)本286 份，鑒定出149 種大型真菌。趙承剛等[13]對(duì)縉云縣境內(nèi)大型真菌進(jìn)行調(diào)查，獲得標(biāo)本203 份，鑒定出132個(gè)種。但關(guān)于麗水白云山與南明山兩地大型真菌資源分布情況未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，對(duì)兩地可培養(yǎng)大型真菌資源的相關(guān)研究也較少。試驗(yàn)通過(guò)對(duì)白云山、南明山及周邊地區(qū)可培養(yǎng)野生大型真菌資源進(jìn)行分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)鑒定，明確其分類地位，評(píng)價(jià)其利用價(jià)值，以期為今后的馴化栽培和資源開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 野外調(diào)查與菌株采集

白云山與南明山分別位于麗水市城區(qū)北側(cè)與南側(cè)，占地面積分別為2 848 hm2、1 177 hm2，分別建有白云國(guó)家森林公園與南明山風(fēng)景名勝區(qū)，生態(tài)環(huán)境良好。兩地年平均氣溫為18 ℃左右，4 月～10 月為雨季[14-15]。對(duì)白云山、南明山兩地采用踏查法開(kāi)展大型真菌野外調(diào)查與樣品采集[16]，時(shí)間主要集中在2010 年至2021 年間每年的5 月至9 月。并對(duì)慶元的百山祖和五嶺根、云和鳳凰山、景寧漁際坑、松陽(yáng)箬寮原始林等地進(jìn)行適時(shí)采集。采集時(shí)記錄采集編號(hào)、地點(diǎn)、時(shí)間、植被類型；新鮮子實(shí)體形狀、大小、顏色、氣味、傷變情況、生長(zhǎng)基質(zhì)等內(nèi)容，并使用數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行圖片拍攝。新鮮樣品采集后帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離、干制與保存。

1.2 菌株干制與菌絲體分離

新鮮子實(shí)體連同采集標(biāo)簽一同放入報(bào)紙中，在45～50 ℃條件下烘干，用于標(biāo)本保藏與顯微觀察。

新鮮子實(shí)體表面使用75%酒精進(jìn)行消毒后，將子實(shí)體切開(kāi)（耳狀子實(shí)體撕開(kāi)子實(shí)層），使用手術(shù)刀切取部分子實(shí)體組織塊，接種于含有抗生素的葡萄糖馬玲薯瓊脂（PDA） 平板中，于25 ℃條件下培養(yǎng)。期間及時(shí)觀察和記錄，待菌絲開(kāi)始生長(zhǎng)后切取菌落前端菌絲體進(jìn)行純化培養(yǎng)，連續(xù)純化3 次。

1.3 菌株鑒定

采用ITS 序列比對(duì)與形態(tài)鑒定相結(jié)合的方法進(jìn)行物種鑒定。對(duì)于保藏時(shí)間較久，只有菌絲體的菌株以分子生物學(xué)鑒定為主。

將純化后的菌絲體接種到鋪有賽璐酚膜的PDA平板中，25 ℃培養(yǎng)菌絲體。當(dāng)菌絲長(zhǎng)滿平板或培養(yǎng)15 d 后收集菌絲體。使用北京百泰克公司的真菌基因組試劑盒提取總DNA。ITS 序列擴(kuò)增引物為ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′） 和ITS4 （5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。25 μL 擴(kuò)增反應(yīng)體系：2.5 μL 10 × Buffer，1 μL dNTP （2.5 mmol·L-1），上下引物各1 μL （10 μmol·L-1），0.3 μL Taq 酶（5 U·μL-1），1 μL DNA 模板，18.2 μL ddH2O。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果為單一條帶的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行TA 克隆測(cè)序。使用NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST 在線程序?qū)λ@得的序列進(jìn)行比對(duì)分析。

形態(tài)學(xué)觀察包括采集過(guò)程所記錄的宏觀形態(tài)，以及菌蓋表皮、擔(dān)子、孢子、囊狀體等顯微結(jié)構(gòu)特征。將ITS 比對(duì)結(jié)果與形態(tài)特征結(jié)合進(jìn)行物種鑒定，兩者結(jié)果一致判定為有效分離菌株，鑒定結(jié)果不一致的判定為無(wú)效分離菌株。對(duì)于僅有菌種的菌株，查閱相關(guān)書(shū)籍文獻(xiàn)，根據(jù)分子鑒定結(jié)果與菌絲形態(tài)判斷是否為有效分離菌株。

1.4 菌株種名確定

根據(jù)第十版Dictionary of the Fungi （《真菌詞典》）[17]分類系統(tǒng)確定分類地位。物種的拉丁學(xué)名以真菌物種數(shù)據(jù)庫(kù)Index fungorum[18]收錄的最新名稱為準(zhǔn)。中文名稱參考《中國(guó)大型菌物資源圖鑒》[19]和《中國(guó)生物多樣性紅色名錄-大型真菌卷》[20]，以及戴玉成[21]、李熠[22]、李增智等[23]、段東娥[24]、MONGKOLSAMRIT 等[25]、武英達(dá)等[26]、劉順等[27]、李海蛟等[28]、郭婷等[29]所發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行確定。食用菌、藥用菌、有毒蘑菇的確定參考戴玉成等[30-31]、圖力古爾等[32]、李海蛟等[33]發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

使用WPS 表格軟件，對(duì)分類數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 有效分離菌株的分類統(tǒng)計(jì)結(jié)果

對(duì)2010 年至2021 年分離保藏的297 株可培養(yǎng)大型真菌菌株進(jìn)行分離鑒定，共獲得246 株有效分離菌株、占總數(shù)的82.8%；51 株無(wú)效分離菌株，占總數(shù)的17.2%。進(jìn)一步對(duì)有效分離菌株進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)，結(jié)果詳見(jiàn)表1。

表1 有效分離菌株分類單元統(tǒng)計(jì)Tab.1 The total taxa of effective isolates

如表1 所示，246 株有效分離菌株隸屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycota） 和子囊菌門（Ascomycota） 的5 綱12 目34 科70 屬115 種。其中屬于蘑菇綱（Agaricomycetes）、糞殼菌綱（Sordariomycetes） 的種類最多，分別有94 種（81.7%）、17 種（14.8%）。其余菌株屬于花耳綱（Dacrymycetes）、盤(pán)菌綱（Pezizomycetes）、座囊菌綱（Dothideomycetes）。在目一級(jí)水平上，屬于蘑菇目（Agaricales） 的菌株種類最多，有45 種，占總數(shù)的39.1%；屬于多孔菌目（Polyporales） 的有36 個(gè)種，占總數(shù)的31.3%；屬于肉座菌目（Hypocreales） 的有16 個(gè)種，占總數(shù)的13.9%。屬于其他目的菌株種類占比較少，屬于木耳目（Auriculariales） 的有3 個(gè)種、屬于銹革菌目（Hymenochaetales） 的有3 個(gè)種、屬于牛肝菌目（Boletales） 的有2 個(gè)種，屬于花耳目（Dacrymycetales）、炭角菌目（Xylariales）、盤(pán)菌目（Pezizales）、格孢菌目（Pleosporales） 的則均僅有1 個(gè)種。

在科一級(jí)水平上對(duì)菌株進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果詳見(jiàn)表2 （僅列出含有5 個(gè)種以上的科）。

表2 主要科的物種數(shù)量統(tǒng)計(jì)Tab.2 The dominant fungal families

如表2 所示，在科一級(jí)水平上，屬于蘑菇科（Agaricaceae） 的有16 個(gè)種，占總數(shù)的13.9%；屬于多孔菌科（Polyporaceae） 的有15 個(gè)種，占總數(shù)的13.0%；屬于球蓋菇科（Strophariaceae） 的有12 個(gè)種，占總數(shù)的10.4%；屬于蟲(chóng)草科（Cordycipitaceae）的有10 個(gè)種，占總數(shù)的8.7%；屬于擬層菌科（Fomitopsidaceae） 的有8 個(gè)種，占總數(shù)的7.0%；屬于靈芝科（Ganodermataceae） 的有5 個(gè)種，占總數(shù)的4.3%；屬于其它科的種數(shù)均在5 種以下。

在屬一級(jí)水平上對(duì)菌株進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果詳見(jiàn)表3 （僅列出含有5 個(gè)種以上的屬）。

表3 主要屬的物種數(shù)量統(tǒng)計(jì)Tab.3 The dominant fungal genera

如表3 所示，在屬一級(jí)水平上，屬于蟲(chóng)草屬（Cordyceps） 的有8 個(gè)種，屬于擬層孔菌屬（Fomitopsis） 的有6 個(gè)種，屬于栓孔菌屬（Trametes） 的有5 個(gè)種，屬于靈芝屬（Ganoderma） 的有5 個(gè)種，屬于蘑菇屬（Agaricus） 的有5 個(gè)種。屬于其它屬的菌株占比較低，各屬包含物種數(shù)均少于5 種。

2.2 食用菌資源評(píng)價(jià)結(jié)果

將麗水白云山、南明山等地分離的115 種246株有效分離菌株按食用價(jià)值進(jìn)行分類，可分為食用菌、藥用菌、有毒蘑菇和食毒不明蘑菇4 類。其中食用菌有23 種，占總種數(shù)的20.0%；藥用菌有24種，占總種數(shù)的20.1%；有毒蘑菇有15 種，占總種數(shù)的13.0%；食毒不明的其它大型真菌資源61 種，占總種數(shù)的53.0%。

23 個(gè)記載可以食用的種類信息詳見(jiàn)表4，部分子實(shí)體形態(tài)特征詳見(jiàn)圖1。

圖1 部分食用菌子實(shí)體Fig.1 Fruit bodis of some of the collected edible fungi

表4 食用大型真菌種類Tab.4 Edible macrofungi species

如表4 和圖1 所示，在23 種食用菌中，有13種可大規(guī)模人工栽培，分別為皺木耳、毛木耳、毛頭鬼傘、牛舌菌、金針菇、卵孢小奧德蘑、花臉香蘑、白鬼筆、多脂鱗傘、白黃側(cè)耳、糙皮側(cè)耳、肺形側(cè)耳、裂褶菌。褐黃木耳與毛木耳2 個(gè)種類的有效分離菌株均有6 個(gè)，在所有食用菌中，菌株分離數(shù)量最多。

2.3 藥用菌資源評(píng)價(jià)

分析發(fā)現(xiàn)，有效分離菌株中共有藥用菌種類24種，詳細(xì)信息見(jiàn)表5，部分子實(shí)體形態(tài)特征見(jiàn)圖2。

圖2 部分藥用菌子實(shí)體Fig.2 Fruit bodies of some of the collected medicinal fungi

如表5 和圖2 所示的藥用菌中，有13 種被報(bào)道可進(jìn)行人工栽培，分別是粉蟲(chóng)草、高雄山蟲(chóng)草、細(xì)腳蟲(chóng)草、紅貝俄氏孔菌、紅緣擬層孔菌、樹(shù)舌靈芝、南方靈芝、有柄靈芝、靈芝、白囊耙齒菌、蟬棒束孢、網(wǎng)紋馬勃、云芝栓孔菌。

2.4 有毒蘑菇資源評(píng)價(jià)

所有有效分離菌株中，共有有毒蘑菇7 種，中毒類型有神經(jīng)精神型和腸胃炎型2 種，詳細(xì)信息見(jiàn)表6，子實(shí)體形態(tài)特征見(jiàn)圖3。

圖3 有毒蘑菇子實(shí)體Fig.3 Fruit bodies of poisonous fungi

表6 有毒蘑菇種類Tab.6 Poisonous fungi species

如表6 和圖3 所示的有毒蘑菇中，可造成神經(jīng)精神型中毒的種類有：白黃小脆柄菇、糞生光蓋傘、熱帶紫褐裸傘、蘇梅島裸蓋菇?？稍斐赡c胃炎型中毒的種類有：大青褶傘、叢生垂幕菇、磚紅垂暮菇。白黃小脆柄菇在所有有毒蘑菇中分離到的菌株最多，在蓮都白云山、蓮都南明山兩地共分離到7 株。

3 討論

根據(jù)利用價(jià)值，大型真菌資源可分為食用菌、藥用菌、有毒蘑菇3 類。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)有食用菌近1 000 種，可實(shí)現(xiàn)商業(yè)化栽培的約有60 種[2]；藥用真菌473 種，也僅有80 余種實(shí)現(xiàn)了人工栽培[30]。從數(shù)量來(lái)看，我國(guó)仍有大量的大型真菌資源可被開(kāi)發(fā)利用。本試驗(yàn)中共獲得可人工栽培的食用菌13 種，46個(gè)菌株，其中皺木耳、毛木耳、毛頭鬼、牛舌菌、白鬼筆、多脂鱗傘、白黃側(cè)耳、裂褶菌等種類在麗水市還未見(jiàn)較大規(guī)模栽培，可作為麗水食用菌產(chǎn)業(yè)未來(lái)發(fā)展的備選種類。在藥用菌方面，試驗(yàn)獲得藥用菌24 種，102 個(gè)菌株，其中靈芝、樹(shù)舌靈、南方靈芝、有柄靈芝、紅緣擬層孔菌等種類可為藥用菌產(chǎn)業(yè)提供新的資源，擴(kuò)大本地以靈芝為代表的藥用菌產(chǎn)業(yè)范圍。對(duì)這些種類進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用，可為本地的食（藥） 用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供新的動(dòng)力。近年，高雄山蟲(chóng)草與細(xì)腳蟲(chóng)草被修訂為一個(gè)種——Cordyceps tenuipes，因?qū)π路诸愊到y(tǒng)的接納有滯后性，此次仍以原數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果為依據(jù)進(jìn)行分類，這也從側(cè)面說(shuō)明對(duì)其研究尚不充分[34]。

蘑菇中毒是我國(guó)最嚴(yán)重的食品安全問(wèn)題之一，僅2022 年就發(fā)生蘑菇中毒事件482 次，1 332 人中毒，28 人死亡[35]。因此對(duì)毒蘑菇的種類、有毒成分、中毒類型等進(jìn)行研究，有助于預(yù)防中毒事件，提高中毒治療效果。試驗(yàn)分離到7 種有毒蘑菇，共15 個(gè)菌株，其中白黃小脆柄菇、糞生光蓋傘、熱帶紫褐裸傘、蘇梅島裸蓋菇可造成神經(jīng)精神型中毒，大青褶傘、叢生垂幕菇、磚紅垂暮菇可造成腸胃炎型中毒。但目前國(guó)內(nèi)對(duì)這些有毒蘑菇研究多集中于資源調(diào)查，僅有少量與毒素相關(guān)的研究，如何對(duì)其進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用還有待深入研究。

試驗(yàn)除對(duì)有效分離菌株進(jìn)行分類鑒定外，還對(duì)51 株無(wú)效分離菌株進(jìn)行了鑒定。多數(shù)無(wú)效分離菌株可根據(jù)分子鑒定結(jié)果及其菌落形態(tài)進(jìn)行辨別，為以后野生大型真菌分離提供一定參考。但有些種類的真菌因菌落形態(tài)與多數(shù)大型真菌相近，出現(xiàn)分離錯(cuò)誤也較難在早期發(fā)現(xiàn)。如小包擬盤(pán)多毛孢[Pestalotiopsis microspora （Speg.） G.C.Zhao & Nan Li] 的菌落白色濃密，生長(zhǎng)速度中等[36]，菌落生長(zhǎng)早期與其它大型真菌較難區(qū)分，易導(dǎo)致錯(cuò)誤分離，但其生長(zhǎng)后期有大量黑色液滴狀分生孢子產(chǎn)生，可依據(jù)此特征進(jìn)行辨別。又如白囊耙齒菌[Irpex lacteus （Fr.）Fr.]，其本身為一種常見(jiàn)的木腐真菌，菌落白色較薄，呈輕微升起的棉花絮狀，生長(zhǎng)速度較快[37]，以上特征與多數(shù)大型真菌類似，且具有分生節(jié)孢子，容易擴(kuò)散引起污染，僅憑形態(tài)特征較容易導(dǎo)致分離錯(cuò)誤，需要結(jié)合分子生物學(xué)數(shù)據(jù)、出菇性狀等進(jìn)行區(qū)分。