繆劍虹 孔怡然 劉堯 深圳市藥品檢驗(yàn)研究院 （廣東 深圳 518057）

內(nèi)容提要： 目的：對(duì)無菌醫(yī)療器械的無菌檢驗(yàn)結(jié)果開展全過程的回顧性調(diào)查與分析，以探討無菌檢驗(yàn)檢驗(yàn)結(jié)果偏差（OOS）發(fā)生的原因，并規(guī)定了OOS結(jié)果調(diào)查的具體操作規(guī)程。方法：根據(jù)《中華人民共和國藥典》（2020版）和新版藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)的OOS指南，從人、機(jī)、料、法、環(huán)、測(cè)六要素進(jìn)行深入分析和探討，找出無菌檢驗(yàn)過程中可能導(dǎo)致微生物污染的原因。結(jié)果：通過OOS結(jié)果調(diào)查分析，排除了實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和檢驗(yàn)人員操作導(dǎo)致樣本污染的情況，初步分析在試驗(yàn)樣本中檢出的微生物為產(chǎn)品本身的缺陷，可能是產(chǎn)品終端滅菌不徹底，細(xì)菌芽孢未被完全殺滅導(dǎo)致的產(chǎn)品缺陷。結(jié)論：OOS調(diào)查過程可以幫助實(shí)驗(yàn)室識(shí)別導(dǎo)致OOS結(jié)果的可能原因，然后采取糾正和預(yù)防措施。在微生物實(shí)驗(yàn)室建立完善的OOS結(jié)果調(diào)查計(jì)劃以規(guī)范調(diào)查操作流程，是提高微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理水平的重要手段。

醫(yī)療器械無菌檢查是無菌提供的醫(yī)療器械質(zhì)量控制的重要部分之一，也是提升無菌醫(yī)療器械質(zhì)量控制水平、控制醫(yī)療器械臨床不良反應(yīng)發(fā)生率的主要措施。無菌醫(yī)療器械如果被微生物污染，有可能引起患者的感染，以至危及患者的生命安全[1]。微生物普遍存在于自然環(huán)境中，檢驗(yàn)人員的活動(dòng)、檢驗(yàn)儀器及產(chǎn)品包裝等都可能把這些微生物引入檢驗(yàn)環(huán)境中，進(jìn)而導(dǎo)致假陽性結(jié)果。檢驗(yàn)結(jié)果偏差（Out of Specification，OOS）結(jié)果是指不符合所依據(jù)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的可接受的檢驗(yàn)結(jié)果，其對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)結(jié)果不滿足有關(guān)規(guī)定以及不符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求。OOS結(jié)果調(diào)查是實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量體系關(guān)鍵要素之一，《中華人民共和國藥典》（2020版）和現(xiàn)行動(dòng)態(tài)藥品生產(chǎn)管理規(guī)范法規(guī)對(duì)微生物檢測(cè)OOS結(jié)果的調(diào)查作出了更詳細(xì)的闡述和應(yīng)用研究[2]。還規(guī)定實(shí)驗(yàn)室對(duì)OOS結(jié)果應(yīng)當(dāng)依據(jù)書面程序開展全面調(diào)查，力求找出導(dǎo)致OOS結(jié)果的主要原因并判斷其是否有效，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。為保證其意義，OOS結(jié)果調(diào)查應(yīng)該是完全的、及時(shí)的、不帶有任何偏見的、記錄是完整且經(jīng)得起科學(xué)推敲的[3]。

基于微生物檢測(cè)結(jié)果固有的變異性，無菌檢驗(yàn)OOS結(jié)果調(diào)查相較于其他理化檢驗(yàn)項(xiàng)目，在調(diào)查的工作量、專業(yè)性以及復(fù)雜程度都有更高的要求。因此，為規(guī)范OOS調(diào)查流程，實(shí)驗(yàn)室不僅需要具備受過專業(yè)培訓(xùn)和豐富檢驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)的專業(yè)技術(shù)人員，還需要建立完善的OOS結(jié)果調(diào)查程序。對(duì)于微生物實(shí)驗(yàn)室OOS結(jié)果的調(diào)查，需要核實(shí)的相關(guān)記錄和影響因素非常繁雜，由于其復(fù)雜性，OOS結(jié)果的調(diào)查必須更加嚴(yán)謹(jǐn)，并盡量回顧實(shí)驗(yàn)過程中的每一個(gè)環(huán)節(jié)。OOS結(jié)果調(diào)查分為實(shí)驗(yàn)室初步調(diào)查、全面OOS結(jié)果調(diào)查、調(diào)查結(jié)論等三部分內(nèi)容[4]。本文將結(jié)合實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際情況對(duì)某次無菌檢查發(fā)現(xiàn)的OOS結(jié)果進(jìn)行調(diào)查和分析。

1.資料與方法

1.1 一般資料

調(diào)查時(shí)間為2022年7月25日～2022年8月2日。實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)人員系有5年以上微生物檢驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)的資深檢驗(yàn)員，取得了微生物檢查和無菌檢查的崗位授權(quán)。4批無菌醫(yī)療器械，其中注射器和棉簽為監(jiān)督抽驗(yàn)樣品，醫(yī)用外科口罩和醫(yī)用防護(hù)口罩為評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)樣品。

儀器設(shè)備：恒溫培養(yǎng)箱，低溫培養(yǎng)箱，全自動(dòng)革蘭氏染色儀，顯微鏡，BD全自動(dòng)細(xì)菌鑒定/藥敏系統(tǒng)。

1.2 方法

實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)人員對(duì)4批無菌醫(yī)療器械進(jìn)行無菌檢查，其中有一批棉簽的檢驗(yàn)結(jié)果呈陽性，用一次性無菌接種環(huán)取上述陽性培養(yǎng)物經(jīng)胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基劃線分離，置33°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48h，挑取單個(gè)菌落經(jīng)胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基純化，置33°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48h，最終得到2株細(xì)菌，使用BD全自動(dòng)細(xì)菌鑒定/藥敏系統(tǒng)進(jìn)行微生物鑒定[5]。

2.結(jié)果

4批無菌醫(yī)療器械的無菌檢查結(jié)果如表1所示：其中，棉簽樣品的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基管均在第4天變渾濁。取渾濁的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)液劃線胰酪大豆胨瓊脂平板，33°C培養(yǎng)48h，得到2株不同菌落形態(tài)的菌株[6]。

革蘭氏染色鏡檢結(jié)果均為革蘭氏陽性芽孢桿菌，經(jīng)BD全自動(dòng)細(xì)菌鑒定/藥敏系統(tǒng)鑒定，全自動(dòng)生化鑒定結(jié)果分別為環(huán)狀芽孢桿菌（Baci.circulans）、短小芽孢桿菌（Baci.pumilis）。

3.討論

3.1 OOS結(jié)果的調(diào)查和分析

一旦OOS結(jié)果被確定，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)客觀地和及時(shí)地進(jìn)行評(píng)估，不應(yīng)該對(duì)OOS結(jié)果的原因進(jìn)行預(yù)想的假定，應(yīng)該迅速評(píng)估數(shù)據(jù)以確定結(jié)果是否屬于實(shí)驗(yàn)室錯(cuò)誤，或該結(jié)果是否顯示是產(chǎn)品缺陷的問題，在調(diào)查的過程中，每一步的調(diào)查都應(yīng)做充分的記錄。下面將結(jié)合微生物實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際情況，按照《中華人民共和國藥典》（2020版）和現(xiàn)行藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)的要求，對(duì)此次醫(yī)療器械的無菌檢驗(yàn)過程中涉及的各方面要素進(jìn)行回顧和檢查[7-10]。

3.1.1 相關(guān)人員資質(zhì)

試驗(yàn)人員具備專業(yè)的微生物檢驗(yàn)?zāi)芰?，有無菌檢驗(yàn)的崗位授權(quán)，熟悉無菌檢驗(yàn)的操作流程和監(jiān)控要點(diǎn)，持續(xù)參加微生物相關(guān)專業(yè)的內(nèi)外部培訓(xùn)，定期參與微生物相關(guān)的能力驗(yàn)證。潔凈室清潔人員接受過專業(yè)的潔凈室清潔培訓(xùn)，并取得相關(guān)崗位授權(quán)。

3.1.2 試驗(yàn)樣品、器具和培養(yǎng)基

樣品內(nèi)外包裝完整無損，外觀無異常，樣品在無菌實(shí)驗(yàn)前均進(jìn)行了表面消毒。實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基的無菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果均符合規(guī)定，實(shí)驗(yàn)用器具經(jīng)過嚴(yán)格的滅菌處理，上述器具和試劑用于同日檢查的其他檢品，同時(shí)檢測(cè)的其他3批檢品無菌檢查結(jié)果均符合要求，未發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室污染的情況。

3.1.3 設(shè)施環(huán)境

無菌檢查室定期安排專業(yè)人員進(jìn)行清潔和消毒，潔凈區(qū)室定期做環(huán)境監(jiān)測(cè)，檢測(cè)當(dāng)天使用的超凈工作臺(tái)的沉降菌以及手套和操作服的表面微生物，未收集到相關(guān)環(huán)境微生物，在目前為止，環(huán)境監(jiān)測(cè)收集到的微生物中，未檢測(cè)出環(huán)狀芽孢桿菌和短小芽孢桿菌。

3.1.4 儀器設(shè)備

試驗(yàn)使用的儀器設(shè)備在性能確認(rèn)有效周期內(nèi)，并處于正常使用狀態(tài)，滅菌參數(shù)設(shè)置和培養(yǎng)箱溫度設(shè)置正確，滅菌效果核查正常，上述設(shè)備同時(shí)用于同日檢查的其他檢品，未發(fā)現(xiàn)污染的情況。

3.1.5 培養(yǎng)基試劑耗材

無菌檢查使用的培養(yǎng)基均通過培養(yǎng)基適用性檢查，培養(yǎng)基試劑耗材均處于有效期內(nèi)，外觀形狀無異常，保存條件符合要求。

3.1.6 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

檢查當(dāng)天試驗(yàn)所用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)名稱、批號(hào)是否正確，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可溯源，外觀形狀無異常，儲(chǔ)存條件符合要求，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液配制正確且在使用有效期內(nèi)。

3.1.7 檢驗(yàn)操作過程

供試品取樣均勻且有代表性，取樣量已滿足標(biāo)準(zhǔn)要求，供試品溶液配制正確，當(dāng)天檢測(cè)所用的容量儀器均檢定合格并在有效期內(nèi)，已按要求進(jìn)行空白試驗(yàn)且空白試驗(yàn)符合要求。

3.1.8 污染微生物分析

試驗(yàn)樣品中檢出的2株菌株分別為環(huán)狀芽孢桿菌和短小芽孢桿菌，在日常環(huán)境監(jiān)測(cè)的過程中從未在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中及檢測(cè)人員的手套和操作服上檢測(cè)到這兩種菌，因此，排除污染微生物是由實(shí)驗(yàn)室環(huán)境或檢測(cè)人員操作帶入污染的可能。

3.2 分析與小結(jié)

通過以上OOS結(jié)果調(diào)查分析，未發(fā)現(xiàn)明顯的實(shí)驗(yàn)室缺陷。經(jīng)實(shí)驗(yàn)室初步分析導(dǎo)致無菌檢查結(jié)果不合格的原因可能是產(chǎn)品終端滅菌不徹底，細(xì)菌芽孢未被完全殺滅而導(dǎo)致的產(chǎn)品質(zhì)量缺陷。芽孢桿菌，細(xì)菌的一科，能形成芽孢（內(nèi)生孢子）的桿菌，它們對(duì)外界有害因子抵抗力強(qiáng)，分布廣，存在于土壤、水、空氣以及動(dòng)物腸道等處。芽孢抗逆性很強(qiáng)，如果滅菌不徹底，沒有被殺滅的芽孢會(huì)再次萌發(fā)，從而造成滅菌失敗[11]。

通過對(duì)上述OOS結(jié)果的調(diào)查和分析，初步建立了微生物實(shí)驗(yàn)室OOS結(jié)果調(diào)查的分析方案，分別從如下多個(gè)角度加以說明：

3.2.1 人員

人員包括檢驗(yàn)人員和實(shí)驗(yàn)室清潔人員，檢驗(yàn)人員是否熟悉相關(guān)檢測(cè)方法、程序、檢測(cè)目的和結(jié)果評(píng)價(jià)方法，是否持續(xù)接受微生物相關(guān)專業(yè)的培訓(xùn)，且能夠獨(dú)立從事該項(xiàng)無菌檢查試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)室清潔人員是否經(jīng)過相關(guān)的培訓(xùn)和授權(quán)，檢查實(shí)驗(yàn)室清潔消毒記錄是否做到定期的清潔與消毒。

3.2.2 培養(yǎng)基/試劑/耗材

檢查培養(yǎng)基是否按照標(biāo)準(zhǔn)程序完成驗(yàn)收，并查看培養(yǎng)基的配制、滅菌和儲(chǔ)存情況，確保培養(yǎng)基的配制和滅菌有效，培養(yǎng)基和浸提介質(zhì)的陰性對(duì)照應(yīng)符合規(guī)定。所使用的器具是否經(jīng)過消毒滅菌，一次性使用耗材是否經(jīng)過質(zhì)量驗(yàn)收，確保其滿足實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)要求。

3.2.3 樣品

樣品名稱，樣品編號(hào)及批號(hào)是否正確，樣品外觀有無異常，內(nèi)外包裝是否完整無損，樣品存儲(chǔ)是否符合要求，如有同時(shí)檢測(cè)的其他樣品的無菌檢查情況。

3.2.4 設(shè)施設(shè)備

潔凈區(qū)是否定期清潔消毒，定期做環(huán)境監(jiān)控，檢查實(shí)驗(yàn)當(dāng)天潔凈室的溫濕度和壓差是否在標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定范圍內(nèi)，是否按規(guī)定檢測(cè)當(dāng)天的表面微生物和工作臺(tái)沉降細(xì)菌。儀器的計(jì)量或校準(zhǔn)是否在周期內(nèi)，核查滅菌設(shè)備滅菌效果，檢查滅菌參數(shù)和培養(yǎng)溫度是否設(shè)置正確，檢查涉及的儀器設(shè)備的日常維護(hù)和保養(yǎng)記錄。

3.2.5 檢驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)

檢驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)是否使用正確，檢驗(yàn)方法是否經(jīng)過確認(rèn)/驗(yàn)證。

3.2.6 檢驗(yàn)檢測(cè)過程

檢驗(yàn)操作過程中供試品的取樣是否均勻、有代表性，供試品取樣量是否滿足標(biāo)準(zhǔn)的要求，供試品溶液是否配制正確，其過濾性和穩(wěn)定性是否滿足要求；是否已按要求進(jìn)行空白試驗(yàn)，檢驗(yàn)過程中所用的容量儀器確保檢定合格并在有效期內(nèi)；檢驗(yàn)人員是否嚴(yán)格按照規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3.2.7 其他

此外，對(duì)檢測(cè)過程中培養(yǎng)出的微生物進(jìn)行菌種鑒定是無菌檢查實(shí)驗(yàn)OOS調(diào)查的關(guān)鍵步驟，決定最后是否能夠找到根本原因[12-15]。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立潔凈區(qū)環(huán)境微生物信息庫，環(huán)境菌的收集包括定期環(huán)境監(jiān)測(cè)檢測(cè)到的空氣微生物、設(shè)施設(shè)備的表面微生物及每次實(shí)驗(yàn)過程收集到的無菌操作服和無菌手套的表面微生物。當(dāng)檢測(cè)出現(xiàn)陽性結(jié)果時(shí)，可將陽性檢出菌與環(huán)境微生物信息庫對(duì)比分析，以判斷檢出菌是否為實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中帶入導(dǎo)致的污染。

由于微生物分布的不均勻性，以及微生物的數(shù)量會(huì)因生長和環(huán)境等因素發(fā)生變化，微生物檢測(cè)通常不允許進(jìn)行復(fù)試，因此，實(shí)驗(yàn)室發(fā)生OOS結(jié)果時(shí)，及時(shí)有效地對(duì)OOS結(jié)果進(jìn)行調(diào)查和分析，盡可能地找出導(dǎo)致不合格結(jié)果的真正原因，這是實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體系中非常關(guān)鍵的環(huán)節(jié)[16,17]。需要注意的是，由于不同單位的技術(shù)水平和資源的局限，以及人類對(duì)微生物掌握的局限，不是每次的OOS結(jié)果調(diào)查都可以發(fā)現(xiàn)其根本原因，但通過OOS結(jié)果調(diào)查的過程能夠幫助實(shí)驗(yàn)室找出導(dǎo)致OOS結(jié)果發(fā)生的可能原因，進(jìn)而采取糾正預(yù)防措施。