許弘弢，黃小娟，鄭重陽(yáng)，張志愿

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔頜面頭頸腫瘤科，上海交通大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，國(guó)家口腔醫(yī)學(xué)中心，國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，上海市口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市口腔醫(yī)學(xué)研究所，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院口腔頜面再生醫(yī)學(xué)創(chuàng)新單元，上海 200011

在全球范圍內(nèi)，惡性腫瘤已經(jīng)成為主要的死亡原因之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)，口腔癌在全身惡性腫瘤發(fā)病率中居第6位，其中90%為口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）［1-2］。目前，治療OSCC的主要手段是手術(shù)徹底切除原發(fā)腫瘤，但切除后仍有相對(duì)較高的復(fù)發(fā)率且患者預(yù)后較差，局部復(fù)發(fā)率為25% ～ 50%，5年生存率為64.8%［2］。

現(xiàn)階段術(shù)前腫瘤定位時(shí)，判斷是否有局部或遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移主要依靠計(jì)算機(jī)體層成像（computed tomography，CT）、正電子發(fā)射體層成像（positron emission tomography，PET）及磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）等大型設(shè)備，但這些設(shè)備對(duì)腫瘤組織的靈敏度和特異度還有待提高，并且這些設(shè)備不能在術(shù)中實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)定位引導(dǎo)切除。目前術(shù)中定位腫瘤切除范圍的手段非常有限，主要依賴術(shù)者的視診和觸診，但這種缺乏依據(jù)而只基于經(jīng)驗(yàn)的判斷太過(guò)主觀。通常采用術(shù)中快速冷凍切片病理學(xué)檢查對(duì)癌床邊緣進(jìn)行檢查，但作為一種耗時(shí)耗力的評(píng)估手段，能否準(zhǔn)確地評(píng)估癌床狀態(tài)、減少?gòu)?fù)發(fā)率頗有爭(zhēng)議［3］。

依托于熒光探針的熒光成像技術(shù)可以作為一種補(bǔ)充性手段用于腫瘤的診療過(guò)程。熒光探針經(jīng)光照激發(fā)后會(huì)在富集處發(fā)射耀眼的熒光信號(hào)，經(jīng)儀器捕捉后即形成熒光影像，具有極高的分辨率（微米級(jí)），并可以與裸眼影像結(jié)合。除此之外，熒光成像所需的設(shè)備便攜可移動(dòng)，不會(huì)遮擋手術(shù)視野，不會(huì)打亂既有工作流程，這些特點(diǎn)使得術(shù)中實(shí)時(shí)熒光成像引導(dǎo)切除成為可能。熒光成像技術(shù)也可以與CT、PET、MRI及術(shù)中快速冷凍切片病理學(xué)檢查等手段結(jié)合使用，彌補(bǔ)現(xiàn)階段術(shù)前診斷、術(shù)中定位及術(shù)后檢查等環(huán)節(jié)的不足，有助于降低復(fù)發(fā)率、提高患者生存率和生存質(zhì)量。

1 熒光成像簡(jiǎn)介

熒光是一種光致發(fā)光的現(xiàn)象，其原理為熒光分子吸收外界光源照射的能量，使得熒光分子從基態(tài)躍遷到能量較高的激發(fā)態(tài)，之后熒光分子會(huì)通過(guò)釋放光子產(chǎn)生熒光的形式再次回到基態(tài)。通常，這一過(guò)程是由高能（短波）的入射光激發(fā)熒光分子后產(chǎn)生低能（長(zhǎng)波）的熒光，其中波長(zhǎng)的變化被稱為斯托克斯位移，可以在很大程度上影響熒光成像的效果。熒光成像系統(tǒng)通過(guò)捕捉靶區(qū)特定波長(zhǎng)范圍的熒光并將其集成至顯示器就可以在術(shù)中實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)熒光成像。

早在1944年，熒光成像技術(shù)就已經(jīng)在臨床診療中使用［4］。近期，隨著材料科學(xué)的發(fā)展、多學(xué)科聯(lián)合的深入，使得熒光成像成為一種極具潛力的輔助技術(shù)。與CT、PET及MRI等常規(guī)的成像方式相比，熒光成像作為一種非侵入性的成像方式，不會(huì)產(chǎn)生電離輻射、放射性損傷等不良反應(yīng)，卻能提供實(shí)時(shí)可視化、超高分辨率的影像資 料。

與影像學(xué)和組織病理學(xué)等傳統(tǒng)診斷方式相比，熒光探針能夠在細(xì)胞、分子水平上進(jìn)行診斷，有更高的靈敏度和特異度。熒光探針可以根據(jù)激發(fā)/發(fā)射光的波長(zhǎng)進(jìn)行分類，即可見(jiàn)光區(qū)（390 ～ 700 nm）、近紅外一區(qū)（near infrared region-Ⅰ，NIR-Ⅰ：700 ～ 900 nm）和近紅外二區(qū)（NIR-Ⅱ：900 ～ 1 700 nm）。本文針對(duì)這3個(gè)分區(qū)中代表性的熒光探針及其在口腔腫瘤診療過(guò)程中的應(yīng)用及進(jìn)展進(jìn)行論述。

2 可見(jiàn)光區(qū)熒光探針的應(yīng)用

傳統(tǒng)熒光探針的激發(fā)/發(fā)射光的波長(zhǎng)通常位于可見(jiàn)光區(qū)，其中熒光素鈉（s o d i u m fluorescein，NaFL）、亞甲基藍(lán)（methylene blue，MB）和5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，5-ALA）獲得了美國(guó)食品藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）的認(rèn)證，在臨床和基礎(chǔ)研究中被廣泛使用。

2.1 熒光素

NaFL經(jīng)靜脈注射后通過(guò)非特異性的微血管滲漏作用在微血管系統(tǒng)紊亂的腫瘤組織中滯留；早在1948年，NaFL就在腦瘤手術(shù)中使用［5］，后來(lái)也被用于眼科血管造影［6］及探查口腔腫瘤［7］等。Qaiser等［7］為了研究NaFL探查口腔癌的靈敏度和特異度，通過(guò)局部噴涂方式進(jìn)行了包含100名研究對(duì)象的橫斷面研究，病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)其中58例具有口腔癌或異常增殖，局部噴涂NaFL后顯示熒光陽(yáng)性的患者有56例，靈敏度為96.6%；在剩余42名健康者中有20名熒光陽(yáng)性、22名陰性，特異度為52.4%，不能將炎癥組織與腫瘤組織有效區(qū)分。

異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）也屬于熒光素家族，常用于疾病機(jī)制研究中，Annexin Ⅴ能夠與細(xì)胞早期凋亡時(shí)細(xì)胞膜上出現(xiàn)的靶點(diǎn)特異性結(jié)合，F(xiàn)ITC與Annexin Ⅴ偶聯(lián)使得細(xì)胞凋亡可視化。Du等［8］使用AnnexinⅤ-FITC熒光探針研究口腔鱗癌細(xì)胞中miR-221上調(diào)是否會(huì)導(dǎo)致阿霉素抵抗的產(chǎn)生，結(jié)果顯示，抑制miR-221表達(dá)并使用阿霉素后熒光強(qiáng)度較之前有明顯提升，即腫瘤細(xì)胞凋亡增多，AnnexinⅤ-FITC熒光探針將細(xì)胞凋亡程度與熒光強(qiáng)度相聯(lián)系，從而可獲得更直觀的數(shù)據(jù)。

2.2 MB

MB為多功能熒光探針［4］，最初在1944年用于乳腺癌的診斷，除此之外還可作為光動(dòng)力治療（photodynamic therapy，PDT）材料［9］、組織病理學(xué)染料［10］。MB對(duì)口腔前哨淋巴結(jié)探查有極高的靈敏度，Vishnoi等［10］用MB作為組織病理學(xué)染料對(duì)94例患者進(jìn)行前哨淋巴結(jié)活檢，顯示其鑒定率高達(dá)93.61%。MB熒光的波峰均在可見(jiàn)光范圍內(nèi)，因此其熒光穿透深度淺、背信比低，這些特點(diǎn)極大地影響了其在口腔腫瘤診斷方面的應(yīng)用。

2.3 5-ALA

5-ALA是血紅素合成過(guò)程中的中間物質(zhì)，在血紅素的代謝過(guò)程中5-ALA可以轉(zhuǎn)化為具有熒光性質(zhì)的原卟啉Ⅸ。Zheng等［11］通過(guò)局部噴涂5-ALA探查口腔癌及癌前病變，使用數(shù)字化內(nèi)窺鏡探查患者49例，獲得118張病理學(xué)切片，結(jié)果顯示，5-ALA用于區(qū)分癌前病變組織與正常組織的靈敏度為92%，特異度為96%，用于區(qū)分腫瘤組織與正常組織的靈敏度為98%，特異度為96%，用于區(qū)分癌前病變組織與腫瘤組織的靈敏度為98%，特異度為92%，可以明確區(qū)分腫瘤和炎癥。

NaFL、MB和5-ALA等都是有機(jī)熒光分子，生物相容性較好，能夠快速地從體內(nèi)代謝，但是在可見(jiàn)光范圍內(nèi)，組織對(duì)光的吸收、散射及反射作用較強(qiáng)，因此激光的穿透深度及激發(fā)的熒光信號(hào)強(qiáng)度有限，成像過(guò)程中容易產(chǎn)生背景熒光，降低了目標(biāo)組織與正常組織之間的對(duì)比度，使得成像質(zhì)量受到限制，而NIR熒光探針的光學(xué)特性就在一定程度上避免了這些問(wèn)題。

3 NIR-Ⅰ熒光探針的應(yīng)用

N I R-Ⅰ熒光探針主要包括以吲哚菁綠（indocyanine green，ICG）及其衍生物為代表的菁類有機(jī)探針，早在1970年，ICG就被用于眼科診斷［12］，是NIR類探針中唯一獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)的熒光探針。菁類化合物分子兩端各有一個(gè)氮雜環(huán)，兩個(gè)氮雜環(huán)通過(guò)碳原子共軛鍵（多甲川鍵）相連接［13］，是其光學(xué)特性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

3.1 ICG

ICG為無(wú)毒性水溶性探針?lè)肿?，在靜脈注射后，可迅速與血漿蛋白相結(jié)合并在血管中流動(dòng)，癌組織中的微血管結(jié)構(gòu)紊亂，通透性高，使得隨血流運(yùn)動(dòng)的ICG富集，即實(shí)體瘤的高通透性和滯留效應(yīng)（enhanced permeability and retention effect，EPR），NIR光激發(fā)后在富集區(qū)域發(fā)出明亮熒光，具有較好的穿透力和信噪比。Pan等［14］對(duì)ICG在口腔腫瘤診療過(guò)程中所發(fā)揮的作用進(jìn)行了研究，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，ICG具有極高的生物相容性；在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，48只荷瘤小鼠分為兩組各24只，分別為皮下移植和原位移植模型，注射ICG后12 h，所有荷瘤小鼠的腫瘤區(qū)域均顯示熒光；在包含20例患者的臨床試驗(yàn)中，注射ICG后6 ～ 8 h，所有腫瘤都顯示熒光，靈敏度為100%，并且腫瘤區(qū)域與癌周正常組織的熒光強(qiáng)度有明顯的對(duì)比，術(shù)后對(duì)癌床進(jìn)行檢查發(fā)現(xiàn)4例患者的切緣有ICG熒光殘留，進(jìn)行病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，2例含有殘留癌細(xì)胞，另外2例為假陽(yáng)性，假陽(yáng)性率為50%。

上述研究說(shuō)明ICG對(duì)口腔癌有一定的診斷能力，但是其對(duì)深部軟組織邊界探查能力不足，富集效率有待進(jìn)一步提高且量子產(chǎn)率（quantum yield，QY）較低。因此，許多團(tuán)隊(duì)正在研究將ICG作為熒光基團(tuán)與其他靶向分子結(jié)合及開(kāi)發(fā)其他高QY菁類探針［15］，以期在癌癥診斷、腫瘤邊界確認(rèn)等方面取得突破性進(jìn)展。

3.2 其他菁類熒光探針

目前，其他菁類熒光探針中以IRDye800CW應(yīng)用最為廣泛，可以與單抗體、小分子及肽廣泛地結(jié)合，產(chǎn)生靶向熒光效果，提供超過(guò)5 mm的探查深度［16］。西妥昔單抗-IRDye800CW是第一個(gè)被用于口腔腫瘤診療的靶向探針［17］，可以特異性結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）。Rosenthal等［18］為測(cè)試西妥昔單抗-IRDye800CW的安全性及靈敏度進(jìn)行了一項(xiàng)包含12例患者的臨床試驗(yàn)，靜脈注射不同濃度西妥昔單抗-IRDye800CW懸濁液，結(jié)果顯示，在整個(gè)試驗(yàn)階段沒(méi)有出現(xiàn)2級(jí)以上不良反應(yīng)，且熒光探針對(duì)腫瘤細(xì)胞有極高的特異度，靈敏度達(dá)到100%，證實(shí)了臨床應(yīng)用靶向熒光探針的可行性。

上述探針都屬于NIR-Ⅰ，穿透深度、成像精度還可以進(jìn)一步提升；而組織對(duì)NIR-Ⅱ的光吸收少，引起的光損傷小，同時(shí)光的穿透力也更強(qiáng)，有助于熒光成像獲得更為清晰的信背比、更精細(xì)的空間分辨率。這些特性極大增強(qiáng)了NIR-Ⅱ探針對(duì)腫瘤邊界的探測(cè)能力，因此NIR-Ⅱ熒光探針是目前的研究熱門(mén)。

4 NIR-Ⅱ熒光探針的分類及應(yīng)用

NIR-Ⅱ熒光探針主要包括稀土上轉(zhuǎn)換納米顆粒（upconverting nanoparticle，UCNP）和量子點(diǎn)（quantum dot，QD），具有高達(dá)10 mm的組織穿透力［19］，清晰的信噪比、可靠的空間分辨率等光學(xué)特性增強(qiáng)了熒光探針對(duì)腫瘤探查的精確度，但目前在口腔腫瘤診斷和探查方面的研究還比較有限。

4.1 UCNP熒光探針

UCNP經(jīng)典結(jié)構(gòu)包含基質(zhì)材料及摻雜在其中的稀土元素?；|(zhì)材料主要由氟化物構(gòu)成，可以有效地降低能量損耗，提高發(fā)射光強(qiáng)度。稀土元素標(biāo)志性的原子結(jié)構(gòu)［20］使其具有特殊的光學(xué)特性，常作為上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料中的敏化劑和激活劑使用。經(jīng)光激發(fā)后，UCNP的3種成分會(huì)發(fā)生復(fù)雜的能態(tài)變化，實(shí)現(xiàn)反斯托克斯位移發(fā)光，即低能量（長(zhǎng)波）的光激發(fā)而發(fā)射高能量（短波）熒光。這一特性使得UCNP具有極高的光穩(wěn)定性，不易光漂白，并且斯托克位移較大、發(fā)射峰的寬度小、峰值高等優(yōu)點(diǎn)使得其能有效地規(guī)避來(lái)自激發(fā)光及其他熒光的干擾。

如何提高UCNP較低的QY和熒光強(qiáng)度一直是材料學(xué)家面臨的難題。最近，研究人員發(fā)現(xiàn)將UCNP外再包裹一層由基質(zhì)材料構(gòu)成的外殼，形成核-殼結(jié)構(gòu)，能夠顯著提升探針QY并獲得比之前高百倍的熒光強(qiáng)度，還可以將發(fā)射光調(diào)整到NIR-Ⅱ。Lin等［21］將核-殼結(jié)構(gòu)UCNP、碳原子（C）、金原子（Au）進(jìn)行摻雜，得到熒光探針RENP@C@Au（UCA），探針表面經(jīng)過(guò)短肽c-MET結(jié)合蛋白（c-MET binding peptide，cMBP）修飾后可以靶向OSCC細(xì)胞表面過(guò)表達(dá)的c-MET蛋白。UCA中主要的激活劑為釹（Nd3+），經(jīng)過(guò)NIR光照射后分別在650、1 064 nm處顯示發(fā)射峰。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)［21］結(jié)果顯示，在含有不同濃度UCA的培養(yǎng)基中培養(yǎng)各種腫瘤細(xì)胞系都能保持很高的生存率，并且對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞Cal-27的靶向性最高。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)［21］結(jié)果顯示，經(jīng)靜脈注射后探針能夠在病灶處發(fā)射明亮的熒光信號(hào)，并具有識(shí)別微型病灶（3 mm）的能力。

4.2 QD納米熒光探針

QD通常由Ⅱ ～ Ⅵ、Ⅲ ～ Ⅴ或Ⅳ ～ Ⅵ族元素組成，通過(guò)調(diào)整元素及其比例、納米顆粒大小就可以調(diào)整光學(xué)特性。除此之外，QD的光學(xué)特性十分出色，具有較大的斯托克位移，能夠充分排除來(lái)自激發(fā)光的干擾。窄的發(fā)射峰，使其能屏蔽掉環(huán)境雜波的影響；強(qiáng)的光穩(wěn)定性，可以持續(xù)激發(fā)而熒光強(qiáng)度不會(huì)發(fā)生衰減。

將QD表面修飾后，它也可與短肽、單抗等靶向分子結(jié)合，極大地提高其探查腫瘤組織、劃分腫瘤邊界的能力。Zhu等［22］將Ag2Se與西妥昔單抗結(jié)合為西妥昔單抗-Ag2Se，激發(fā)后可在930 nm波長(zhǎng)處觀察到最大激發(fā)峰，QY為7.3%，在異種移植舌鱗癌細(xì)胞Cal-27的裸鼠身上進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，靜脈注射7 h后可以在腫瘤部位觀察到明顯熒光，于13 h達(dá)到最大強(qiáng)度。

5 小結(jié)

熒光成像技術(shù)在口腔腫瘤探查、術(shù)中引導(dǎo)切除及術(shù)后檢查癌床等方面都具有良好的表現(xiàn)。可見(jiàn)光區(qū)熒光探針雖然有較高的QY、良好的生物相容性，但受制于羸弱的穿透深度和較強(qiáng)的組織反射、吸收，其在臨床使用過(guò)程中受到極大限制。以ICG為代表的NIR-Ⅰ菁類探針是現(xiàn)階段臨床應(yīng)用和研究中的主要探針，激發(fā)后能實(shí)現(xiàn)令人滿意的穿透深度，并且NIR光能夠減少來(lái)自組織的散射、吸收及自熒光等影響成像質(zhì)量的因素。更為重要的是，菁類探針較低的細(xì)胞毒性、良好的生物相容性及快速清除的特點(diǎn)使其滿足臨床轉(zhuǎn)化的首要前提：可靠的安全性。而NIR-Ⅱ探針的研發(fā)正處于起步階段，主要有UCNP、QD等，雖然他們的光學(xué)特性更為突出，但是他們的清除時(shí)間長(zhǎng)，在體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境中有引起潛在不良反應(yīng)的可能性，并且細(xì)胞毒性大，只能通過(guò)對(duì)材料表面進(jìn)行修飾或改性來(lái)提高生物相容性。除此之外，患者及患者腫瘤組織具有異質(zhì)性，往往使得靶向探針的效果大打折扣，今后如何提高其靶向性、實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)治療亦是亟待解決的難題。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。