萬(wàn) 煒,李 應(yīng),黎華君,姚 丹,于瀛龍,韋小平

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展研究所,貴陽(yáng) 550006)

蜜蜂是自然界重要的傳粉者,在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中與植物形成了相互依賴、相互促進(jìn)的協(xié)同進(jìn)化關(guān)系,在后足、絨毛等形態(tài)構(gòu)造上發(fā)生了特化,使其成為最理想的傳粉昆蟲,能夠保障植物的生存與繁衍,促進(jìn)植物遺傳多樣性的形成,是生態(tài)系統(tǒng)中不可或缺的重要組成部分(王華堂等,2022)。自然保護(hù)區(qū)將生態(tài)景觀、野生動(dòng)植物劃定在相對(duì)隔離的區(qū)域內(nèi),以保護(hù)棲息地、物種、亞種和種群的完整,保障生物多樣性和生態(tài)系統(tǒng)多樣性(王昌海,2019;王偉和李俊生,2021)。自然保護(hù)區(qū)在維持野生動(dòng)植物的多樣性上發(fā)揮了重要作用(馬堆芳等,2021;劉鋒等,2022;閆振天等,2022)。

佛頂山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)(簡(jiǎn)稱“佛頂山保護(hù)區(qū)”)位于貴州省銅仁市石阡縣,環(huán)境溫暖濕潤(rùn),雨量充沛,具有明顯的中亞熱帶季風(fēng)山地濕潤(rùn)氣候特征(劉鋒等,2022)。保護(hù)區(qū)以中亞熱帶常綠闊葉林森林生態(tài)系統(tǒng)及其珍稀動(dòng)植物物種為保護(hù)對(duì)象,內(nèi)有蜜粉源植物紫云英Astragalussinicus、刺槐Robiniapseudoacacia、獼猴桃Actinidiachinensis等野生植物2 392種(羅惠寧等,2021),為蜜蜂的生存和繁衍提供了基礎(chǔ)。佛頂山處于武陵山脈和苗嶺山脈之間,北鄰梵凈山、南接雷公山,扮演著生態(tài)廊道的角色,是3個(gè)保護(hù)區(qū)物種基因交流的中間地帶。此前對(duì)這3個(gè)保護(hù)區(qū)的苔蘚植物進(jìn)行比較研究發(fā)現(xiàn)苔蘚植物相似性系數(shù)較接近、親緣關(guān)系較近(楊冰等,2018)。東方蜜蜂群體遺傳研究有涉及到梵凈山、雷公山保護(hù)區(qū),從單個(gè)保護(hù)區(qū)的角度展示了對(duì)蜜蜂資源的保護(hù)作用,但佛頂山保護(hù)區(qū)對(duì)東方蜜蜂遺傳多樣性的保護(hù)效果、在維持保護(hù)區(qū)間的蜜蜂基因交流中的作用仍然未知。

微衛(wèi)星標(biāo)記屬于共顯性遺傳分子標(biāo)記,多態(tài)信息含量高,常被用來(lái)解決形態(tài)標(biāo)記等連續(xù)性數(shù)量標(biāo)記無(wú)法解決的蜜蜂遺傳多樣性問(wèn)題。利用微衛(wèi)星標(biāo)記已明確了我國(guó)云南(Jietal.,2011)、廣西(周姝婧等,2021)、東北(郝璐楠等,2019)等地的東方蜜蜂遺傳多樣性水平。本研究擬利用15個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)貴州佛頂山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)的東方蜜蜂進(jìn)行群體遺傳分析,并與梵凈山和雷公山東方蜜蜂進(jìn)行比較分析,以闡明佛頂山保護(hù)區(qū)東方蜜蜂的遺傳特征、遺傳分化現(xiàn)狀和遺傳多樣性水平,揭示佛頂山保護(hù)區(qū)在東方蜜蜂基因交流上的生態(tài)廊道效應(yīng),為東方蜜蜂種質(zhì)資源保護(hù)與評(píng)價(jià)提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

蜜蜂樣本采自貴州佛頂山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū),該保護(hù)區(qū)位于貴州東北部,介于梵凈山和雷公山之間,與梵凈山、雷公山的距離分別為79 km和108 km。蜜蜂樣本量為168群(表1),樣本采集對(duì)象為健康、群勢(shì)正常、無(wú)外來(lái)引種的蜂群。蜂群全部為非活框原始飼養(yǎng),來(lái)源為野外自然分蜂。樣本采集后用無(wú)水乙醇保存,并放置在-20℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 佛頂山保護(hù)區(qū)東方蜜蜂樣本信息

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

每個(gè)蜂群的樣本取1頭工蜂,利用UNIQ-10柱式試劑盒、2×SanTaq PCR Mix試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]提取蜜蜂胸部基因組。同類研究中使用的微衛(wèi)星位點(diǎn)共有72個(gè)(Takahashietal.,2009;吉挺等,2009;Yuetal.,2019;周姝婧等,2021),根據(jù)其在東方蜜蜂中的多態(tài)性情況,篩選多態(tài)性良好的UN244T、Ac-1、Ac-2、Ac-5、AC011、Ac-26、Ac-35、AP085、AP189、AP313、AT004、AT185、BI314、K0715、UN117共15個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增條件參考Yuetal.(2019),擴(kuò)增產(chǎn)物委托生工生物工程(上海)股份有限公司用ABI 3730xl自動(dòng)測(cè)序儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè),電泳內(nèi)標(biāo)為GeneScanTMLIZ?[500],利用Genemapper 4.0軟件生成電泳圖譜,程序選擇GS500(-250)LIZ,其余程序默認(rèn)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

檢測(cè)獲取的微衛(wèi)星數(shù)據(jù)開(kāi)展遺傳多樣性與遺傳分化的數(shù)據(jù)分析。遺傳多樣性分析中,利用GenAlEx 6.5軟件(Peakall and Smouse,2012)計(jì)算期望雜合度(He)、觀察雜合度(Ho)、等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、香農(nóng)指數(shù)(I)和多態(tài)信息含量(PIC);利用Neestimator 2.01軟件(Doetal.,2014),采用連鎖不平衡方法(臨界值0.05)計(jì)算蜜蜂有效種群大小。在遺傳分化分析中,為了分析佛頂山保護(hù)區(qū)的生態(tài)廊道效應(yīng),引入梵凈山、雷公山同類研究的數(shù)據(jù)開(kāi)展遺傳分化研究(于瀛龍等,2021)。利用Structure 2.3.4軟件(Pritchardetal.,2000)分析遺傳結(jié)構(gòu),K值設(shè)為2～6,每個(gè)K值重復(fù)10次,馬爾可夫鏈重復(fù)次數(shù)設(shè)置為100 000,burn-in設(shè)置為10 000,利用CLUMPP 1.1.2(Jakobsson and Rosenberg,2007)和Distruct 1.1軟件(Rosenberg,2004)繪制圖片。利用R 4.0.5軟件(R Core Team,2016)進(jìn)行主成分判別分析(DACP),保留主成分的80%變異信息,以評(píng)價(jià)3個(gè)自然保護(hù)區(qū)之間的遺傳分化程度。利用GenAlEx 6.5軟件(Peakall and Smouse,2012)計(jì)算遺傳分化系數(shù)(FST)、基因流(Nm)和Nei遺傳距離,并進(jìn)行Mantel Test以評(píng)估遺傳分化與地理距離之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 佛頂山保護(hù)區(qū)東方蜜蜂的遺傳多樣性

佛頂山保護(hù)區(qū)東方蜜蜂在15個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上的平均期望雜合度為0.6948±0.0374、觀察雜合度0.6682±0.0094、等位基因數(shù)10.07±5.55、有效等位基因數(shù)4.06±2.02、香農(nóng)指數(shù)1.5345±0.5060、PIC值0.6552±0.1608,有效種群大小為825.3(396.8～34 974.4)(表2)。

表2 佛頂山保護(hù)區(qū)東方蜜蜂的遺傳多樣性水平

2.2 佛頂山保護(hù)區(qū)東方蜜蜂與鄰近保護(hù)區(qū)的基因交流

Structure分析顯示在K=2～6的假設(shè)下,佛頂山保護(hù)區(qū)與臨近的梵凈山、雷公山保護(hù)區(qū)的東方蜜蜂沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的分組情況,說(shuō)明3個(gè)保護(hù)區(qū)之間的東方蜜蜂沒(méi)有發(fā)生遺傳分化(圖1)。DAPC分析結(jié)果顯示佛頂山保護(hù)區(qū)東方蜜蜂與臨近的雷公山、梵凈山保護(hù)區(qū)聚在一起,沒(méi)有明顯的分離(圖2)。

圖1 佛頂山保護(hù)區(qū)與梵凈山、雷公山保護(hù)區(qū)的東方蜜蜂Structure分析圖

圖2 佛頂山保護(hù)區(qū)與梵凈山、雷公山保護(hù)區(qū)的東方蜜蜂主成分判別分析

佛頂山、梵凈山、雷公山3個(gè)自然保護(hù)區(qū)的東方蜜蜂在15個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上的FST為0.006±0.001(0.001～0.013),Nei遺傳距離介于0.012～0.027,處于無(wú)遺傳分化狀態(tài)。Nm為65.911±15.816(18.631～266.122),基因交流現(xiàn)象明顯。Mantel Test顯示遺傳分化程度與地理距離之間無(wú)相關(guān)關(guān)系(R2=0.0058,P=0.300)(圖3),與高度差異之間無(wú)相關(guān)關(guān)系(R2=0.0065,P=0.250)(圖4)。

圖3 佛頂山、梵凈山、雷公山保護(hù)區(qū)東方蜜蜂遺傳分化與地理距離的Mantel Test分析

圖4 佛頂山、梵凈山、雷公山保護(hù)區(qū)東方蜜蜂遺傳分化與高度差的Mantel Test分析

綜合多種遺傳分析的結(jié)果,佛頂山保護(hù)區(qū)的東方蜜蜂與臨近的梵凈山、雷公山保護(hù)區(qū)之間沒(méi)有發(fā)生遺傳分化,存在暢通的基因交流。

3 結(jié)論與討論

3.1 佛頂山保護(hù)區(qū)東方蜜蜂的遺傳多樣性

通過(guò)與同類研究比較,佛頂山保護(hù)區(qū)東方蜜蜂擁有較高的遺傳多樣性。與臨近的梵凈山、雷公山保護(hù)區(qū)東方蜜蜂相比(于瀛龍等,2021),佛頂山保護(hù)區(qū)東方蜜蜂在15個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上的平均期望雜合度、觀察雜合度、等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、香農(nóng)指數(shù)、PIC值,有效種群大小上均為3個(gè)保護(hù)區(qū)中的最高。與中國(guó)其余地區(qū)東方蜜蜂相比(陳晶等,2008;Jietal.,2011;徐新建等,2013a;徐新建等,2013b;于瀛龍等,2013),佛頂山自然保護(hù)區(qū)東方蜜蜂在Ac-1位點(diǎn)上的PIC為最高,等位基因數(shù)與最高水平持平;在Ac-2位點(diǎn)上的He、PIC、Na為最高;在Ac-5位點(diǎn)上的等位基因數(shù)與最高水平持平;在Ac-26位點(diǎn)上的PIC為最高;在Ac-35位點(diǎn)上的等位基因數(shù)為最高。本研究一方面豐富了佛頂山保護(hù)區(qū)內(nèi)的生物資源研究,一方面體現(xiàn)了自然保護(hù)區(qū)在蜜蜂遺傳多樣性保護(hù)上的積極作用。

佛頂山保護(hù)區(qū)東方蜜蜂的遺傳多樣性較高,主要原因是蜜蜂以大種群形式存在、保護(hù)區(qū)內(nèi)蜜蜂資源保護(hù)良好、保護(hù)區(qū)之間基因交流充分。具體原因包括:(1)佛頂山保護(hù)區(qū)內(nèi)東方蜜蜂有效種群大小為825.3,梵凈山、雷公山保護(hù)區(qū)的有效種群大小分別為561.2和430.8(于瀛龍等,2021),在3個(gè)保護(hù)區(qū)中,佛頂山保護(hù)區(qū)東方蜜蜂有較高的種群規(guī)模,容易形成更高的遺傳多樣性。(2)佛頂山保護(hù)區(qū)內(nèi)東方蜜蜂蜂群全部采用非活框的舊式蜂箱飼養(yǎng),無(wú)人為引種操作,避免了人工育王、引種等外界干擾行為對(duì)蜜蜂群體遺傳的影響。(3)3個(gè)保護(hù)區(qū)之間維持了明顯的基因交流,佛頂山保護(hù)區(qū)位于三者的中間,高強(qiáng)度的基因交流也促進(jìn)了佛頂山保護(hù)區(qū)東方蜜蜂的遺傳多樣性。基于以上因素,佛頂山保護(hù)區(qū)內(nèi)東方蜜蜂得以維持高水平的遺傳多樣性。

3.2 佛頂山保護(hù)區(qū)在東方蜜蜂上的生態(tài)廊道效應(yīng)

綜合多種遺傳分化分析的結(jié)果,佛頂山保護(hù)區(qū)東方蜜蜂與其北側(cè)的梵凈山、南側(cè)的雷公山保護(hù)區(qū)東方蜜蜂沒(méi)有產(chǎn)生遺傳分化,三者基因交流現(xiàn)象明顯,本研究結(jié)果顯示佛頂山保護(hù)區(qū)在梵凈山、雷公山兩個(gè)保護(hù)區(qū)之間起到了重要的生態(tài)廊道的作用。3個(gè)保護(hù)區(qū)沒(méi)有遺傳分化的主要原因?yàn)?3個(gè)保護(hù)區(qū)均自然維持了一定的種群規(guī)模(430.8～825.3),三者之間無(wú)明顯的人為干擾和地理屏障等因素影響基因流,三者距離不超過(guò)110 km,處于蜜蜂可以充分基因交流的距離內(nèi)(郭慧萍等,2016)。

佛頂山保護(hù)區(qū)與梵凈山、雷公山的距離分別為79 km和108 km,3個(gè)自然保護(hù)區(qū)最北端至最南端約為198 km,佛頂山保護(hù)區(qū)位于三者中間,該保護(hù)區(qū)的存在不僅為當(dāng)?shù)貣|方蜜蜂遺傳資源提供了良好的棲息地環(huán)境,維持了豐富的遺傳多樣性,同時(shí)在溝通梵凈山、雷公山東方蜜蜂基因交流上發(fā)揮了不可或缺的作用,利于整體的遺傳多樣性保護(hù)。本研究的結(jié)果揭示在110 km內(nèi)的多個(gè)自然保護(hù)區(qū)的建立,可以維持東方蜜蜂種群的自然基因交流,避免蜂群的近交衰退,有利于蜜蜂遺傳多樣性的維持,可有效的實(shí)現(xiàn)本土蜂種資源的保護(hù)。

致謝：感謝貴州佛頂山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局在本研究中提供的幫助,感謝蜜蜂樣本采集中給予協(xié)助的陳厚羽同志和各位蜂農(nóng)朋友。