李如雪，黃明玥，周 硼，段春迎

（大連理工大學(xué) 化學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116024）

1 引 言

銅離子（Cu2+）是人體中一種重要的金屬離子，在許多生理活動中起著重要作用。但過量的Cu2+會促進活性氧的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致一些神經(jīng)退行性疾病，如帕金森病和阿爾茲海默癥等[1]，人體中積累過量的Cu2+還會損傷肝臟和腎臟[2]?；谝陨显颍鲊鴮λ蠧u2+含量都有嚴(yán)格限制，我國新頒布的《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》（GB 5749-2022）規(guī)定Cu2+含量小于1 mg∕L，這比世界衛(wèi)生組織（WHO）的規(guī)定更為嚴(yán)格。目前Cu2+的常見測試方法主要有原子吸收分光光度法[3]、比色法[4]、電化學(xué)分析法[5]、離子色譜法[6]等，但這些方法通常需要精密的設(shè)備、繁瑣的預(yù)處理過程和較高測試成本。而熒光法具有靈敏度高、操作簡便等優(yōu)點，近些年來廣泛用于金屬離子的檢測[7]。因此構(gòu)建一種低成本、操作簡單的Cu2+檢測體系非常重要。

熒光方法因靈敏度較高常用于微量和痕量物質(zhì)的檢測。相比于單發(fā)射熒光探針[8-10]，比率熒光探針由于具有兩個分辨率良好的發(fā)射峰，其熒光強度之比可以有效消除背景干擾[11-13]，從而引起了廣泛的研究與關(guān)注。而基于碳點[14]（CDs）的比率熒光探針具有優(yōu)異的生物相容性、水溶性和多發(fā)射能力等優(yōu)點[15]，是開發(fā)比率熒光探針的優(yōu)良材料[16]。Jalili 等[17]通過將藍光和黃光CDs 封裝到沸石咪唑鹽框架中，合成了雙發(fā)射金屬有機框架探針（BYCDs@ZIF-8），并應(yīng)用于谷胱甘肽的檢測。Liang 等[18]以二水合檸檬酸鈉和三聚氰胺為原料，通過水熱法制備了具有藍色熒光的水溶性碳點（CDs），與羅丹明B 構(gòu)建了雙發(fā)射比率熒光傳感器，對L-Cys 表現(xiàn)出較 高 的 選 擇 性。 Cao 等[19]通 過 將AuNCs 與CDs@SiO2結(jié)合，開發(fā)了一種比率熒光傳感器，以CDs@SiO2中CDs 的藍色熒光為參考信號，以吸附在SiO2表面的AuNCs 的亮橙黃色熒光為響應(yīng)信號，實現(xiàn)Cu2+和GSH 的熒光傳感檢測。Peng等[20]選取牛血清白蛋白修飾的藍光碳點（BCDs）和紅色的金納米團簇為兩種發(fā)光材料，制備了貴金屬摻雜的熒光探針，實現(xiàn)了對銅離子的比率熒光檢測。目前已報道的比率熒光探針的構(gòu)建大多都較為復(fù)雜，通常引入光穩(wěn)定性較差的熒光染料或貴金屬元素，因此，開發(fā)一種合成簡單、價格便宜、操作便捷的比率熒光檢測方法非常重要。

本文以鄰苯二胺和四硼酸鈉為前驅(qū)體，加入1-甲基-3-烯丙基咪唑溴鹽來促進鄰苯二胺和四硼酸鈉的聚合，采用一步水熱法合成了新型雙發(fā)射碳點（L-CDs），用于水溶液中Cu2+的比率熒光檢測。該比率熒光探針制備方法簡便，無需復(fù)雜的化學(xué)修飾，且可用于真實水樣中Cu2+的檢測。

2 實 驗

2.1 試劑和儀器

鄰苯二胺（o-PD）、四硼酸鈉、1-甲基-3-烯丙基咪唑溴鹽、Fe（NO3）2、Ni（NO3）2、Pb（NO3）2、Na2Cr2O7、Zn（NO3）2、Cu（NO3）2、Mg（NO3）2、Cr-（NO3）3、Co（NO3）2、Ca（NO3）2、AgNO3、Al（NO3）3、NaNO3、Cd（NO3）2，所有試劑均購買自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。以上試劑均未經(jīng)進一步純化。

樣品形貌的表征采用場發(fā)射透射電子顯微鏡F200（日本電子株式會社）。樣品的FT-IR 光譜采用高級傅里葉變換紅外光譜儀IS50（美國賽默飛公司）測試，UV-Vis 光譜采用紫外吸收光譜儀TU-1900（日本高新技術(shù)公司）測量，熒光光譜采用穩(wěn)態(tài)瞬態(tài)熒光磷光光譜儀FLS1000（英國愛丁堡儀器公司）測得。

2.2 L-CDs 的制備

采用一步水熱法制備了L-CDs。將0.2 g o-PD、0.2 g 四硼酸鈉和0.4 g 1-甲基-3-烯丙基咪唑溴鹽溶解在10 mL 去離子水中，超聲10 min，再將混合液密封在聚四氟乙烯內(nèi)襯的高壓釜（25 mL）中，并在180 ℃下加熱10 h。自然冷卻后，將所得懸浮液離心，大顆粒通過濾膜（0.22 μm）除去，多余的小分子使用透析袋（500 u）透析24 h 除去，最后冷凍干燥得到L-CDs。將得到的黃色固體避光干燥保存，以便下一步的實驗。

2.3 Cu2+的檢測

為了驗證L-CDs 對不同金屬離子的選擇性，分 別 將50 μmol∕L 的 物 質(zhì)（Fe（NO3）2、Ni（NO3）2、Pb（NO3）2、Na2Cr2O7、Zn（NO3）2、Cu（NO3）2、Mg-（NO3）2、Cr（NO3）3、Co（NO3）2、AgNO3、Al（NO3）3、NaNO3、Cd（NO3）2等）加 入 到L-CDs 溶 液 中（0.2 mg∕mL，8 mL），在室溫下靜置20 min 后，掃描LCDs 的熒光光譜，觀察L-CDs 溶液的熒光強度變化。進一步研究Cu2+存在下，其他金屬離子對LCDs 的 熒 光 干 擾，在0.2 mg∕mL 的L-CDs 溶 液 和50 μmol∕L Cu2+溶液中加入其他金屬離子（50 μmol∕L），進行抗干擾性實驗。

進一步對L-CDs 進行Cu2+的滴定，在含有LCDs（0.2 mg∕mL）的溶液中，逐漸加入Cu（NO3）2溶液，測量其熒光光譜。實驗在相同條件下重復(fù)3 次。

2.4 實際樣品分析

實際樣品選取為自來水和河水，所有水源樣品都從當(dāng)?shù)孬@得。將一定濃度的Cu2+添加到含有L-CDs（0.2 mg∕mL）的水樣中，并記錄熒光光譜，回收率（%）是測試出Cu2+的量與加標(biāo)樣品的量之比。通過在相同條件下重復(fù)實驗3 次獲得相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

3 結(jié)果與討論

3.1 比率熒光探針構(gòu)建和結(jié)構(gòu)表征

本文通過一步水熱法構(gòu)建了比率熒光探針L-CDs，該雙發(fā)射熒光探針的制備及對Cu2+的檢測如圖1 所示。以鄰苯二胺和四硼酸鈉為前驅(qū)體，在1-甲基-3-烯丙基咪唑溴鹽存在時合成了具有兩種不同發(fā)射波長的熒光納米材料。該材料在380 nm 波長激發(fā)下顯示出在440 nm 和570 nm 處的雙發(fā)射峰，前者在加入Cu2+時熒光逐漸猝滅，而后者的熒光逐漸增強。通過記錄二者的熒光強度比值，可消除非特異性干擾，實現(xiàn)對目標(biāo)分析物Cu2+的檢測。

圖1 L-CDs 的合成及作為Cu2+熒光傳感器示意圖Fig. 1 Schematic diagram of L-CDs synthesis and L-CDs as Cu2+ fluorescence sensor

L-CDs 的形貌和尺寸采用透射電鏡表征（圖2（a））。從圖中可以看出所制備的L-CDs 為準(zhǔn)球形，均勻分散排列[21]，其直徑基本分布在1.8~3.6 nm，平均直徑為2.67 nm（圖2（b））。從HRTEM圖像（圖2（a）插圖）中可以觀察到明顯的晶格條紋，晶格間距為0.21 nm，與石墨碳sp2的衍射平面相吻合。XRD 圖譜中在21.3°附近有較寬的衍射峰，這歸屬于石墨晶體的（002）面[22]，說明L-CDs具有一定的石墨結(jié)構(gòu)（圖2（c））。在拉曼光譜中，1 350 cm-1和1 610 cm-1的特征峰分別代表著D 帶和G 帶，表明L-CDs 除含有sp2雜化外，還存在sp3雜化結(jié)構(gòu)（圖2（d））。

圖2 （a）L-CDs 的TEM 圖 像，插圖：L-CDs 的HRTEM 圖像；（b）L-CDs 的尺 寸 分 布；（c）L-CDs 的XRD 譜；（d）L-CDs 的Raman 光譜；（e）L-CDs 的FT-IR 光譜；（f）L-CDs 的UV-Vis 光譜。Fig. 2 （a）TEM image of L-CDs. Illustration： the HRTEM image of L-CDs. （b）The size distribution of L-CDs. （c）XRD pattern of L-CDs. （d）Raman spectra of L-CDs. （c）FT-IR spectrum of L-CDs. （f）UV-Vis spectrum of L-CDs.

FT-IR 進一步表征了L-CDs 的化學(xué)官能團[23]。如圖2（e）所示，3 400 cm-1處的吸收峰是由N—H拉伸振動形成的，在1 500 cm-1的尖銳吸收峰對應(yīng)于B—O 的伸縮振動，而在2 379 cm-1的吸收峰對應(yīng)O=C=N—的伸縮振動。從紅外光譜可知，B和N 成功摻雜于L-CDs 中，其表面存在大量的含氮和含氧基團[24]，例如胺基、羥基、羰基和羧基[25]。

3.2 L-CDs 的光學(xué)性質(zhì)

采用UV-Vis 光譜和熒光光譜探究L-CDs 的光學(xué)特性。以羅丹明B 為參比物質(zhì)，根據(jù)公式：

其中，YU、YS表示待測物質(zhì)和參比物質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率，F(xiàn)U、FS表示待測物質(zhì)和參比物質(zhì)的積分熒光強度，AU、AS表示待測物質(zhì)和參比物質(zhì)在該激發(fā)波長的入射光的吸光度，計算L-CDs 的量子產(chǎn)率為6.51%。紫外可見光譜（圖2（f））顯示，L-CDs 在220 nm 和280 nm 處分別有一強吸收帶和弱吸收帶，其中220 nm 處的強吸收源于C=C sp2結(jié)構(gòu)域的π-π*躍遷，280 nm 處的吸收來自于C=N∕C=O 鍵 的n-π*躍 遷，這 表 明L-CDs 具 有 一 定 的 共 軛結(jié)構(gòu)[26]。

利用熒光光譜研究了激發(fā)波長在350～420 nm 時L-CDs 的熒光發(fā)射現(xiàn)象（圖3）。從圖中可以看出L-CDs 的發(fā)射光譜隨激發(fā)波長變化，當(dāng)激發(fā)波長從350 nm 增加到390 nm 時，440 nm 處的熒光發(fā)射峰逐漸下降并伴有輕微紅移，同時570 nm處的發(fā)射峰強度逐漸增加。當(dāng)激發(fā)波長大于400 nm 時，碳點的發(fā)射峰主要在570 nm。在380 nm的激發(fā)下，L-CDs 顯示出藍、黃雙發(fā)射現(xiàn)象（圖S2）。

圖3 L-CDs 的熒光發(fā)射光譜Fig. 3 Fluorescence emission spectra of L-CDs

進一步研究了不同外界環(huán)境對L-CDs 雙發(fā)射熒光的影響。在380 nm 的紫外燈長時間（120 min）照 射 下（圖S3（a）），L-CDs 的 熒 光 強 度 比（F570∕F440）基本保持不變，顯示出了L-CDs 良好的抗光漂白性能。在高濃度的NaCl 溶液中（100 mmol∕L）[27]，F(xiàn)570∕F440的變化也可忽略（圖S3（b））。pH 值的影響如圖S3（c）所示，在pH = 4~11 范圍內(nèi)，F(xiàn)570∕F440的值較為穩(wěn)定。但在強酸或強堿溶液中，L-CDs 的 熒 光 強 度 發(fā) 生 了 變 化，導(dǎo) 致F570∕F440的比值減小。這可能是由于在強酸或強堿性環(huán)境中，L-CDs 表面豐富的氮、氧基團（氨基、羥基等）的質(zhì)子化和去質(zhì)子化導(dǎo)致L-CDs 的表面狀態(tài)發(fā)生了變化，從而影響L-CDs 的熒光。綜上，L-CDs 可以在一定的環(huán)境變化中保持穩(wěn)定，從而為熒光檢測體系的構(gòu)建提供了基礎(chǔ)。

3.3 L-CDs 對Cu2+的熒光響應(yīng)

L-CDs 熒光探針的選擇性和抗干擾能力如圖4 所示。大部分金屬離子對L-CDs 熒光幾乎沒有影響（圖4（a））。但Ag+、Cr2O72-和NaClO 較為特殊，Ag+可以使L-CDs 在570 nm 處的熒光猝滅；Cr2O72-由于內(nèi)濾作用，可以使L-CDs 在440 nm 處的熒光猝滅，從而影響到570 nm 處的熒光強度；NaClO 由于具有漂白性使L-CDs 的熒光猝滅。而經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)，Ag+、Cr2O72-和NaClO 對L-CDs 熒光強度比（F570∕F440）的影響可以忽略不計（圖4（b））。顯然，與單發(fā)射探針相比，比率探針可有效排除一些共存物質(zhì)的影響，顯示出更高的選擇性。

圖4 （a）L-CDs 對一些離子的熒光響應(yīng)；（b）L-CDs 對一些離子的熒光響應(yīng)（F570∕F440）；（c）Cu2+存在下L-CDs 對金屬離子的熒光響應(yīng)；（d）Cu2+存在下L-CDs 對金屬離子的熒光比（F570∕F440）。Fig. 4 （a）Fluorescence response of L-CDs to different ions. （b）Fluorescence response（F570∕F440） of L-CDs to different ions. （c）Fluorescence responses of L-CDs to different metal ions in the presence of Cu2+. （d）Fluorescence response（F570∕F440） of L-CDs to different metal ions in the presence of Cu2+.

L-CDs-Cu2+體系的抗干擾性[28]如圖4（c）所示，當(dāng)其他常用金屬離子的濃度與Cu2+濃度（50 μmol∕L）相同時，L-CDs 的熒光強度基本保持不變，F(xiàn)570∕F440的比值也沒有明顯變化（圖4（d）），表明這些干擾離子的存在不影響L-CDs 對Cu2+的檢測，所構(gòu)建的熒光檢測體系具有良好的抗干擾能力，為檢測實際樣品中的Cu2+提供了保證。

為了優(yōu)化L-CDs 檢測Cu2+的反應(yīng)條件，研究了L-CDs 初始濃度和pH 對檢測的影響。對于不同初始濃度（0.05，0.10，0.20，0.30，0.40 mg∕mL）的探針（圖S4（a）），在一定濃度的Cu2+溶液中，F(xiàn)570∕F440隨著初始濃度的增加先增大后減小。對于酸和堿對檢測體系的可能影響，引入了不同的pH 值（2~13）（圖S4（b））。當(dāng)pH 在3~10 之間，酸堿性對檢測體系基本無影響。因此，下文以0.20 mg∕mL 的L-CDs 濃度、pH=7 為反應(yīng)條件。

進一步研究了探針的熒光強度比與不同濃度的Cu2+溶液（40~244 μmol∕L）的響應(yīng)之間的關(guān)系（圖5）。將一定濃度的Cu2+溶液逐漸滴加到LCDs 水溶液中，可以觀察到，隨著Cu2+濃度從40 μmol∕L 增 加 到244 μmol∕L，L-CDs 在440 nm 處 的熒光發(fā)射強度持續(xù)下降，同時570 nm 處的發(fā)射強度逐漸增強。將熒光信號比（F570∕F440）與Cu2+濃度作圖（圖5 插圖），通過線性擬合, Cu2+濃度在40~244 μmol∕L 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2= 0.995，回 歸 方 程 為F570∕F440= 17.763x-0.3598。通過檢出限（LOD）計算公式：

圖5 L-CDs 對 不 同 濃 度Cu2+（40~244 μmol∕L）的 熒 光 響應(yīng)，插圖：F570∕F440與Cu2+濃度的線性關(guān)系。Fig.5 Fluorescence emission spectra of L-CDs with different Cu2+ concentrations. Illustration： the linear relationship between F570∕F440 and concentrations of Cu2+ranging from 40 to 244 μmol∕L.

其 中，σ表 示 空 白L-CDs 的 標(biāo) 準(zhǔn) 差，S表 示 校 準(zhǔn) 曲線的斜率，得出L-CDs 的LOD 為0.61 μmol∕L。與一些已報道的熒光檢測方法相比（表1），本方法在合成過程中避免了貴金屬的使用，在構(gòu)建比率熒光檢測體系的過程中避免了復(fù)雜的比率探針構(gòu)建。對比有機小分子探針，該探針避免了光漂白且檢測Cu2+的線性范圍較寬等，為比率熒光檢測Cu2+提供了一個新的思路。

表1 與其他熒光檢測Cu2+方法的比較Tab.1 Comparison with other fluorescence methods for detecting Cu2+

3.4 L-CDs 對Cu2+的響應(yīng)機理

目前，熒光探針和目標(biāo)物之間的作用機理大致可分為光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（PET）、內(nèi)濾作用（IFE）和熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）等[35]。如圖6（a）所示，L-CDs 的Zeta 電位為-13.8 mV，加入Cu2+后整個系統(tǒng)的電位為+11.7 mV，這可能是由于L-CDs表面帶負電，與Cu2+存在一定的靜電作用，從而改變了整個系統(tǒng)的電位。進一步研究所制備的LCDs 和Cu2+之間可能的相互作用機理，研究了其熒光光譜、紫外-可見光譜等。從圖5 中可以看出，在加入Cu2+后，L-CDs 在440 nm 處的熒光逐漸猝滅，而570 nm 處的熒光峰強度逐漸增加，可能存在能量轉(zhuǎn)移過程。針對該熒光現(xiàn)象，首先研究了相關(guān)UV-Vis 光譜。如圖6（b）所示，Cu2+在250 nm 后幾乎沒有紫外吸收，所以與L-CDs 的激發(fā)發(fā)射光譜基本無重疊。但在L-CDs 溶液中添加Cu2+后，在420 nm 左右出現(xiàn)了一個新的吸收峰，這一新的吸收峰歸因于L-CDs 和Cu2+形成了新的絡(luò)合物[17]，而該峰與L-CDs 的發(fā)射光譜有重疊（圖6（c）），因此推測L-CDs 的猝 滅可能是由IFE 或FRET 引起的。

圖6 （a）L-CDs、L-CDs+Cu2+的Zeta 電位；（b）Cu2+、L-CDs、L-CDs+Cu2+的UV-Vis 光譜；（c）L-CDs+Cu2+的UV-Vis 光譜和LCDs 的Em 光譜；（d）L-CDs 和L-CDs+Cu2+的熒光壽命衰減曲線。Fig. 6 （a）Zeta potential of L-CDs and L-CDs+Cu2+. （b）UV-Vis spectra of Cu2+，L-CDs and L-CDs+Cu2+. （c）UV-Vis spectra of L-CDs+Cu2+and Em spectra of L-CDs. （d）Fluorescence lifetime attenuation curves of L-CDs and L-CDs+Cu2+.

對于IFE，猝滅劑的存在不會改變熒光分子激發(fā)態(tài)的壽命[36]。因此，進一步測試了添加Cu2+前后L-CDs 的熒光壽命，以驗證其猝滅機制。熒光壽命衰減曲線如圖6（d）所示，在Cu2+不存在和存在的情況下，熒光壽命分別為6.49 ns 和5.56 ns，即添加Cu2+后熒光壽命發(fā)生了明顯變化，表明猝滅機理不可能歸因于IFE，而可能是FRET。從結(jié)構(gòu)上看，由于L-CDs 表面含有—NH2和—BOH，Cu2+可以與L-CDs 配位形成復(fù)合物，而且Cu2+和L-CDs 之間的靜電作用有效縮短了LCDs 之間的距離，促進能量轉(zhuǎn)移的發(fā)生。因而使L-CDs 顯示出隨著Cu2+濃度的增加，在440 nm 處的熒光強度減弱、570 nm 處的熒光強度增強并紅移到580 nm 的熒光現(xiàn)象。基于上述實驗結(jié)果，L-CDs 與Cu2+的作用機理是復(fù)合物的形成和FRET。

3.5 L-CDs 的實際樣品檢測

最后，通過檢測加標(biāo)水樣（自來水和河水）中的Cu2+，評估了比率熒光探針L-CDs 實際應(yīng)用的可行性[37]，結(jié)果如表2所示。可以觀察到，該方法在自來水中得到的平均回收率在100.40%~101.40%之間，RSD小于3.6%。用同樣的方法檢測河水樣品，得到的回收率在99.39%~101.80%之間，RSD 小于2.6%。這些結(jié)果表明比率熒光探針L-CDs 構(gòu)建的熒光檢測體系有應(yīng)用于實際樣品中Cu2+分析的可行性。

4 結(jié) 論

本文通過一步水熱法成功制備了用于高選擇性檢測Cu2+的比率熒光探針L-CDs，并且熒光檢測體系的構(gòu)建沒有任何進一步修飾。L-CDs在440 nm 和570 nm 處具有雙發(fā)射峰，Cu2+的加入可以使440 nm 處的熒光強度降低、而570 nm處的熒光強度增加。Cu2+濃度在0.04~0.244 mmol∕L 范 圍 內(nèi)，與 熒 光 信 號（F570∕F440）呈 線 性 相關(guān)，LOD 為0.61 μmol∕L。并 且L-CDs 對Cu2+的檢測表現(xiàn)出高選擇性和抗干擾性。將制備的LCDs 應(yīng)用于真實水樣中Cu2+的測定，表現(xiàn)出良好的回收率。與已報道的Cu2+熒光探針相比，制備的L-CDs 具有成本低、合成簡單、操作方便的優(yōu)點，為比率熒光的構(gòu)筑及應(yīng)用提供了一個新的思路。

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