柳 寒

（龍巖市永定區(qū)種子技術(shù)推廣站，福建 龍巖 364100）

油菜是我國重要的油料作物，是世界三大植物油來源之一。油菜的多功能利用開發(fā)是貫徹落實農(nóng)業(yè)供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革、推進(jìn)農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展要求的重要舉措，有利于油菜產(chǎn)業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。其中油菜花的觀賞性能在鄉(xiāng)村旅游及美麗鄉(xiāng)村建設(shè)中發(fā)揮了重要作用。隨著油菜花色的不斷豐富，人們將選育出的不同花色油菜品種或者品系運用到美麗鄉(xiāng)村建設(shè)、創(chuàng)意農(nóng)業(yè)中，推動了農(nóng)旅融合的發(fā)展[1-3]，打造了許多鄉(xiāng)村振興示范典型。

彩色油菜的進(jìn)一步推廣應(yīng)用對其花色穩(wěn)定性和菜籽油品質(zhì)等性狀提出了更高的要求，揭示彩色油菜花色形成和調(diào)控機理，找出相關(guān)的調(diào)控因子，有助于培育穩(wěn)定的彩色油菜品系，有利于利用分子輔助育種快速地將彩色性狀導(dǎo)入到其他品質(zhì)優(yōu)良的油菜品種中。有研究報道，彩色油菜花瓣中含有大量花青素，花青素可能是影響油菜呈色的重要因子[4]，本研究克隆了不同花色油菜中花青素合成酶基因ANS 序列并進(jìn)行分析，期望能為解析彩色油菜成色機理和彩色油菜分子標(biāo)記輔助育種提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗所用的彩色油菜品系（紅色、橙色、土黃、黃色和白色）由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物與核技術(shù)利用研究所油菜育種與栽培研究室提供。

1.2 不同花色甘藍(lán)型油菜中ANS 基因的克隆

利用擬南芥中的ANS基因（Gene ID：AT4G22880）序列在甘藍(lán)型油菜數(shù)據(jù)庫（http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/）中進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)甘藍(lán)型油菜中ANS 基因存在4 個拷貝，分別為BnaA01g12530D、BnaA03g45610D、BnaC01g14310 D、BnaC07g37670D。根據(jù)這4 個基因的序列設(shè)計4 對引物見表1，用于克隆不同花色油菜中ANS 基因的DNA 序列。使用CTAB法提取紅、橙、土黃、黃和白5種不同顏色油菜的基因組DNA。使用高保真酶TransStart FastPfu DNA Polymerase（北京全式金生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)）進(jìn)行PCR 擴增，PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性1 min；95℃變性20 s，58℃退火20 s，72 ℃延伸1 min，36 個循環(huán)后，于72℃延伸5 min。將克隆得到的產(chǎn)物連入pEASY-Blunt 載體（北京全式金生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)）中，構(gòu)建測序中間載體，進(jìn)行序列測定。

表1 甘藍(lán)型油菜中ANS基因不同拷貝克隆引物Tab.1 Cloning primers for different copies of ANS gene in Brassica napus

1.3 不同花色甘藍(lán)型油菜中ANS 基因序列的分析

使用Sequencher 軟件和DNAMAN 軟件進(jìn)行序列拼接和序列比對分析。

1.4 ANS基因在不同花色油菜中的表達(dá)分析

取紅、橙、土黃、黃和白5種不同顏色油菜花瓣，使用液氮研磨后分別取80 mg 使用RNA 提取試劑盒QIAGEN RNeasy Plant Mini kit（Qiagen 公司生產(chǎn)）提取總RNA。取2 μg RNA使用TransScript One-Step gDNA Remover and cDNA Synthesis試劑盒（北京全式金生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)）參照試劑盒說明書合成第一鏈cDNA。以BnActin2 作為內(nèi)標(biāo)，使用油菜中ANS 基因4 個拷貝的克隆引物進(jìn)行半定量PCR 分析。PCR 反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，35個循環(huán)后，于72℃延伸10 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同花色油菜ANS基因的克隆與序列比較分析

甘藍(lán)型油菜中ANS 基因存在4 個拷貝，分別為BnaA01g12530D，BnaA03g45610D、BnaC01g14310D、BnaC07g37 670D，不同花色材料中的ANS 基因4個不同拷貝編碼區(qū)序列分析結(jié)果顯示，BnaA01g12530D 在不同花色材料中的序列均與甘藍(lán)型油菜基因組數(shù)據(jù)庫中的參考序列一致；BnaA03g45610D 在白色花材料中未擴增出條帶，在其他4 種花色油菜中的序列各不相同，其中紅色材料與CK（數(shù)據(jù)庫中參考序列）相比存在23 個SNP 差異，橙色與CK 相比存在21 個SNP 差異，土黃與CK 相比存在22 個SNP 差異，黃色則與CK完全一致見圖1BnaC01g14310D 在不同花色材料中的序列均與甘藍(lán)型油菜基因組數(shù)據(jù)庫中的參考序列一致；BnaC07g376 70D在不同花色材料中的序列分為兩組，其中紅、橙、黃、白一組（序列1），與參考序列相比存在32 個SNP 差異，土黃一組（序列2），與參考序列（CK2）一致，比對結(jié)果見圖2。從以上不同拷貝基因編碼區(qū)測序的結(jié)果分析可以看出，ANS 基因的BnaA03g45610D 拷貝和BnaC07g37670D 拷貝在不同花色材料中的序列變異較大，其中BnaA03g45610D 拷貝在不同花色材料中序列均不相同，可能與花色存在關(guān)聯(lián)，其他拷貝序列差異和花色并無明顯關(guān)聯(lián)。

圖1 BnaA03g45610D在不同花色油菜材料中的序列比對結(jié)果Fig.1 Sequence alignment results of BnaA03g45610D in rapeseed materials of different flower colors

圖2 BnaC07g37670D在不同花色油菜材料中的序列比對結(jié)果Fig.2 Sequence alignment results of BnaC07g37670D in rapeseed materials of different flower colors

2.2 ANS基因BnaA03g45610D 拷貝在不同花色油菜中的進(jìn)一步驗證

為了進(jìn)一步驗證ANS 基因BnaA03g45610D 拷貝在不同花色材料中的序列特異性，取不同系列紅、橙、黃、土黃花色油菜的葉片，其中紅色油菜材料取樣3 種，分別為紅156、紅185 和紅191；橙色油菜取樣2 種，分別為橙905 和橙906；黃色油菜材料取樣3 種，分別為浙油51、浙油50 和B57；土黃油菜1 種，為EM29。使用CTAB 法提取DNA，以H15 和H16 為克隆引物進(jìn)行克隆測序。序列分析結(jié)果顯示，不同系列紅、橙、黃、土黃花色油菜中BnaA03g45610D 拷貝編碼區(qū)序列均分別與上述紅、橙、黃、土黃中的BnaA03g45610D 拷貝測序結(jié)果一致，可見，ANS 基因的BnaA03g45610D 拷貝在不同花色油菜中的序列具有特異性。

2.3 不同花色油菜花瓣中ANS基因的表達(dá)分析

ANS基因4個不同拷貝在不同花色材料中的序列變異情況存在差別，為了明確其在不同花色材料中的表達(dá)情況，以油菜BnActin2為內(nèi)標(biāo)，對不同花色油菜花瓣中的ANS基因做了半定量PCR 分析，結(jié)果見圖3。從圖3 可以看出，ANS 基因的BnaA03g45610D 和BnaC07g37670D 拷貝在紅色和橙色油菜材料花瓣中的表達(dá)量與其他花色油菜相比存在差異，其中BnaA03g45610D拷貝的表達(dá)差異更為明顯。其他2個拷貝在5種不同花色油菜花瓣中均未檢測到明顯表達(dá)。

圖3 ANS基因在不同花色油菜花瓣中的表達(dá)分析Fig.Expression analysis of ANS gene in different flower colors of rapeseed petals

3 討論

花青素是除胡蘿卜素及生物堿類之外的重要成色因子之一，有研究顯示彩色油菜中紅色、橙色油菜花瓣中主要色素成分為花青素，ANS 是花青素合成代謝路徑晚期非常關(guān)鍵的酶，其與植物中花青素的積累及植物的呈色有著直接的關(guān)系[5]。通過序列比對分析發(fā)現(xiàn)，ANS基因在油菜中存在4個拷貝。本研究分別克隆了5種不同花色油菜ANS基因的4個拷貝，發(fā)現(xiàn)只有BnaA03g45610D 和BnaC07g37670D 拷貝在不同花色材料中的序列變異較大，BnaA01g12530D 和BnaC01g143 10D 拷貝在不同花色材料中的序列均和參考序列完全一致。 其中BnaA03g45610D 拷貝在不同花色油菜中的序列各不相同，可用于區(qū)分花色。4個不同拷貝的cDNA全長半定量PCR 分析結(jié)果顯示，同樣只有BnaA03g45610D和BnaC07g376 70D 拷貝在不同花色材料花瓣中顯示出表達(dá)差異，且BnaA03g45610D拷貝在不同花色中的表達(dá)差異更為明顯。由此可見，ANS 基因的BnaA01g12530D 和BnaC01g14310D 拷貝可能在進(jìn)化上較為保守，BnaA03g45610D 和BnaC07g37670D 拷貝則更容易產(chǎn)生變異，同時存在調(diào)控上的差異，很可能在彩色油菜花成色中發(fā)揮著重要作用。本研究為解析彩色油菜成色機理和彩色油菜分子標(biāo)記輔助育種提供了參考。