張 誼，王立暉，陳月芳，李永金，柳浦青

（1.南通大學(xué)附屬丹陽醫(yī)院，江蘇省丹陽市人民醫(yī)院，江蘇 丹陽 212300；2.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，浙江 杭州 310005）

鉛是一種普遍存在于環(huán)境中的重金屬。長期接觸鉛可使神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生不可逆損傷，導(dǎo)致學(xué)習(xí)和記憶功能減退［1］。在模擬阿爾茨海默病研究中，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡可改善大鼠行為和認(rèn)知功能［2］；而抑制自噬對(duì)小鼠神經(jīng)元具有保護(hù)作用［3］，表明神經(jīng)系統(tǒng)損傷過程中存在細(xì)胞凋亡與自噬。

沉默信息調(diào)節(jié)因子1（sirtuin1，Sirt1）是一種脫乙酰酶，可通過激活下游底物——叉頭框蛋白轉(zhuǎn)錄因子3a（forkhead box O3a，F(xiàn)oxO3a）介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的生成、凋亡與自噬［4-5］。重金屬錳暴露可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞中Sirt1 蛋白降解，促使FoxO3a 蛋白表達(dá)上調(diào)及乙?；皆黾?，誘導(dǎo)細(xì)胞損傷［6］。在H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性反應(yīng)中，阻斷Sirt1/FoxO3a 信號(hào)途徑可抑制細(xì)胞促凋亡蛋白和自噬蛋白的表達(dá)，減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷［7］，表明Sirt1/FoxO3a 信號(hào)通路參與了細(xì)胞凋亡和自噬。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)細(xì)胞的損傷伴隨氧化應(yīng)激與細(xì)胞凋亡［8］，但目前仍不清楚鉛暴露是否可誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬。

本研究選用大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12 細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，建立醋酸鉛〔Pb（Ac）2〕暴露細(xì)胞模型，探討鉛暴露對(duì)PC12 細(xì)胞凋亡與自噬的作用及其與Sirt1/FoxO3a信號(hào)通路之間的關(guān)系，為研究及預(yù)防鉛神經(jīng)毒性相關(guān)性疾病提供實(shí)驗(yàn)支持與理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑和儀器

大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12 細(xì)胞株，中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶、單丹磺酰尸胺（monodansylcadaverine，MDC）試劑盒，美國Gibco公司；新生牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司；Pb（Ac）2，美國Sigma 公司；MTT，美國Amresco 公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所；吖啶橙/溴化乙錠（acridine orange/ethidium bromide，AO/EB）試劑盒，北京Solarbio 公司；Annexin V/PI凋亡檢測(cè)試劑盒，美國Molecular Probes 公司。兔抗人Sirt1、FoxO3a、叉頭蛋白M1（forkhead box protein M1，F(xiàn)oxM1）和P62 蛋白多克隆抗體，美國ImmunoWay 公司；兔抗大鼠Bcl-2 相互作用蛋白1（Bcl-2 interacting coiled-coil protein 1，Beclin1）多克隆抗體，武漢ABclonal 公司；兔抗小鼠微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）多克隆抗體，美國Proteintech公司；小鼠抗人GAPDH 單克隆抗體、山羊抗兔IgG二抗、山羊抗鼠IgG 二抗，美國GeneTex 公司；顯影劑，美國Millipore 公司。其余試劑均為市售國產(chǎn)分析純。

SW-CJ-2G 型超凈臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備總廠；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，上海Heal Force 公司；CKX53 型倒置顯微鏡，日本Olympus 公司；UPK-I-10T 型超純水機(jī)，成都超純科技有限公司；CP124S型電子分析天平，德國賽多利斯公司；680型酶標(biāo)儀和1658001 型電泳儀，美國Bio-Rad公司；凝膠成像系統(tǒng)，南京麥高德生物科技公司；X1R 型冷凍離心機(jī)，美國Thermo Fisher 公司；Axio Scope A1 型熒光顯微鏡，德國Carl Zeiss公司；2400F超聲波粉碎機(jī)，新芝生物科技公司；FACS CantoⅡ型流式細(xì)胞儀，美國BD公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組處理

PC12 細(xì)胞置高糖DMEM 培養(yǎng)基中，置于含5%的CO2和95%空氣的37 ℃培養(yǎng)箱中孵育，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞分為細(xì)胞對(duì)照組（空白培養(yǎng)基）和Pb（Ac）2100，200 和400 μmol·L-1組，給予Pb（Ac）2暴露24 h后，收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT 法和比色法檢測(cè)細(xì)胞存活率和細(xì)胞外液LDH含量

取對(duì)數(shù)生長期的PC12 細(xì)胞接種于96 孔板中，按1.2 分組處理后，棄去上清，每孔加入10 μL MTT 0.5 g·L-1，于37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后棄去培養(yǎng)液，加入100 μL DMSO，振勻后于490 nm 處測(cè)定各孔吸光度（A490nm）值。細(xì)胞存活率（%）=（1-處理組A490nm/細(xì)胞對(duì)照組A490nm）×100%。

按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，收集1.2 分組細(xì)胞上清液，在波長450 nm 處檢測(cè)各孔吸光度（A450nm）值，計(jì)算各組LDH含量。

1.4 AO/EB染色觀察細(xì)胞凋亡

取對(duì)數(shù)生長期PC12 細(xì)胞接種于6 孔板中，按1.2 分組處理后，棄培養(yǎng)液并用PBS 洗滌2 次，在各孔加入2 mL 按比例配制好的AO/EB 混合染液，4 ℃避光反應(yīng)10 min，將6 孔板置于熒光顯微鏡下，每組隨機(jī)挑選10 個(gè)視野，觀察各組細(xì)胞染色情況，核染色質(zhì)呈橙紅色熒光的為凋亡細(xì)胞。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

取1.2 分組處理的細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS 洗2 遍后加入400 μL 緩沖液，輕輕混勻細(xì)胞，再加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI 溶液，避光孵育15 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.6 MDC染色法觀察細(xì)胞自噬

取對(duì)數(shù)生長期PC12 細(xì)胞接種于裝有玻璃片的6 孔板中，按1.2 分組處理后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌，加入MDC 染料室溫避光染色30 min。吸去染料后，加入4%多聚甲醛固定10 min，待玻璃片晾干后置于熒光顯微鏡下觀察。自噬細(xì)胞出現(xiàn)綠色自噬空泡，以綠色熒光強(qiáng)度表示細(xì)胞自噬程度。

1.7 免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Beclin1的表達(dá)

取1.2收集的細(xì)胞，用0.3% Triton X-100透化，羊血清封閉后，滴加抗Beclin-1 抗體（1∶300），4 ℃搖床反應(yīng)過夜；用PBS 洗滌后加入山羊抗兔IgG二抗（1∶600），37 ℃避光反應(yīng)1 h，甘油封片后置熒光顯微鏡下觀察。當(dāng)細(xì)胞自噬時(shí)，Beclin1蛋白呈點(diǎn)狀聚集，以熒光強(qiáng)度反映Beclin1的表達(dá)水平。

1.8 Western 印跡法檢測(cè)細(xì)胞Sirt1，F(xiàn)oxO3a，F(xiàn)oxM1，Beclin1，LC3和P62蛋白表達(dá)水平

取1.2 收集的細(xì)胞，加入裂解液裂解提取總蛋白，并用試劑盒測(cè)定蛋白濃度?？偟鞍捉?jīng)電泳分離并轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用脫脂奶粉封閉，繼而與一抗（Sirt1，F(xiàn)oxO3a，F(xiàn)oxM1，Beclin1，LC3 和P62 均1∶1000；GAPDH，1∶7000）于4 ℃搖床反應(yīng)過夜。洗滌數(shù)次后，將膜和相應(yīng)山羊抗兔、山羊抗鼠IgG二抗（1∶5000）在室溫下反應(yīng)1 h，加入顯影劑，在凝膠成像系統(tǒng)上進(jìn)行掃描并拍照，Image J 軟件分析各條帶積分吸光度值。以目標(biāo)蛋白與GAPDH 的積分吸光度值比值表示目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量，LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)比值表示細(xì)胞自噬水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Pb（Ac）2對(duì)PC12 細(xì)胞存活率和細(xì)胞外液LDH含量的影響

MTT 法檢測(cè)結(jié)果如圖1A所示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，處理24 h 后，Pb（Ac）2100，200 和400 μmol·L-1組PC12 細(xì)胞存活率均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。如圖1B所示，Pb（Ac）2可引起PC12細(xì)胞外液LDH 含量增加。與細(xì)胞對(duì)照組相比，Pb（Ac）2100，200 和400 μmol·L-1組細(xì)胞外液LDH 含量均顯著增加（P＜0.05，P＜0.01），表明Pb（Ac）2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷。

Fig.1 Effect of lead acetate（Pb（Ac）2）on cell viability（A）and lactate dehydrogenase（LDH）content（B）in extracellular fluid of PC12 cells by MTT and colorimetry. After exposure to Pb（Ac）2 0（cell control），100，200 and 400 μmol·L-1 at 37 ℃for 24 h，cell viability and LDH content in extracellular fluid were determined. Cell viability（%）=（1-A490 nm of treatment group/A490 nm of cell control group）×100%.±s，n=5.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

2.2 Pb（Ac）2對(duì)PC12細(xì)胞凋亡的影響

PC12 細(xì)胞經(jīng)Pb（Ac）2處理24 h 后經(jīng)AO/EB雙染色，凋亡的細(xì)胞表現(xiàn)出AO/EB 染色雙陽性，熒光疊加后呈現(xiàn)出均勻一致的橙紅色圓形；而對(duì)照組細(xì)胞AO 染色均勻，且?guī)缀鯚oEB 染色陽性，表明無明顯凋亡（圖2）。

流式檢測(cè)結(jié)果如圖3 所示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，Pb（Ac）2100，200 和400 μmol·L-1組細(xì)胞凋亡率均顯著升高（P＜0.01），表明Pb（Ac）2可誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡。

Fig.3 Effect of Pb（Ac）2 on apoptotic rate of PC12 cells detected by flow cytometry. See Fig.1 for the cell treatment. B was the quantitative result of A. ±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

2.3 Pb（Ac）2對(duì)PC12細(xì)胞自噬的影響

如圖4A 所示，細(xì)胞對(duì)照組細(xì)胞幾乎未見熒光和自噬泡，Pb（Ac）2100 μmol·L-1組細(xì)胞內(nèi)熒光雖弱但自噬泡已開始出現(xiàn)，Pb（Ac）2200 μmol·L-1組MDC點(diǎn)狀熒光信號(hào)顯著增強(qiáng)，Pb（Ac）2400 μmol·L-1組細(xì)胞周圍呈強(qiáng)烈綠色熒光，提示細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量自噬空泡。定量結(jié)果（圖4B）表明，與細(xì)胞對(duì)照組相比，Pb（Ac）2各濃度組熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)（P＜0.01），表明Pb（Ac）2染毒后PC12細(xì)胞自噬增強(qiáng)。

Fig.4 Effect of Pb（Ac）2 on autophagy of PC12 cells determined by monodansylcadaverine staining. See Fig.1 for the cell treatment. B was the quantitative result of A. ±s，n=3. ＊＊P＜0.01，compared with cell control group. The arrows indicate autophagic bubbles.

2.4 Pb（Ac）2對(duì)PC12細(xì)胞Beclin1定位的影響

圖5所示，細(xì)胞對(duì)照組Beclin1在細(xì)胞質(zhì)微弱表達(dá)，Pb（Ac）2200 μmol·L-1組細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中Beclin1表達(dá)明顯增強(qiáng)，Pb（Ac）2400 μmol·L-1組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Beclin1 呈現(xiàn)大量點(diǎn)狀聚集且熒光強(qiáng)度加強(qiáng)。表明細(xì)胞發(fā)生了明顯自噬，細(xì)胞內(nèi)自噬體數(shù)量增多。

Fig.5 Effect of Pb（Ac）2 on nucleic accumulation of Bcl-2 interacting coiled-coil protein（Beclin1）in the PC12 cells by immunofluorescence. See Fig.1 for the cell treatment. Arrows show the representative Beclin1 accumulation.

2.5 Pb（Ac）2對(duì)細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Sirt1，F(xiàn)oxO3a，F(xiàn)oxM1，Beclin1，LC3和P62表達(dá)的影響

Western 印跡法結(jié)果（圖6）顯示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，Pb（Ac）2100，200 和400 μmol·L-1組細(xì)胞內(nèi)Sirt1（P＜0.01）和FoxO3a蛋白（P＜0.05，P＜0.01）表達(dá)明顯上調(diào)，同時(shí)自噬相關(guān)蛋白Beclin1 蛋白表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01）和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值（P＜0.01）也明顯增加，P62 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01）；Pb（Ac）2200 和400 μmol·L-1組細(xì)胞FoxM1蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

3 討論

本研究采用Pb（Ac）2暴露誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞損傷模型，發(fā)現(xiàn)Pb（Ac）2可顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且細(xì)胞內(nèi)自噬程度明顯增加，自噬相關(guān)蛋白表達(dá)顯著增多，提示細(xì)胞自噬參與了Pb（Ac）2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程。

自噬是一種細(xì)胞程序性死亡的機(jī)制，常由多種應(yīng)激反應(yīng)引起。大量研究表明，抑制細(xì)胞自噬可減少神經(jīng)細(xì)胞的死亡，反之可促進(jìn)細(xì)胞死亡［9-11］。本研究中，隨著Pb（Ac）2濃度的增加，PC12 細(xì)胞內(nèi)自噬泡增多，且Beclin1在PC12 細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，表明Pb（Ac）2促進(jìn)PC12 細(xì)胞發(fā)生自噬。Beclin1，LC3 和P62 都是細(xì)胞自噬的重要標(biāo)志物。其中，Beclin1 水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值與自噬呈正相關(guān)，P62 蛋白表達(dá)水平與細(xì)胞自噬呈負(fù)相關(guān)［12-14］。本研究通過Western印記法檢測(cè)Beclin1，LC3 和P62 蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Pb（Ac）2暴露誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Beclin1 表達(dá)和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高，P62蛋白表達(dá)降低，進(jìn)一步證實(shí)細(xì)胞發(fā)生了自噬。

細(xì)胞自噬與凋亡之間存在交聯(lián)，但兩者的互作關(guān)系尚不明確［15］。有研究發(fā)現(xiàn)，抑制新生大鼠神經(jīng)元自噬后，腦神經(jīng)元凋亡增加［16］；另有研究發(fā)現(xiàn)，抑制大鼠海馬體中神經(jīng)元自噬后，大鼠腦損傷及神經(jīng)元凋亡率明顯降低［17］，表明細(xì)胞自噬與凋亡參與了細(xì)胞的死亡過程。本實(shí)驗(yàn)室前期研究也發(fā)現(xiàn)，用熒光染料Hoechst33342 對(duì)Pb（Ac）2處理的PC12 細(xì)胞染色后，顯微鏡下可觀察到細(xì)胞核明顯皺縮且藍(lán)色熒光增強(qiáng)［18］，提示細(xì)胞出現(xiàn)了凋亡。本研究中，用AO/EB 染色后，隨Pb（Ac）2濃度增加，細(xì)胞橙色熒光增強(qiáng)，綠色熒光逐漸減弱，表明細(xì)胞損傷中發(fā)生自噬的同時(shí)伴有細(xì)胞凋亡，同時(shí)，流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果表明，Pb（Ac）2可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡，與之前實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。

Sirt1 在調(diào)節(jié)血管穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞自噬和凋亡中發(fā)揮重要作用［4］。FoxO3a是Sirt1 的下游靶基因，Sirt1可通過去乙?；{(diào)節(jié)FoxO3a 的表達(dá)，參與調(diào)控細(xì)胞氧化應(yīng)激、凋亡和增殖等過程［19］。而FoxM1 是FoxO3a 的下游基因，也是FoxO3a 的直接轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)，但關(guān)于FoxO3a 和FoxM1 的表達(dá)相關(guān)性報(bào)道不一［20-21］。本研究中，不同濃度Pb（Ac）2作用細(xì)胞后，可使細(xì)胞內(nèi)Sirt1 和FoxO3a 蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，而FoxM1 表達(dá)下調(diào)，表明在PC12 細(xì)胞損傷的過程中可能有Sirt1/FoxO3a相關(guān)信號(hào)通路的參與，并存在FoxO3a負(fù)向調(diào)節(jié)下游效應(yīng)基因FoxM1的可能。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Pb（Ac）2可顯著誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷，且細(xì)胞自噬及Sirt1/FoxO3a信號(hào)通路可能參與該損傷過程。在后續(xù)研究中，將使用自噬抑制劑加以干預(yù)，進(jìn)一步證實(shí)細(xì)胞凋亡和自噬及Sirt1/FoxO3a信號(hào)通路在鉛誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷中確切機(jī)制。