李志恒, 徐瑞平,2, 王思懿, 肖炳坤, 楊建云, 繆瀟瑤, 黃榮清,2*

(1.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所, 北京 100850; 2. 廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院, 廣州 511436)

腎臟是人體重要器官,它主要起到維持體液和電解質(zhì)平衡的作用,可以將部分外源性物質(zhì)和代謝廢物經(jīng)尿液排出體外。由于腎臟是藥物代謝的主要場(chǎng)所之一,而藥物毒性是導(dǎo)致器官損傷的重要因素,因此腎臟疾病普遍具有較高的發(fā)病率[1-2]。藥物引起的腎損傷包括急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)和慢性腎損傷(chronic renal injury,CKD),AKI以腎功能急劇下降為特點(diǎn),表現(xiàn)為血肌酐快速升高和尿量減少等癥狀[3-5];CKD表現(xiàn)為腎小球?yàn)V過(guò)率降低和尿白蛋白排泄增加等[6-8]。腎損傷是一個(gè)嚴(yán)重的公共健康問(wèn)題,然而目前對(duì)腎損傷的診斷檢測(cè)方法如測(cè)定血肌酐和尿量等,對(duì)于AKI和CKD的早期診斷并不敏感,導(dǎo)致疾病不能得到及時(shí)治療,部分CKD向AKI轉(zhuǎn)化,甚至引起器官衰竭等并發(fā)癥導(dǎo)致患者死亡[9]。因此在早期階段及時(shí)發(fā)現(xiàn)腎損傷并對(duì)損傷的發(fā)展進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè),對(duì)于腎臟疾病的治療具有十分重要的意義[10]。

生物標(biāo)志物[11]是指可以標(biāo)記系統(tǒng)、器官、組織、細(xì)胞及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)或功能的改變或可能發(fā)生的改變的生化指標(biāo),具有非常廣泛的用途,可用于疾病診斷、判斷疾病分期或者用來(lái)評(píng)價(jià)新藥的安全性和有效性[12-13]。病理學(xué)研究已發(fā)現(xiàn)多種腎損傷的生物標(biāo)志物[14-16],并且某些標(biāo)志物的表達(dá)在病癥早期即可發(fā)生顯著變化[17-19],可用于腎損傷的早期檢測(cè)。其中,N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase, NAG)是近端腎小管上皮細(xì)胞的溶酶體中發(fā)現(xiàn)的最活躍的糖苷酶,它通過(guò)催化糖蛋白中的末端葡萄糖殘基進(jìn)行水解[20]。由于其相對(duì)分子質(zhì)量大于70 kDa,不能通過(guò)腎小球滲透正常進(jìn)入尿液[21-22],因此尿中NAG活力的升高是臨床上腎臟損害的一個(gè)重要指標(biāo)[23-24]。便捷、簡(jiǎn)單和精確的NAG活力檢測(cè)技術(shù),是目前腎臟疾病研究領(lǐng)域的一個(gè)熱門(mén)方向。目前NAG活力檢測(cè)的方法主要有比色法、毛細(xì)管電泳法、熒光探針和電化學(xué)法等。

1 比色法和熒光探針?lè)?/h2>

比色法和熒光探針?lè)ㄗ饔迷硐嗤?這兩種檢測(cè)方法,都是顯色底物與載體連接,載體在與酶結(jié)合裂解后釋放出顯色底物,并產(chǎn)生可檢測(cè)的顏色或熒光[25-26]。

比色法中常見(jiàn)的顯色底物包括對(duì)硝基苯基-N-乙?；?β-D-氨基葡萄糖(P-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosamine, pNP-NAG)[27]、2-甲氧基-4-(2′-硝基乙烯基)-苯基2-乙酰氨基-2-脫氧-β-D-吡喃葡萄糖苷[2-methoxy-4-(2′-nitrovinyl)-phenyl-2-acetylamino-2-deoxy-β-D-glucopyranoside, MNP-GlcNAc][28-29]、苯酚偶聯(lián)N-乙酰氨基葡萄糖(phenol coupledN-acetylglucosamine,PIP-NAG)[30]等。雖然這些顯色底物在檢測(cè)酶活性時(shí)得到了廣泛應(yīng)用,但這些顯色底物極易出現(xiàn)背景干擾如與尿液或血液中的多種成分具有相似的吸收,故而在診斷應(yīng)用中是有限的。

比色檢測(cè)法主要用于實(shí)驗(yàn)室酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)測(cè)定NAG含量。具有成本低廉、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn),但總體而言,大多數(shù)顯色底物的檢測(cè)限較高,反應(yīng)速率也比較低,檢測(cè)過(guò)程中需要較高的底物濃度和較長(zhǎng)的孵育時(shí)間。目前其發(fā)展趨勢(shì)是研發(fā)長(zhǎng)波吸收的易裂解比色底物,以提高檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確率。

基于含熒光素的顯色底物在生命科學(xué)中是一種常見(jiàn)的熒光探針,熒光探針?lè)ㄊ桥c顯色底物與酶裂解后釋放強(qiáng)烈的熒光訊號(hào),相較于比色法,熒光探針?lè)ǖ撵`敏度[41]、反應(yīng)速率、亮度、生物相容性都高于傳統(tǒng)的比色法。

張珩[31]巧妙地將比色法中測(cè)定吸光度轉(zhuǎn)化為測(cè)定熒光強(qiáng)度,利用水熱法合成了綠色熒光碳點(diǎn)(carbon dots, CDs),其最大激發(fā)峰(415 nm)與對(duì)硝基苯酚(pNP)重疊,當(dāng)體系內(nèi)同時(shí)存在CDs和pNP時(shí),由于熒光內(nèi)濾效應(yīng)(inner filter effect,IFE)[32]使碳點(diǎn)發(fā)光淬滅,在提升靈敏度的同時(shí)減少了尿液或血清的背景干擾。其中CDs是一種具有良好生物相容性的納米材料,研究人員還在探索將其用作藥物載體,實(shí)現(xiàn)對(duì)腎臟疾病的一體化診療[33]。Linko-L?pp?nen等[34]為擴(kuò)大適用性,以4-MU-GlcNAc為熒光底物,建立了基于熒光探針?lè)ǖ碾x心式微流控平臺(tái),可自動(dòng)化完成樣本傳輸、計(jì)量、混合和熒光測(cè)定等一系列步驟,實(shí)現(xiàn)于臨床大批量樣品檢測(cè)[35]。為了精準(zhǔn)檢測(cè)體內(nèi)NAG含量,Yan等[36]開(kāi)發(fā)了酶激活熒光探針(NHPO)用于順鉑誘導(dǎo)的腎損傷小鼠體內(nèi)成像和對(duì)腎損傷患者的尿液樣本進(jìn)行檢測(cè)(圖1),NHPO在體內(nèi)具有高靈敏度和高選擇性,適用于復(fù)雜生物系統(tǒng)中的NAG檢測(cè),雖然NHPO可以進(jìn)行活體實(shí)時(shí)成像,但其在部分熒光通道中沒(méi)有響應(yīng),因此急需檢測(cè)范圍更廣的體內(nèi)NAG活性檢測(cè)熒光探針。Tan等[37]通過(guò)將二吡咯亞硼與聚合物基質(zhì)mPEG-DSPE引入近紅外熒光分子中,制備了水分散納米探針BOD-II-NAG-NP,將NAG熒光探針的發(fā)射光譜拓展至第二近紅外窗口區(qū)域(the second near-infrared window region,NIR-Ⅱ),為1 000～1 700 nm,相比可見(jiàn)發(fā)光的熒光探針具有更好的空間分辨率、更高的信噪比和更深入的組織穿透能力[38-39],獲得了更好的成像效果[40],實(shí)時(shí)NIR-Ⅱ熒光成像更清晰,產(chǎn)生的背景噪聲更少,BOD-Ⅱ-NAG-NP具有成為臨床監(jiān)測(cè)腎損傷精密傳感器的潛力。熒光探針?lè)ǖ陌l(fā)展前景是檢測(cè)多種目標(biāo)物,可以在同一樣本中進(jìn)行多種檢測(cè)[41-42],降低對(duì)于樣本評(píng)價(jià)的誤差,減少了樣本需要量,提高腎臟損傷早期及時(shí)發(fā)現(xiàn)和精確診斷。

圖1 熒光探針與NAG作用機(jī)理Fig.1 Mechanism of interaction between fluorescence probe and NAG

2 毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳法是以毛細(xì)管作為分離載體、高壓電場(chǎng)作為驅(qū)動(dòng)力,基于樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)混合體系分離的一種分析方法,具有快速、高效和低耗等優(yōu)點(diǎn)[43]。Friedberg等[44]將尿樣與底物甲基傘形花環(huán)-β-D-氨基葡萄糖苷混合后直接進(jìn)樣檢測(cè),當(dāng)尿液中存在NAG時(shí),紫外/熒光檢測(cè)器可以檢測(cè)到反應(yīng)產(chǎn)物4-甲基傘形酮,在給藥和其他尿液的干擾下,在1.4～23 U/L表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。

毛細(xì)管電泳法是對(duì)比色法和熒光探針?lè)ǖ囊环N改進(jìn),通過(guò)增加一個(gè)混合體系分離的步驟,減少了背景干擾,進(jìn)一步提高了檢測(cè)的靈敏度[45]。但是底物和待測(cè)樣品的極性、緩沖液類(lèi)型、pH等因素對(duì)分離效果有較大影響,在探索分離條件的過(guò)程中需要耗費(fèi)大量精力,且對(duì)檢測(cè)靈敏度的提高有限,在NAG檢測(cè)中應(yīng)用較少。

3 電化學(xué)法

電化學(xué)法是建立在物質(zhì)在溶液中的電化學(xué)性質(zhì)基礎(chǔ)上的一類(lèi)儀器分析方法,通常將樣品溶液作為化學(xué)電池的一個(gè)組成部分,并將電池的某種電參數(shù)(如電阻、電導(dǎo)、電位、電流、電量或電流-電壓曲線等)與被測(cè)物質(zhì)的濃度建立起聯(lián)系,通過(guò)電信號(hào)數(shù)據(jù)對(duì)待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行定量分析[46]。Pemberton等[47]將底物1-萘基-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷修飾到絲網(wǎng)印刷電極(screen-printed carbon electrode,SPCE)上,在NAG催化下底物氧化裂解,電位差發(fā)生變化,從而對(duì)NAG活力進(jìn)行定量分析。該電極制備簡(jiǎn)單、成本低廉、可批量生產(chǎn),不需要預(yù)處理且一次性使用,可避免交叉污染[48]。Vibulcharoenkitja等[49]基于摻硼金剛石(boron-doped diamond,BDD)圓盤(pán)傳感器,使用陽(yáng)極微分脈沖伏安法(differential pulse voltammetry, DPV),利用三電極裝置(BDD工作電極、鉑板和用于伏安檢測(cè)的Ag/AgCl/3 mol/L KCl參比電極)靈敏監(jiān)測(cè)NAG含量。三電極裝置將產(chǎn)生的游離4NP轉(zhuǎn)化為可量化的電信號(hào),以便計(jì)算尿樣中的NAG活力(圖2)。在傳感器內(nèi)添加了數(shù)值評(píng)價(jià),伏安酶分析方法成功使用可批量生產(chǎn)的絲網(wǎng)印刷BBD磁盤(pán)傳感器平臺(tái)的尿液NAG檢測(cè)。

圖2 BDD與NAG作用機(jī)理[49]Fig.2 BDD sensing method for detecting NAG in urine of patients with suspected renal damage[49]

電化學(xué)法所用的儀器設(shè)備體積小、構(gòu)造簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉[50],可作為便攜式讀數(shù)設(shè)備進(jìn)行常規(guī)分散臨床測(cè)試,有望發(fā)展居家便攜式的檢測(cè)設(shè)備,方便患者及時(shí)進(jìn)行早期診斷,與后續(xù)監(jiān)測(cè)。

4 電化學(xué)發(fā)光法

現(xiàn)代技術(shù)中,基于發(fā)光的分析要明顯優(yōu)于比色法和熒光探針?lè)?發(fā)光主要的優(yōu)點(diǎn)在于不需要外部光源的照射,因此其背景干擾低,靈敏度高,對(duì)于特定的酶做出反應(yīng)而發(fā)光[51-52]。

電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence,ECL)是在電極上施加一定的電壓使電極反應(yīng)產(chǎn)物之間或電極反應(yīng)產(chǎn)物與溶液中某組分進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)而產(chǎn)生的一種光輻射[53]。自增強(qiáng)電致發(fā)光是一種新的提高發(fā)光效率的電致發(fā)光反應(yīng)模式,它通過(guò)共價(jià)連接使發(fā)光團(tuán)及其共反應(yīng)基團(tuán)存在于同一分子中[54],具有能夠縮短電子傳輸距離、提高發(fā)光穩(wěn)定性、簡(jiǎn)化操作、減少測(cè)量誤差等優(yōu)勢(shì)。聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)32+,其中bpy表示2,2′-聯(lián)吡啶(2,2′-bipyridyl)]由于其在水介質(zhì)中的高度穩(wěn)定性、良好的化學(xué)性能以及多種共反應(yīng)物的相容性使其成為研究最多的無(wú)機(jī)ECL發(fā)光體[55]。Wang等[56]以Ru(bpy)32+為發(fā)光單元,采用溶劑蒸發(fā)誘導(dǎo)自組裝法制備了發(fā)光效率較高的納米棒{[Ru(bpy)2(mcbpy)2+-TAPA]NRs}。將功能化的鉑納米顆粒[Ru(bpy)2(mcbpy)2+-TAPA]NRs用于負(fù)載檢測(cè)抗體(Ab2),并合成了具有層次支化結(jié)構(gòu)的Au/Pd樹(shù)枝狀大分子(dnedrimers,DRs),以增加固定化捕獲抗體(Ab1)的量。NAG濃度在0.5～1 pg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,檢測(cè)限為0.17 pg/mL。同年該課題組開(kāi)發(fā)了Ru(Ⅱ)絡(luò)合物{[Ru(dcbpy)2dppz]2+-DPEA}的光開(kāi)關(guān)分子[57]。以Y形DNA為原料制備了DNA樹(shù)狀大分子(第四代,G4),制備的納米復(fù)合材料G4-[Ru(dcbpy)2dppz]2+-DPEA與鏈霉親和素標(biāo)記的檢測(cè)抗體結(jié)合后發(fā)生夾心免疫反應(yīng),檢測(cè)方法的線性范圍為0.1～1 ng/mL,檢測(cè)線降至0.028 pg/mL。

總的來(lái)說(shuō),電化學(xué)發(fā)光法方法結(jié)合了熒光探針?lè)ǜ哽`敏度以及電化學(xué)法儀器設(shè)備體積小、構(gòu)造簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉等優(yōu)勢(shì),在可便攜式讀數(shù)的基礎(chǔ)上提供了一種有效的信號(hào)放大手段,進(jìn)一步提高了檢測(cè)的靈敏性,為進(jìn)一步的生物分析和臨床研究提供了巨大的潛力[58]。

5 拉曼光譜法

拉曼光譜(Raman spectroscopy)是一種產(chǎn)生于分子能級(jí)或晶格振動(dòng)能級(jí)的光子非彈性散射光譜,其特征峰具有指紋譜特性,位置、強(qiáng)度和線寬可提供分子振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)等信息,據(jù)此反映分子中化學(xué)鍵和官能團(tuán)的構(gòu)成[59-60]。表面增強(qiáng)拉曼散射(surface enhancement of Raman scattering,SERS)則是在常規(guī)拉曼光譜法的基礎(chǔ)上,將樣品吸附在膠質(zhì)金屬顆粒如銀、金或銅表面,或吸附在這些金屬片的粗糙表面上后再進(jìn)行分析,通過(guò)這種預(yù)處理,可以使樣品拉曼光譜的強(qiáng)度提高3～6個(gè)數(shù)量級(jí)。理論上講,這種靈敏度完全可以用于生物樣本中酶的定性和定量分析[61],然而盡管將該技術(shù)用于酶等生物大分子的檢測(cè)分析方法的想法早在20多年前就已經(jīng)被提出[62-63],但是如何設(shè)計(jì)能被目標(biāo)酶高效、快速、有選擇性地切割的底物分子,進(jìn)而釋放可被基材捕獲并引起SERS反應(yīng)的報(bào)告分子是困擾研究人員的一大難題。Nirala等[64]經(jīng)過(guò)探索,首次設(shè)計(jì)成功了一種性能優(yōu)異的底物分子,他們利用多孔硅干涉儀作為SERS平臺(tái),并向其中嵌入銀納米顆粒。底物分子吸附到銀納米顆粒上,產(chǎn)生一個(gè)指示性的指紋光譜,強(qiáng)度與底物分子濃度成正比。NAG催化裂解底物產(chǎn)成葡萄糖殘基和1-萘酚,后者立即與重氮染料發(fā)生反應(yīng),耦合反應(yīng)產(chǎn)生的不溶性產(chǎn)物與Ag-PSi SERS平臺(tái)相互作用,同時(shí)放大局部電磁場(chǎng),使光譜信號(hào)發(fā)生顯著變化[65](圖3),對(duì)尿液和血漿中NAG活力的檢測(cè)限分別為0.07 mU/mL和0.50 mU/mL。

圖3 NAG活性相關(guān)的SERS信號(hào)的機(jī)理[62]Fig.3 Mechanism of SERS signals related to NAG activity[62]

拉曼光譜法具有無(wú)需樣品預(yù)處理、受濃度干擾小、可同時(shí)測(cè)定多種組分等優(yōu)點(diǎn),任何氣態(tài)、液態(tài)、固態(tài)樣品均可直接通過(guò)探頭進(jìn)行檢測(cè)并提供無(wú)損、快速、簡(jiǎn)單、可重復(fù)的定性定量分析[66],缺點(diǎn)是容易受到固體粒子、氣泡或渾濁系統(tǒng)中細(xì)胞的光散射的干擾[67]。

6 結(jié)論

NAG作為腎臟損傷一種重要生物標(biāo)志物,其檢測(cè)技術(shù)對(duì)于腎臟疾病的診斷治療具有重要意義。自20世紀(jì)80年代以來(lái),研究人員通過(guò)結(jié)構(gòu)優(yōu)化以及技術(shù)融合的方式,發(fā)展了多種NAG活力測(cè)試技術(shù),在科研和臨床中發(fā)揮了很大作用。對(duì)于NAG酶的檢測(cè)正在向便攜小型化發(fā)展,并在靈敏度、穩(wěn)定性和成本效益方面進(jìn)行優(yōu)化。但是該領(lǐng)域仍有一些難點(diǎn)尚未攻克,未來(lái)的研究重點(diǎn)將主要聚焦于以下幾個(gè)方面。

(1)提升檢測(cè)技術(shù)的靈敏度,持續(xù)優(yōu)化底物分子結(jié)構(gòu),以改進(jìn)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì),開(kāi)發(fā)具有不同信號(hào)顯色底物與酶的新組合。擴(kuò)展特定底物的選擇和更廣泛的標(biāo)記酶,以實(shí)現(xiàn)在單一或多種酶的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)至關(guān)重要。合理運(yùn)用空間位阻、吸/給電子官能團(tuán)、重原子效應(yīng),充分考慮分子聚集、內(nèi)濾效應(yīng)、共振能量轉(zhuǎn)移等因素對(duì)輸出信號(hào)產(chǎn)生的影響,發(fā)展包括熒光-比色聯(lián)用在內(nèi)的多技術(shù)聯(lián)用檢測(cè)方法。

(2)拓展檢測(cè)技術(shù)的線性區(qū)間,健康樣本和患者樣本中NAG的活力差值最大可達(dá)近2個(gè)數(shù)量級(jí),現(xiàn)有的檢測(cè)技術(shù)中,有相當(dāng)一部分線性區(qū)間無(wú)法達(dá)到這樣的水平。探索構(gòu)建多通道底物,以及在同一檢測(cè)體系中交叉使用多種形式的信號(hào)輸出模式(如熒光、比色、光聲和核磁等信號(hào))。

(3)發(fā)展診療一體的NAG檢測(cè)技術(shù),將腎臟疾病控制在早期階段,提高疾病的治愈率,降低治療成本,拓展NAG檢測(cè)技術(shù)在臨床的應(yīng)用。