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MOFs的制備及其載藥性能初步評(píng)價(jià)

2023-11-04 09:54:52葛健文陳浩楊可欣朱倩鈺曹高潔徐青清秦貴琳牟伊季鵬
山東化工 2023年17期
關(guān)鍵詞:琥酯載藥青蒿

葛健文,陳浩,楊可欣,朱倩鈺,曹高潔,徐青清,秦貴琳,牟伊,季鵬

(泰州學(xué)院 醫(yī)藥與化學(xué)化工學(xué)院,江蘇 泰州 225300)

金屬有機(jī)骨架(Metal-Organic Frameworks,MOFs)是由有機(jī)配體與金屬離子通過配位作用形成的結(jié)晶性、多孔性固體材料,具有周期性網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[1-2]。Robson在1989年首次發(fā)現(xiàn)MOFs,在此之后研究人員對(duì)其開展了一系列研究,目前MOFs應(yīng)用廣泛,包括藥物遞送、氣體分離和吸附、催化、傳感等多個(gè)領(lǐng)域。MOFs的合成需要仔細(xì)考慮幾個(gè)關(guān)鍵因素如pH值、溫度、溶劑和添加劑,因?yàn)樗鼈冎饕绊戇B接劑的溶解度、擴(kuò)散速率和連接劑去質(zhì)子化的程度[3]。因此,合成條件的改變會(huì)極大地影響金屬的配位性、反應(yīng)速度以及產(chǎn)物質(zhì)量。常見的幾種MOFs的合成方法有水熱/溶劑熱合成法、微波輔助合成法、機(jī)械化學(xué)合成法和噴霧干燥合成法等[4]。

青蒿琥酯(Artesunate,AS)是青蒿素的半合成水溶性衍生物,它從傳統(tǒng)中藥青蒿中被提取,最初用于臨床治療瘧疾。AS表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗腫瘤活性[5],但因其本身的生物利用度低,在臨床上受到一定的限制。與原始藥相比,可以攜帶藥物的藥物載體,在維持原本藥理活性的基礎(chǔ)上,不僅能降低或消除原始藥的毒副作用、改善藥物的傳遞效果,同時(shí)可以提高藥物的生物利用度。因此,研發(fā)一種生物相容性好、安全性高且可降解的藥物載體就顯得尤其重要。因?yàn)镸OFs具有良好的孔隙結(jié)構(gòu)和過高的孔隙率,同時(shí)在裝載多種藥物方面有較高的利用性,所以選其作為藥物載體[6]。目前,含有二價(jià)鐵的MOFs比較少,從這方面考慮,選用二價(jià)鐵作為金屬中心,氨基對(duì)苯二甲酸作為有機(jī)配體,通過溶劑熱合成法制得MOFs。隨后將AS載入MOFs中,在單因素考察的基礎(chǔ)上,從而評(píng)價(jià)MOFs的載藥性能。最后將制得的AS@MOFs進(jìn)行體外釋放實(shí)驗(yàn)和溶血實(shí)驗(yàn),考察其是否具有pH響應(yīng)性的降解特性和良好的生物相容性,從而評(píng)價(jià)MOFs載藥后的理化性質(zhì)。

1 材料

1.1 主要儀器

FA2004型電子天平購自上海良平儀器儀表有限公司(中國上海);pHS-3C型pH計(jì)購自上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司(中國上海);TDL-80-2B型臺(tái)式低速離心機(jī)購自上海安亭科學(xué)儀器廠(中國上海);DHG-9070A型電熱鼓風(fēng)干燥箱購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司(中國上海);HWCL-3型集熱式恒溫磁力攪拌浴購自鄭州長城科工貿(mào)有限公司(中國鄭州);KQ-500DB型數(shù)控超聲儀購自昆山市超聲儀器有限公司(昆山);UV-1200型紫外-可見分光光度計(jì)購自上海美譜達(dá)儀器有限公司(中國上海);RE3000A型旋蒸儀購自上海亞榮生化儀器廠(中國上海)。

1.2 主要藥品與試劑

N,N-二甲基甲酰胺(DMF,批號(hào)C12749151)購自上海麥克林生化科技有限公司;2-氨基對(duì)苯二甲酸(2-NH2-BDC,批號(hào)C12066283,純度98%)購自上海麥克林生化科技有限公司;乙酸亞鐵四水合物(Acetate tetrahydrate,批號(hào)C11956657,純度95%)購自上海麥克林生化科技有限公司;青蒿琥酯(AS,批號(hào)C10692323)購自上海麥克林生化科技有限公司;二甲基亞砜(DMSO,批號(hào)20191228)購自上海麥克林生化科技有限公司;無水乙醇(Ethanol absolute,批號(hào)20201029)購自中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司;PBS購自中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司;其余試劑為實(shí)驗(yàn)室常用規(guī)格,水為去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 MOFs的合成

采用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)為溶劑的溶劑熱合成法,同時(shí)在醋酸存在的條件下,使用氨基對(duì)苯二甲酸(NH2-BDC)就不會(huì)出現(xiàn)副產(chǎn)物,從而實(shí)現(xiàn)合成MOFs的目的。具體方法如下:取0.5 g FeAc2溶于5 mL水中得到溶液A,稱取0.45 g NH2-BDC溶于15 mL DMF中得到溶液B。用玻璃棒攪動(dòng)溶液B的同時(shí)將溶液A緩緩滴入,隨后在100 ℃條件下反應(yīng)1 h,反應(yīng)完畢后將反應(yīng)液冷卻至室溫,然后離心(3 500 r/min,30 min)除去上清液,用DMF洗2次。接著用無水乙醇渦旋充分洗滌2次并離心(3 500 r/min,15 min),最終得到MOFs。

2.2 AS@MOFs的合成

稱取適量的AS、MOFs分別加入20 mL無水乙醇中,然后將兩個(gè)溶液混合,將其用超聲充分混合。隨后,在室溫下繼續(xù)恒定攪拌一定時(shí)間,使AS與MOFs混合更加充分,然后將混合溶液放置于旋蒸儀進(jìn)行旋蒸至無溶液。最后用無水乙醇洗滌產(chǎn)物3次,離心(3 500 r/min,15 min),得到產(chǎn)物AS@MOFs。

2.3 MOFs納米粒載藥性能評(píng)價(jià)

2.3.1 測定方法

準(zhǔn)確稱量AS(10.0 mg)到容量瓶(10 mL)中,加入5%碳酸氫鈉溶液到標(biāo)記處,搖勻,得到備用溶液(1 000 μg/mL)。然后,用2%NaOH-無水乙醇混合溶液稀釋至不同濃度(10,20,30,40,80,120和200 μg/mL),在60 ℃下水解30 min,冷卻形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的衍生物(λ=290 nm)。以2% NaOH-無水乙醇混合溶液為空白對(duì)照,采用紫外-可見分光光度計(jì)對(duì)不同樣品的吸光度進(jìn)行測定。

將二甲基亞砜(DMSO)與乙醇混合制得30%乙醇-DMSO混合溶液并從混合液中取5.2 mL,精確稱量AS@MOFs 2.1 mg放于該混合液中,隨后在超聲的作用下使其充分溶解。溶解完全后使混合液在針式過濾器中通過孔徑為0.45 μm的微孔濾膜。再利用紫外可見分光光度計(jì)在290 nm波長處測定其吸光度,然后利用標(biāo)準(zhǔn)曲線求出AS的含量,最后計(jì)算AS@MOFs的載藥量。載藥量(%)=We/Wm×100%;式中We表示AS@MOFs復(fù)合物中AS的質(zhì)量,Wm表示稱取的AS@MOFs的總質(zhì)量。

2.3.2 結(jié)果與分析

2.3.2.1 AS標(biāo)準(zhǔn)曲線

為計(jì)算AS@MOFs中青蒿琥酯的載藥量,精準(zhǔn)繪制青蒿琥酯標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.003 2x-0.005,R2=0.999 1 (y:290 nm處的吸光度值;x:AS濃度)。如圖1所示,在5~200 μg/mL范圍內(nèi)青蒿琥酯溶液具有很好的線性關(guān)系。

圖1 青蒿琥酯標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.3.2.2 MOFs的載藥影響因素

1)MOFs和AS比例的影響:將制備AS@MOFs的實(shí)驗(yàn)條件固定,選用AS和MOFs質(zhì)量比分別為2∶2,3∶2,4∶2,5∶2,然后將制備好的AS@MOFs用紫外分光光度法,通過吸光度進(jìn)行載藥量的測定,可得出AS和MOFs質(zhì)量比的改變對(duì)載藥量的影響,結(jié)果如圖2所示。

圖2 AS和MOFs比例對(duì)載藥量的影響

從圖2可以看出,藥物載藥量先增大后降低,在AS與MOFs的質(zhì)量比為4∶2時(shí),載藥量最大。在此之后,增加AS的比例并不能增加藥物的載藥量,這是由于MOFs的載藥量逐漸達(dá)到飽和的原因。

2)反應(yīng)溫度的影響:將制備AS@MOFs的實(shí)驗(yàn)條件固定,確定AS和MOFs質(zhì)量比為4∶2。在25,55,75 ℃時(shí),對(duì)不同反應(yīng)溫度下的載藥量進(jìn)行了測定,結(jié)果如圖3所示。藥物載藥量先增大后降低,過高的反應(yīng)溫度會(huì)使MOFs的載藥量下降,55 ℃時(shí)MOFs的載藥量最高。超聲會(huì)促進(jìn)AS滲透進(jìn)入MOFs孔道里,但是相關(guān)研究表示AS較優(yōu)水解溫度是83 ℃,所以過高溫度可能會(huì)使AS水解。

圖3 反應(yīng)溫度對(duì)載藥量的影響

3)攪拌時(shí)間的影響:將制備MOFs@AS的實(shí)驗(yàn)條件固定,確定AS和MOFs質(zhì)量比為4∶2,反應(yīng)溫度為55 ℃。攪拌其間,分別在1,3,6,9,12 h時(shí)間點(diǎn),吸取溶液并測其吸光度,查看載藥量的改變,結(jié)果如圖4所示。

圖4 攪拌時(shí)間對(duì)載藥量的影響

隨著載藥時(shí)間的增長,MOFs的載藥能力也隨之增加,載藥時(shí)間到達(dá)6 h時(shí),載藥量最大,這說明載藥時(shí)間為6 h時(shí),MOFs的載藥量已經(jīng)處于飽和狀態(tài),可能是由于經(jīng)過6 h的作用,藥物的吸附與解吸達(dá)到了平衡點(diǎn),以致載藥量出現(xiàn)最大。但是時(shí)間到達(dá)12 h時(shí),MOFs的載藥量明顯降低,可能是因?yàn)殚L時(shí)間浸泡導(dǎo)致MOFs表面吸附的AS脫落。

2.4 AS@MOFs的體外釋放行為

2.4.1 測定方法

以含20%乙醇、不同酸堿度為7.4,6.4和5.0的PBS為釋放介質(zhì)。將AS@MOFs置于相對(duì)分子質(zhì)量為14 000 Da的透析袋,然后將其浸入釋放介質(zhì)(10 mL)中,并在37.0 ℃的黑暗中以100 r/min的攪拌速率進(jìn)行釋放試驗(yàn)。以預(yù)定的間隔(0.5,1,2,4,6,8,14,24,48 h),取出等份試品(0.4 mL),然后在0.45 μm微孔濾膜濾過,同一時(shí)間補(bǔ)充相同體積的新鮮PBS。之后,濾液被30%乙醇-DMSO混合溶液稀釋到適當(dāng)濃度,通過290 nm處的紫外-可見吸收光譜測定不同孵育時(shí)間的上清液中的AS。最后,計(jì)算藥物釋放量,并繪制與時(shí)間的關(guān)系函數(shù)。釋放量計(jì)算如下:釋放量(%)=釋放的AS量/負(fù)載的AS總量。

2.4.2 結(jié)果分析

AS@MOFs在不同pH值下的體外釋放:MOFs是一種具有pH響應(yīng)性的骨架材料,在一定酸性條件下,MOFs結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,會(huì)導(dǎo)致孔道崩塌,然后釋放出包載的藥物。因此,為了探究在酸性環(huán)境下AS@MOFs中青蒿琥酯的釋放行為,對(duì)AS@MOFs的pH響應(yīng)釋放行為進(jìn)行測試。如圖5所示,該圖證明AS@MOFs中青蒿琥酯的釋放行為具有明顯的pH響應(yīng)性。在pH值5.0,6.4和7.4環(huán)境下青蒿琥酯在前4 h釋放速率較快,4 h釋放量分別為57.70%,38.30%,24.47%,這是由于與金屬有機(jī)骨架作用力弱的青蒿琥酯脫落,并快速進(jìn)入釋放介質(zhì)中的原因。在隨后的時(shí)間釋放曲線比較平緩,48 h后在pH值5.0和6.4環(huán)境下的釋放量分別達(dá)到79.44%,72.54%,而在pH值7.4環(huán)境下累計(jì)釋放量為51.26%,表明酸性條件下青蒿琥酯的釋放效果更明顯,這是因?yàn)镸OFs孔道里的青蒿琥酯隨著時(shí)間的延長被釋放。由此可見AS@MOFs具有pH響應(yīng)釋放的功能,能夠有針對(duì)性地釋放所包載的青蒿琥酯。

圖5 AS@MOFs在不同pH條件下體外釋放曲線

2.5 AS@MOFs的溶血實(shí)驗(yàn)

2.5.1 測定方法

將新鮮鼠血通過生理鹽水洗滌,并以2%(體積分?jǐn)?shù))的細(xì)胞密度重懸制得2%紅細(xì)胞懸液,然后將不同濃度(0.5,1.0,2.0,5.0,10.0 mg/mL)的AS@MOFs與紅細(xì)胞懸浮液混合,在37 ℃培養(yǎng)1 h。然后,將離心混合物(1 000 r/min,15 min)通過紫外可見分光光度計(jì)在540 nm處測定上清液的吸光度。此外,將生理鹽水和蒸餾水分別與紅細(xì)胞懸液在相同條件下一起孵育,用作陰性對(duì)照和陽性對(duì)照。溶血率計(jì)算如下:溶血率(%)=(As-An)/(Ap-An)×100%;在上式中,As是樣品的吸光度,Ap是陽性對(duì)照品的吸光度,An是陰性對(duì)照品的吸光度。根據(jù)國際性標(biāo)準(zhǔn)ISO 10993.4規(guī)定α%溶血率小于5%,則被認(rèn)為是合格的。

2.5.2 結(jié)果分析

溶血實(shí)驗(yàn)主要是以實(shí)驗(yàn)制得的生物材料對(duì)紅細(xì)胞的作用,來評(píng)價(jià)該材料的溶血性能。本實(shí)驗(yàn)中對(duì)裝載青蒿琥酯的MOFs溶血性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。當(dāng)AS@MOFs的質(zhì)量濃度為0.5,1.0 mg/mL用紫外分光光度計(jì)檢測得到的溶血率均小于5%,符合溶血實(shí)驗(yàn)要求,具體如表1所示。同時(shí),肉眼觀察到質(zhì)量濃度為0.5,1.0 mg/mL的溶液上清無色澄清,表明無溶血。因此,可以認(rèn)為制備出來質(zhì)量濃度為0.5,1.0 mg/mL的AS@MOFs的生物相容性良好,沒有明顯的溶血作用,可以用于靜脈注射。質(zhì)量濃度大于1 mg/mL的溶血率大于5%,說明其濃度較高導(dǎo)致紅細(xì)胞破裂。由于MOFs制備中用到了亞鐵離子,而亞鐵離子可以幫助人體血紅蛋白運(yùn)輸氧氣,對(duì)人體有益,但是亞鐵離子容易氧化成三價(jià)鐵離子,會(huì)在一定程度上影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。此外,MOFs的吸附能力強(qiáng),會(huì)吸附溶液中的水分子等,當(dāng)達(dá)到一定程度,MOFs的孔道會(huì)坍塌,釋放出AS,因此也會(huì)影響實(shí)驗(yàn)。

3 討論

MOFs材料因具有優(yōu)異的孔道內(nèi)部結(jié)構(gòu),所以其具有優(yōu)良的物理化學(xué)性能[7]。本實(shí)驗(yàn)采用溶劑熱合成法制得MILs系列的MOFs(二價(jià)鐵為金屬中心),由于合成MOFs的有機(jī)配體NH2-BDC在常溫常壓下不易溶于水,且在溶劑熱條件下其溶解度會(huì)增加,這樣更有利于反應(yīng)的進(jìn)行,為后續(xù)合成一種負(fù)載青蒿琥酯的MOFs材料AS@MOFs提供可行性。之后在MOFs與AS的比例、反應(yīng)溫度、攪拌時(shí)間這三方面對(duì)MOFs載藥能力進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)當(dāng)m(AS)∶m(MOFs)為2∶4、反應(yīng)溫度為55 ℃、攪拌時(shí)間為6 h時(shí)MOFs呈現(xiàn)優(yōu)異的載藥性能。藥物釋放實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果充分證明了AS@MOFs在體外釋放評(píng)價(jià)中具有良好的緩釋效果,并且在酸性環(huán)境中也具有響應(yīng)行為。在酸性條件下AS@MOFs會(huì)緩慢釋放其包載的青蒿琥酯,48 h后在pH值5.0,6.4,7.4環(huán)境下的釋放量達(dá)到79.52%,68.39%,47.12%。可見AS@MOFs是一個(gè)很有前途的pH響應(yīng)藥物傳遞系統(tǒng)。溶血實(shí)驗(yàn)中AS@MOFs的質(zhì)量濃度為0.5,1.0 mg/mL用紫外分光光度計(jì)檢測溶血度均小于5%,且肉眼觀察上清無色澄清,因此可以認(rèn)為制備出來濃度為0.5,1.0 mg/mL的AS@MOFs具有良好的生物相容性,沒有明顯的溶血作用,可以作為靜脈注射。

綜上所述,本研究成功制備出了MOFs材料,該材料具有良好的載藥性能和生物相容性。后續(xù)將繼續(xù)從動(dòng)物水平入手,對(duì)材料的藥效學(xué)、藥動(dòng)學(xué)等方面進(jìn)行進(jìn)一步探討。

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