李 爽,李紅玉,吳鳳芝

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝園林學(xué)院,哈爾濱 150030)

番茄(SolanumlycopersicumL.)是中國重要蔬菜作物之一,在生產(chǎn)過程中由于土地資源匱乏,設(shè)施栽培進(jìn)行長期連作,導(dǎo)致番茄黃萎病(Verticilliumwilt)發(fā)生普遍,造成產(chǎn)量和品質(zhì)下降。番茄黃萎病屬于土傳病害,防治措施主要有抗病品種選育,化學(xué)防治,生物防治,嫁接防治[1-4]。以上防治措施雖然在一定程度上能夠有效控制番茄黃萎病,但是這些措施各有利弊,不能作為長期有效的防治措施。因此,采用合理的栽培方式才是控制番茄黃萎病的有效手段。

在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中,植物多樣性種植提高了集約化農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展,間作是植物多樣性種植方式中的一種,可以提高農(nóng)作物生產(chǎn)力和有效抑制植物土傳病害[5-6]。近年來大量研究表明,間作能顯著降低病害的發(fā)生[7-11]。小麥根系分泌物和小麥伴生土壤微生物提高西瓜根系木質(zhì)素生物合成、防御相關(guān)基因的表達(dá)和β-1,3-葡聚糖酶活性,提高西瓜對枯萎病抗性[8]。印度芥菜和芝麻菜作為綠肥增加黃瓜根際有益微生物豐富度,提高防御相關(guān)基因(CHI,GLU,PAL和PR1)的表達(dá),提高黃瓜枯萎病抗性[12]?；ㄉ?蒼術(shù)間作顯著提高了土壤微生物多樣性,降低了苗期和成熟期立枯病和根腐病的發(fā)病率[13]。小麥/蠶豆間作顯著提高蠶豆根際土壤細(xì)菌、真菌、放線菌的數(shù)量及其總量,顯著降低蠶豆枯萎病發(fā)病率和病情指數(shù)[14]。

植物-土壤反饋是指土壤微生物組成和豐度的變化對后繼作物生長、發(fā)育和健康的影響[14-16]。植物根際微生物是植物健康和生產(chǎn)力的關(guān)鍵決定因素,被認(rèn)為是植物防御地下病害的主要驅(qū)動力[17]。生物炭改變土壤微生物群,富集對病原菌具有拮抗作用的有益菌群(芽孢桿菌和溶菌),從而對尖孢鐮刀菌產(chǎn)生抑制作用。Gong等[18]研究表明,在100%土壤含水量條件下,一茬水芹輪作提高黃瓜根際潛在有益微生物的相對豐度,降低了潛在病原真菌(FusariumandMonographellaspp.)的相對豐度,不同程度的淹水導(dǎo)致黃瓜根際土壤微生物群落的多樣性、結(jié)構(gòu)和組成存在差異,對黃瓜生長產(chǎn)生正反饋作用。Gao等[15]研究表明小麥填閑通過改變土壤養(yǎng)分有效性和調(diào)節(jié)土壤微生物群落多樣性促進(jìn)黃瓜幼苗生長。Li等[8]研究發(fā)現(xiàn)小麥/西瓜間作后的土壤降低了西瓜枯萎病發(fā)病率和病情指數(shù)。

目前,分蘗洋蔥/番茄間作可以有效抑制番茄黃萎病[19],并且提高了番茄根際微生物多樣性[9],但分蘗洋蔥伴生番茄根際微生物對番茄植株根系防御酶和防御基因的影響有待進(jìn)一步深入研究。本研究以分蘗洋蔥和番茄為研究對象,探討分蘗洋蔥伴生番茄根際土壤微生物對減輕黃萎病的作用,并結(jié)合防御酶和抗性相關(guān)基因闡明分蘗洋蔥伴生番茄提高番茄黃萎病抗性機(jī)制,為間套作栽培管理抑制作物病害提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

番茄(SolanumlycopersicumL.):品種為‘東農(nóng)708’,由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)番茄育種實驗室提供。

分蘗洋蔥(Alliumcepavar.agrogatumDon.):品種為‘綏化’,由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)設(shè)施蔬菜生理與生態(tài)課題組保存。

番茄黃萎病病原菌菌株為Verticilliumdahliae,生理小種1,由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)番茄育種中心許向陽教授饋贈。

試驗土壤為番茄連作土壤,土壤基本化學(xué)性狀:NH4+-N 14.49 mg·kg-1,NO3--N 44.9 mg·kg-1,有效磷 269.55 mg·kg-1,速效鉀186.06 mg·kg-1,EC值0.29 mS·cm-1(土壤質(zhì)量∶蒸餾水體積=1∶2.5),pH 6.06 (土壤質(zhì)量∶蒸餾水體積=1∶5)。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 制備根際土 試驗在溫室中進(jìn)行,采用盆栽試驗,將番茄連作土裝入14 cm × 16 cm的塑料盆中,每盆土壤質(zhì)量為1 000 g。試驗處理為番茄單作(Tomato monoculture,TM)和分蘗洋蔥伴生番茄(Tomato intercropping,TI)。每個處理設(shè)置3次重復(fù),每個重復(fù)30盆。番茄常規(guī)育苗,四葉一心定植,每盆1株番茄,番茄伴生處理是在番茄幼苗定植時在距番茄幼苗5 cm位置處種植大小均勻的3株分蘗洋蔥鱗莖。定植20 d后采用抖根法取分蘗洋蔥伴生番茄(TI)和番茄單作(TM)的根際土,將土壤樣品過2 mm篩。將過篩后的所有土壤置于4 ℃保存,用于植物-土壤反饋試驗。

1.2.2 根際微生物對番茄黃萎病病情指數(shù)和發(fā)病率的影響 為了明確番茄單作和伴生根際土壤微生物對番茄黃萎病抗性的影響,進(jìn)行植物-土壤反饋試驗,試驗在溫室中進(jìn)行,將未種植過茄科植物的大田土壤過2 mm篩,經(jīng)121 ℃滅30 min,間隔24 h進(jìn)行下一次滅菌,滅菌條件相同,共滅菌3次。將番茄單作和番茄伴生根際土接種到滅菌后的土壤中,混合均勻,其接種量為土壤總質(zhì)量的6%(相對干質(zhì)量)。20 ℃下培養(yǎng)3 d,培養(yǎng)期間保持田間最大持水量的60%左右。根據(jù)接種根際土壤微生物的差異,共設(shè)置4個處理(表1)。

表1 試驗處理及代號Table 1 Treatment and code in this experiment

將四葉一心的番茄幼苗定植在不同根際土處理的盆中,緩苗后在番茄莖基部采用灌根法接種,接數(shù)量濃度為1×106mL-1的孢子懸液20 mL。接種5 d、10 d和15 d后調(diào)查病情指數(shù)和發(fā)病率。

1.2.3 根際微生物對番茄黃萎病抗性的影響 將四葉一心的番茄幼苗定植在盆(14 cm×16 cm)中,同時種植大小均勻的3株分蘗洋蔥鱗莖,定植20 d后將伴生番茄和單作番茄整株從土中小心取出,取出后的單作番茄和伴生番茄分為兩部分,一部分帶有番茄根際土種植在沙子和土壤體積比為1∶1的土壤中,處理為具有伴生番茄根際土(Intercropping rhizosphere soil with tomato plant,WTI)和具有單作番茄根際土(Monoculture rhizosphere soil with tomato plant,WTM);另一部分將番茄根用自來水沖洗干凈,然后用滅菌水沖洗3次,再將番茄種植在沙子和土壤體積比為1∶1的土壤中,處理為無伴生番茄根際土(Intercropping rhizosphere soil without tomato plant,NTI)和無單作番茄根際土(Monoculture rhizosphere soil without tomato plant,NTM),沙子和土壤滅菌條件與“1.2.2”相同,共滅菌3次。緩苗后接種20 mL數(shù)量濃度為1×106mL-1的V.dahliae。在接種0 h、24 h、48 h、96 h后對番茄根系進(jìn)行取樣,將取得的番茄根系放入液氮中速凍,-80 ℃保存,測定防御酶活性及抗病相關(guān)基因。

圖1 試驗示意圖Fig.1 Test schematic plot

1.3 測定項目及方法

1.3.1 病情指數(shù)和發(fā)病率調(diào)查 番茄黃萎病發(fā)病程度分為0～5級共6個等級,采用Shittu[20]的方法測定(表2)。

表2 番茄黃萎病發(fā)病程度和癥狀Table 2 Severity and symptoms of tomato Verticillium wilt

表3 用于qRT-PCR分析的基因和引物Table 3 Genes and primers used in real-time qRT-PCR analysis

1.3.2 抗性基因的測定 用TRIZOL試劑按說明書提取番茄根系總RNA[21]。用分光光度計和1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測總 RNA 的產(chǎn)量和質(zhì)量。

采用 BioTeKe super RT Kit(百泰克,北京)按照說明書進(jìn)行 cDNA 的合成,得到的 cDNA可以直接用于后續(xù) PCR 反應(yīng)。

使用 2×Plus SYBR real-time PCR mixture(天根,北京),在 IQ5real-time PCR 系統(tǒng)(Bio-Rad Lab,LA,USA)上分析PR1、PR2、PR3、PPO、PAL、LOX這5種防御相關(guān)基因表達(dá)。

1.3.3 防御酶活性測定 采用NBT(四銼氮藍(lán))法測定SOD活性[22];采用鄰苯二酚比色法測定PPO活性[23];參照Gao[22]方法測定PAL活性;采用昆布多糖的方法測定β-1,3-葡聚糖酶活性[24]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2020整理原始數(shù)據(jù)和作圖,采用IBM SPSS Statistics 21.0軟件對發(fā)病情況、抗性相關(guān)基因和防御酶活性數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析,方差分析采用Turkey’s HSD,在P<0.05水平下分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 分蘗洋蔥伴生土壤微生物對番茄黃萎病發(fā)病率和病情指數(shù)的影響

如圖2所示,在接種V.dahliae的10 d和 15 d后,滅菌土壤處理的番茄黃萎病病情指數(shù)(圖2-A)和發(fā)病率(圖2-B)均無顯著差異,而非滅菌土壤處理(M,I)的番茄黃萎病病情指數(shù)和發(fā)病率均顯著低于滅菌土壤處理(SM,SI),且非滅菌的分蘗洋蔥伴生番茄根際土壤處理(I)的番茄黃萎病病情指數(shù)和發(fā)病率顯著低于非滅菌番茄單作根際土壤處理(M)(P<0.05)。非滅菌分蘗洋蔥伴生番茄根際土壤處理(I)與非滅菌番茄單作土壤處理(M)病情指數(shù)和發(fā)病率分別為66.9與76.7和80.3%與88.1%,說明伴生土壤微生物在減輕番茄黃萎病中發(fā)揮重要作用。

圖中誤差線為標(biāo)準(zhǔn)誤差,不同小寫字母代表不同處理間差異顯著(P<0.05)。下同

2.2 根際土壤微生物對抗性基因表達(dá)的影響

具有伴生根際土壤(WTI)處理的番茄根系PR1相對表達(dá)量在接種 0 h、24 h、48 h后顯著高于番茄單作根際土壤(WTM)處理,分別上調(diào) 2.49倍、2.26倍、2.00倍;在接種V.dahliae0 h～48 h,具有番茄根際土壤處理PR1相對表達(dá)顯著高于無番茄根際土壤處理(圖3-A)。

圖3 分蘗洋蔥伴生土壤微生物處理下番茄根系PR基因的表達(dá)Fig.3 Relative expression of PRs in roots of potato onion incropping with tomato

具有番茄伴生根際土壤(WTI)處理番茄根系PR2相對表達(dá)量在接種V.dahliae24 h和 48 h后顯著高于番茄單作根際土壤(WTM)處理,分別上調(diào)1.40倍和1.43倍;在接種V.dahliae24 h和 48 h后,具有番茄根際土壤處理PR2相對表達(dá)顯著高于無番茄根際土壤處理,而無番茄單作根際土壤處理(NTM)和無番茄伴生根際土壤處理(NTI)的PR2相對表達(dá)量無顯著差異(圖 3-B)。

具有番茄伴生根際土壤(WTI)處理的番茄根系PR3相對表達(dá)量在接種V.dahliae48 h和96 h后顯著高于番茄單作根際土壤(WTM)處理,分別上調(diào)1.74倍和1.52倍;在接種V.dahliae48 h和96 h后,具有番茄根際土壤處理PR3相對表達(dá)顯著高于無番茄根際土壤處理 (圖3-C)。

防御酶基因LOX、PAL、PPO相對表達(dá)量如圖4所示。具有番茄伴生根際土壤(WTI)處理LOX相對表達(dá)量在接種V.dahliae96 h后顯著高于具有番茄單作根際土壤處理(WTM),上調(diào)1.37倍;在接種V.dahliae48 h后,具有番茄根際土壤處理LOX相對表達(dá)量顯著高于無番茄根際土壤處理,而無番茄根際土壤(NTM和NTI)處理間LOX相對表達(dá)量無顯著差異(圖4-A)。

圖4 分蘗洋蔥伴生土壤微生物處理下對番茄根系PAL、LOX和PPO基因的表達(dá)Fig.4 Relative expression of PAL,LOX and PPO in roots of potato onion incropping with tomato

在接種V.dahliae24 h和48 h后,具有番茄伴生根際土壤(WTI)處理的番茄根系PAL相對表達(dá)量顯著高于具有番茄單作根際土壤(WTM)處理,分別上調(diào)1.20倍和1.19倍,并且具有番茄根際土壤處理PAL相對表達(dá)量顯著高于無番茄根際土壤處理;在接種96 h,無番茄根際土壤(NTM和NTI)處理間PAL相對表達(dá)量無顯著差異(圖4-B)。

在接種 24 h、48 h和96 h后,具有伴生根際土壤(WTI)處理的番茄根系PPO相對表達(dá)量顯著高于具有單作根際土壤(WTM)處理,分別上調(diào)1.98倍、2.41倍和1.51倍;無番茄根際土壤(NTM和NTI)處理間PPO相對表達(dá)量無顯著差異(圖4-C)。

2.3 根際土壤微生物對防御酶活性的影響

在接種V.dahliae48 h和96 h后 ,具有番茄根際土壤處理的番茄根系PAL活性和PPO活性顯著高于無番茄單作根際土壤處理,并且具有番茄伴生根際土壤處理(WTI)的番茄根系PAL活性和PPO活性顯著高于具有番茄單作根際土壤處理(WTM);在96 h后達(dá)到最大值,PAL活性和PPO活性分別為1.20 U·mg-1·h-1與0.97 U·mg-1·h-1和0.38 U·g-1·min-1與0.42 U·g-1·min-1(圖5-A,5-B)。

圖5 分蘗洋蔥伴生土壤微生物處理下番茄根系防御酶的活性Fig.5 Defensive enzyme activity in roots of potato onion incropping with tomato

具有番茄伴生根際土壤(WTI)處理的番茄根系SOD活性在接種V.dahliae24 h和 48 h以后顯著高于具有番茄單作根際土壤(WTM)處理,并在接種 48 h后 SOD活性達(dá)到最大值,分別為181.04 U·g-1和199.06 U·g-1,而無番茄根際土壤(NTM和NTI)處理間SOD活性無顯著差異(圖5-C)。

在接種V.dahliae0 h,48 h和96 h后,具有番茄伴生根際土壤(WTI)處理β-1,3-葡聚糖酶活性顯著高于番茄單作根際土壤(WTM)處理, 并且在接種V.dahliae96 h后達(dá)到最大值,分別為0.31 U·g-1·min-1和0.28 U·g-1·min-1。在接種48 h和96 h后,無番茄根際土壤(NTM和NTI)處理間β-1,3-葡聚糖酶活性無顯著差異。(圖5-D)。

3 討 論

長期連作產(chǎn)生連作障礙,導(dǎo)致土傳病害發(fā)生,黃萎病是重要的土傳病害之一,嚴(yán)重影響了番茄的產(chǎn)量和質(zhì)量,造成巨大經(jīng)濟(jì)損失,是食品安全面臨主要挑戰(zhàn)之一[25-26]。多項研究表明,間作可以有效控制作物土傳病害[27-29],其中分蘗洋蔥伴生可以有效控制番茄黃萎病[19]。根際微生物是植物-土壤-植物病原菌的第一道防線[30-32]。最近的研究表明,間套作系統(tǒng)中植物之間的相互作用誘導(dǎo)土壤中有益微生物在根部富集,從而誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性。小麥/蠶豆間作可顯著提高土壤微生物活性和多樣性,提高蠶豆對枯萎病抗性,促進(jìn)蠶豆生長[27-28]。小麥/黃瓜間作提高了黃瓜根際中有益微生物(Pseudomonas,Haliangium和Archangiumspp.)的相對豐度,降低黃瓜枯萎病的嚴(yán)重程度[29,33]。分蘗洋蔥伴生番茄提高了番茄根際有益微生物(Bacillus和Pseudomonas)的相對豐度,降低了潛在植物病原菌(Cladosporium和Pseudallescheria)的相對豐度[9,34]。本研究通過植物-土壤反饋試驗明確了分蘗洋蔥伴生土壤微生物抑制番茄黃萎病的能力。接種V.dahliae10 d和15 d后,接種分蘗洋蔥伴生番茄的土壤降低了番茄黃萎病病情指數(shù)和發(fā)病率(圖2-A,2-B)。說明伴生土壤微生物發(fā)揮了作用,但這種作用是否與分蘗洋蔥伴生對番茄土壤微生物群落多樣性和組成的改變以及有益微生物在根部富集有關(guān),有待進(jìn)一步研究。

病程相關(guān)蛋白(PR)在寄主植物發(fā)病過程中被誘導(dǎo),并在感染組織中系統(tǒng)或局部積累,通常導(dǎo)致系統(tǒng)獲得抗性(SAR)的發(fā)展,從而抵抗相同或類似病原體的進(jìn)一步感染。本研究結(jié)果表明,接種V.dahliae后具有分蘗洋蔥伴生土壤微生物的番茄根系PR1表達(dá)量顯著高于番茄單作,并在接種V.dahliae24 h后PR1表達(dá)量達(dá)到最大值(圖3-A),與Fu等[19,35]研究結(jié)果一致。β - 1,3 -葡聚糖酶(glucanase)是參與植物抵御病原菌攻擊防御機(jī)制的致病相關(guān)蛋白(PRs),本研究結(jié)果表明,在接種V.dahliae后具有分蘗洋蔥伴生土壤微生物的番茄根系PR2和PR3表達(dá)量及β - 1,3 -葡聚糖酶活性顯著高于番茄單作(圖3-B,圖5-D),與García-Cristobal等[36]在水稻中的研究結(jié)果一致。

眾所周知,在病原菌侵染植物過程中,LOX在植物免疫力方面發(fā)揮著重要作用。LOX是在茉莉酸(JA)合成中起作用的關(guān)鍵酶,而茉莉酸(JA)是PAL/PPO誘導(dǎo)抗性中的正向調(diào)節(jié)因子[37]。本研究中分蘗洋蔥伴生的番茄根系中LOX基因相對表達(dá)量顯著高于其他處理(圖4-B),與Mariutto等[38]研究結(jié)果一致。接種分蘗洋蔥伴生的番茄土壤可以提高番茄根系PAL和PPO表達(dá)量和增強(qiáng)PAL和PPO活性(圖4-A, 4-C,5-A,5-B),與曾玥等[39]和孫藍(lán)笛[40]研究結(jié)果一致。

病原菌侵染植物后,破壞植物體內(nèi)ROS代謝平衡,導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞,代謝系統(tǒng)紊亂,嚴(yán)重會威脅植物健康,而過氧化物酶(POD)是清除植物體內(nèi)過多活性氧的關(guān)鍵酶[41-42]。植物通過產(chǎn)生活性氧(ROS)對抗病原體的攻擊,其復(fù)雜的平衡是通過組織良好的抗氧化清除途徑實現(xiàn)的[43]。本研究表明,與番茄單作土壤微生物處理相比,分蘗洋蔥伴生番茄土壤微生物增強(qiáng)了番茄根系SOD酶活性(圖5-C),SOD通過有效清除活性氧,減輕氧化脅迫而提高植物對非生物脅迫的抗性[44]。

4 結(jié) 論

在V.dahliae染的過程中,分蘗洋蔥伴生土壤微生物降低了番茄黃萎病的發(fā)病率和病情指數(shù);同時提高了番茄根系中PAL、PPO、SOD、β-1,3-葡聚糖酶活性和提高LOX、PPO、PAL、PR(PR1、PR2和PR3)表達(dá)量。因此,分蘗洋蔥伴生番茄根際微生物通過致病相關(guān)蛋白和氧化脅迫的協(xié)同作用啟動防御反應(yīng),增強(qiáng)番茄對黃萎病的抗性。