于 杜，周錦悅，陳圓圓，劉 鑫，瞿朝霞，唐珊珊

（1.懷化學(xué)院，民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湘西藥用植物與民族植物學(xué)湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 懷化 418008；2.湖南省農(nóng)業(yè)信息與工程研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125）

硝酸鹽和亞硝酸鹽是自然界中最為普遍的含氮化合物[1]。硝酸鹽可在微生物作用下還原為亞硝酸鹽，其外觀和味道與食鹽相似，被允許以有限的量用作肉制品著色劑。但亞硝酸鹽對(duì)人體有危害，一次攝入0.3～0.5 g 亞硝酸鹽即可中毒，一次攝入量達(dá)3 g 就可致命[2]；同時(shí)，亞硝酸鹽還可直接造成水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物病害或死亡[3-4]。湘西酸肉是湖南西部少數(shù)民族自治州傳承下來(lái)的風(fēng)味佳肴，其生產(chǎn)過(guò)程中，亞硝酸鹽含量會(huì)隨著發(fā)酵天數(shù)的增加呈S 形曲線變化。大量研究證實(shí)，湘西酸肉中亞硝酸鹽出現(xiàn)降低拐點(diǎn)的原因可能與其富含多種益生菌有關(guān)。

在湘西酸肉或者其同類產(chǎn)品泡菜中，有降亞硝酸鹽能力且活性較強(qiáng)的就是乳酸菌。張曉娟等[5]在無(wú)菌條件下用生理鹽水對(duì)來(lái)自成都和溫江的泡菜汁樣品進(jìn)行梯度稀釋，從中分離出亞硝酸鹽降解能力強(qiáng)、產(chǎn)酸量高、耐酸耐鹽的菌株，經(jīng)鑒定為植物乳桿菌。劉笑笑等[6]從具有民族特色的延邊朝鮮族地區(qū)采集24 份傳統(tǒng)發(fā)酵櫻菜，從中分離篩選具有降解亞硝酸鹽功能的菌株，通過(guò)形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)和16S rRNA 序列分析進(jìn)行鑒定，獲得1 株具有降解亞硝酸鹽功能的腸膜明串珠菌（Leuconostocmesenteroides）。Fu 等[7]從水產(chǎn)養(yǎng)殖魚塘污泥中分離出一株能有效降解亞硝酸鹽的施氏假單胞菌，該菌在亞硝酸鹽混合溶液中連續(xù)馴化后，其亞硝酸鹽氮還原能力顯著提高。曹海鵬等[8]從養(yǎng)殖污泥中分離篩選了一株優(yōu)良的亞硝酸鹽降解菌YX01，被鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。陳曦等[9]從貴州自然發(fā)酵的酸肉中分離出19 株乳酸菌，在MRS 培養(yǎng)基中篩選出降亞硝酸鹽能力最強(qiáng)的3 株乳酸菌，經(jīng)鑒定3 株乳酸菌分別為植物乳桿菌CMRC 3、戊糖片球菌CMRC 7 和植物乳桿菌CMRC 19。王會(huì)聰?shù)萚10]從水產(chǎn)養(yǎng)殖污泥中分離篩選了一株優(yōu)良的亞硝酸鹽降解菌AQ-3，其濃度為1.0×107CFU/mL 時(shí)對(duì)50 mg/L 亞硝酸鹽的去除率高達(dá)99.47%，該菌株被鑒定為鮑曼氏不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumannii）。綜上所述，乳桿菌、腸膜明串珠菌、假單胞菌、芽孢桿菌、片球菌和不動(dòng)桿菌等對(duì)食品中殘留的亞硝酸鹽都有比較明顯的去除效果。

基于前人的研究結(jié)果，筆者以亞硝酸鹽降解率為指標(biāo)，對(duì)從湘西酸肉中分離出的若干菌種進(jìn)行初篩和復(fù)篩，獲得可高效降解亞硝酸鹽的優(yōu)勢(shì)菌種，并對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)鑒定，為生產(chǎn)降解亞硝酸鹽的發(fā)酵劑提供原料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料：新鮮五花肉，鹽，糯米粉。試驗(yàn)設(shè)備：無(wú)菌水，三角瓶，MRS 固、液培養(yǎng)基，恒溫箱，顯微鏡等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酸肉制作 取肥、瘦相間的新鮮五花肉300 g，洗凈瀝水，切成一指寬的薄塊，加入30 g 鹽腌制4 h，加入充足的糯米粉拌勻，裝入壇中密封，放置在陰涼干燥處自然發(fā)酵14 d 即制作完成。

1.2.2 菌種的分離純化 （1）菌株的富集培養(yǎng)。稱取10 g 湘西酸肉，剪碎后加入到盛有90 mL 無(wú)菌水的三角瓶中，將無(wú)菌水和酸肉混合均勻后，吸取1 mL 的混合液體加到MRS 液體培養(yǎng)基中，在37℃下培養(yǎng)48 h。（2）梯度稀釋。從培養(yǎng)基中取1 mL 液體逐步稀釋成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，每個(gè)釋倍數(shù)取0.1 mL 添加至MRS 固體培養(yǎng)基上，在37℃溫度下培養(yǎng)48 h。（3）菌株的分離純化與鏡檢。從顏色、大小、粗糙程度等方面挑選典型的菌株，觀察其形態(tài)，反復(fù)劃線、分離純化獲得純化菌株，再對(duì)分離純化后的菌株進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察其形態(tài)并記錄結(jié)果。

1.2.3 降解高亞硝酸鹽菌株的篩選 將經(jīng)過(guò)多次純化的菌株接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，于37℃條件下培養(yǎng)18 h，取培養(yǎng)好的菌液按4%的體積分?jǐn)?shù)接種于含有200 mg/L NaNO2的100 mL MRS 液體培養(yǎng)基中，在37℃下培養(yǎng)48 h，通過(guò)鹽酸萘乙二胺顯色法觀察各菌株培養(yǎng)液的顏色變化，選出顏色較淺的菌株，再進(jìn)行復(fù)篩[11]。復(fù)篩菌株按1%（體積分?jǐn)?shù)）接種于100 mL 含有300 mg/L NaNO2的MRS 液體培養(yǎng)基中，在37℃下培養(yǎng)48 h 之后測(cè)定培養(yǎng)液中的NaNO2含量，計(jì)算菌株的亞硝酸鹽降解率，然后選出對(duì)亞硝酸鹽有較強(qiáng)降解能力的菌株[12]。復(fù)篩后的菌株于37℃條件下進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，增加菌株濃度后妥善低溫保存[13]。

1.2.4 指標(biāo)檢測(cè) （1）亞硝酸鹽含量測(cè)定。參照GB/T 5009.33—2016 通過(guò)鹽酸萘乙二胺分光光度法測(cè)定培養(yǎng)液中亞硝酸鹽的含量。（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線制作。用容量瓶配置好5.0 mg/mL 的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液。吸取0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、3.00、4.00 mL 亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液，依次加入到50 mL 的比色管中；每個(gè)比色管中加入2 mL 對(duì)氨基苯磺酸，輕微搖晃混勻后靜置3～5 min；再加入1 mL 鹽酸萘乙二胺，添加水至刻度線，輕晃搖勻，暗處?kù)o置15 min；將配置好的溶液倒入1 cm 玻璃比色皿中，用零號(hào)管調(diào)節(jié)零點(diǎn)，測(cè)量538 nm 處吸光度。根據(jù)吸光度值（y）和對(duì)應(yīng)的亞硝酸鈉溶液濃度（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。

圖1 亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.5 菌種鑒定 提取復(fù)篩所得菌株的DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增[14]，然后進(jìn)行測(cè)序，將各菌株DNA 序列在NCBI 網(wǎng)站上進(jìn)行blastn 比對(duì)，確定近似菌株。用MEGA 軟件構(gòu)建復(fù)篩菌株與近似菌株的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，根據(jù)復(fù)篩菌株在其屬類中的親緣關(guān)系確定菌種名稱。

1.2.6 降亞硝酸鹽菌株發(fā)酵條件優(yōu)化 以菌1 為供試菌株，以發(fā)酵液在538 nm 處的吸光度值為考察指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)從亞硝酸鹽添加量（100、200、300、400、500 mg/L）、pH 值（3、4、5、6、7）、接種量（1%、2%、3%、4%、5%）3 個(gè)方面對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，固定條件：亞硝酸鹽濃度為300 mg/L，pH 值為6.5，接種量為1%，37℃下培養(yǎng)48 h，檢測(cè)各處理菌液的OD538值，得出菌液中亞硝酸的濃度，再計(jì)算亞硝酸鹽降解率。每個(gè)處理3 次重復(fù)。

1.2.7 不同亞硝酸鹽對(duì)菌液中生物量的影響 配置亞硝酸鹽濃度為100、200、300、400、500 mg/L 的培養(yǎng)基，接入1 %菌種1 菌懸液，37℃下培養(yǎng)48 h，檢測(cè)菌液的OD600值，測(cè)定菌液中生物量的濃度，根據(jù)菌種在不同亞硝酸鹽濃度下的生物量變化判斷其是否耐受亞硝酸鹽。

2 結(jié)果與分析

2.1 湘西酸肉中分離所得微生物的形態(tài)特征

將從酸肉中分離得到的菌株進(jìn)行純化后，得到了5 株在MRS 瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好的菌株，將獲得的5 株菌編號(hào)為1～5，菌株形態(tài)見(jiàn)表1，5 株菌的菌落大多呈光滑圓形，基本呈白色，都有凸起存在且不透明。在顯微鏡下，從酸肉中分離得到的5 株菌株均符合一般微生物形態(tài)特征，都沒(méi)有假菌絲，細(xì)胞形態(tài)有橢圓狀、球狀、桿狀。

表1 湘西酸肉中分離所得微生物的形態(tài)

2.2 初篩結(jié)果

利用鹽酸萘乙二胺顯色法對(duì)5 種菌株降亞硝酸鹽能力進(jìn)行初篩，結(jié)果如圖2 所示，有4 個(gè)試管溶液顏色變化明顯，說(shuō)明這4 個(gè)菌株的降亞硝酸鹽能力較強(qiáng)，而5 號(hào)試管（圖2 中從左到右數(shù)第5 管）與空白對(duì)照顏色變化不明顯，說(shuō)明該菌株降解亞硝酸鹽的能力不強(qiáng)。選擇降亞硝酸鹽能力較強(qiáng)的4 個(gè)菌株進(jìn)行復(fù)篩。

圖2 湘西酸肉中降解亞硝酸鹽菌株的初篩結(jié)果

2.3 復(fù)篩結(jié)果

將初篩出的4 株菌株接種于100 mL 含300 mg/L NaNO2的MRS 液體培養(yǎng)基中，37℃條件下培養(yǎng)48 h后測(cè)定培養(yǎng)液中NaNO2含量，并計(jì)算各菌株的亞硝酸鹽降解率，結(jié)果如表2 所示，菌1 降解亞硝酸鹽的能力最強(qiáng)，能達(dá)到71.06%，其余3 種菌也有較強(qiáng)的亞硝酸鹽降解能力，有一定的研究?jī)r(jià)值。

表2 湘西酸肉中降解亞硝酸鹽菌株的復(fù)篩結(jié)果

2.4 降解亞硝酸鹽菌株的鑒定結(jié)果

提取4 個(gè)菌株的DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，其中菌1、菌2 擴(kuò)增的是ITS序列，菌3、菌4 擴(kuò)增的是16S rDNA 序列；所得條帶經(jīng)電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖3 所示，4 個(gè)菌種均顯示出明亮無(wú)雜峰的條帶，說(shuō)明菌種純化效果好，菌種純度高。

圖3 復(fù)篩所得菌株的DNA 擴(kuò)增結(jié)果

切取目的條帶測(cè)序，獲得4 個(gè)菌株的部分基因序列，用ContigExpress 拼接測(cè)序結(jié)果，并去除兩端不準(zhǔn)的部分，再將拼接好的序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)（blast.ncbi.nlm.nih.gov）中進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 菌株基因比對(duì)結(jié)果

菌1、菌2 的ITS區(qū)段為5 000 bp 的DNA 片段。將拼接好的序列上傳至Genbank 數(shù)據(jù)庫(kù)中，獲得登錄號(hào)為MT645454.1 和KY105880.1，將該序列進(jìn)行BLAST，顯示菌1、菌2 與GenBank 中已登錄的威克漢姆酵母（Wickerhamomyces）序列的同源性分別為100%和99%，從而在分子生物學(xué)的水平上說(shuō)明了菌1、菌2 為Wickerhamomycessp.。為了進(jìn)一步比較該分離菌與威克漢姆酵母的親緣關(guān)系，與數(shù)據(jù)庫(kù)中其他酵母屬的菌株構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)如圖4 和圖5 所示，菌1、菌2 與已報(bào)道的W.anomalus有90%以上的相似度，聚合在一起。因此，結(jié)合菌1、菌2 的形態(tài)學(xué)特征以及基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可知，菌1 和菌2 均為Wickerhamomyces anomalus。

圖4 基于ITS 序列的菌種1 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖5 基于ITS 序列的菌種2 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

菌3、 菌4 的16S rDNA 區(qū) 段 為5 000 bp 的DNA 片段。將拼接好的序列上傳至Genbank 數(shù)據(jù)庫(kù)中，獲得登錄號(hào)為AB362606.1 和CP048116.1，將該序列進(jìn)行BLAST，顯示該菌株與GenBank 中已登錄的乳酸菌（Latilactobacillus）序列同源性都為100%，從而在分子生物學(xué)水平上說(shuō)明獲得的菌株為L(zhǎng)atilactobacillussp.。為了進(jìn)一步比較該分離菌與乳酸菌的親緣關(guān)系，與數(shù)據(jù)庫(kù)中其他乳酸菌屬的菌株構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)如圖6 和圖7 所示，菌3、菌4 與已報(bào)道的L.sakei有90%以上的相似度，聚合在一起。因此，結(jié)合菌3、菌4 的形態(tài)學(xué)特征以及基于16S rDNA 序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可知，菌3 和菌4 均為L(zhǎng)atilactobacillus sakei。

圖6 基于16S rDNA 序列的菌種3 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖7 基于16S rDNA 序列的菌種4 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.5 菌1 發(fā)酵條件的優(yōu)化結(jié)果

2.5.1 亞硝酸鹽含量 從圖8 可以看出，在pH 值、接種量、培養(yǎng)時(shí)間不變的情況下，隨著亞硝酸鹽含量的增加，菌1 的亞硝酸鹽降解率不斷升高，說(shuō)明菌1 的亞硝酸鹽降解能力不隨亞硝酸鹽濃度的增加而減弱，反而有所提升，表明菌1 的亞硝酸鹽降解力強(qiáng)。

圖8 亞硝酸鹽含量對(duì)菌株1 亞硝酸鹽降解能力的影響

2.5.2 pH 值 從圖9 可看出，在接種量、亞硝酸鹽濃度、培養(yǎng)時(shí)間不變的情況下，隨著pH 值的提高，菌1 的亞硝酸鹽降解率呈現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢(shì)，pH 值為4 時(shí)，菌1 的亞硝酸鹽降解率最高，達(dá)到了78.35%，表明菌1 在pH 值為4 時(shí)活性最高，對(duì)亞硝酸鹽分解效率最大。

圖9 pH 值對(duì)菌株1 亞硝酸鹽降解能力的影響

2.5.3 接種量 由圖10 可知，在pH 值、亞硝酸鹽濃度、培養(yǎng)時(shí)間不變的情況下，隨著接種量的提高，菌1 的亞硝酸鹽降解率有所升高。接種量為4%時(shí)，菌1 的亞硝酸鹽降解率最大，達(dá)到82.74%。當(dāng)接種量小于4%時(shí)，細(xì)胞初始濃度較低，需要一定時(shí)間來(lái)生長(zhǎng)繁殖，導(dǎo)致亞硝酸鹽降解率低；當(dāng)接種量大于4%時(shí)，菌種更快地達(dá)到種群密度的最高點(diǎn)，減少雜菌的生長(zhǎng)機(jī)會(huì)，但接種量過(guò)大會(huì)更快產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)抑制，使菌株的種間競(jìng)爭(zhēng)加劇，從而降低亞硝酸鹽降解率。

圖10 接種量對(duì)菌株1 亞硝酸鹽降解能力的影響

2.6 亞硝酸鹽濃度對(duì)菌液中生物量的影響

在溫度、接種量、pH 值等條件一致的情況下，培養(yǎng)基中亞硝酸鹽濃度對(duì)菌1 生物量的影響如圖11所示，隨著亞硝酸鹽濃度的增加，菌1 的生物量成下降趨勢(shì)，說(shuō)明亞硝酸鹽可以抑制菌1 的生長(zhǎng)，并且隨著亞硝酸鹽濃度的升高，對(duì)菌1 生長(zhǎng)的抑制作用越強(qiáng)，但是降幅不大，說(shuō)明該菌種耐受亞硝酸鹽。

圖11 亞硝酸鹽濃度對(duì)菌株1 生物量的影響

3 結(jié) 論

從自制湘西酸肉中分離純化出了4 株亞硝酸鹽降解能力強(qiáng)的菌株，其中菌1 和菌2 在培養(yǎng)過(guò)程中散發(fā)出明顯酒精氣味，且菌落較大，顯微鏡下呈圓球狀；菌3 和菌4 散發(fā)出濃烈的酸味，且菌落較小，顯微鏡下呈桿狀。研究中發(fā)現(xiàn)這4 株菌株均有一定降解亞硝酸鹽的能力，其中菌1 的降解能力最強(qiáng)，在300 mg/L 的亞硝酸鹽發(fā)酵液中培養(yǎng)48 h 后，亞硝酸鹽的降解率達(dá)到70%以上。對(duì)篩選出來(lái)的4 種菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，確定菌1 和菌2 屬于酵母菌，菌3 和菌4 屬于乳酸菌，分別構(gòu)建基于IST和16S rDNA 序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，發(fā)現(xiàn)菌1 和菌2 與Wickerhamomyces anomalus的親緣關(guān)系最近，歸類為異常威克漢姆酵母；菌3 和菌4 與Lactobacillus sakei的親緣關(guān)系最近，確認(rèn)為清酒乳桿菌。

試驗(yàn)還以菌1 為研究對(duì)象，對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，菌1 在接種量為4%，pH 值為4 時(shí)，對(duì)亞硝酸鹽的降解率達(dá)到最大值；菌1 對(duì)亞硝酸鹽的降解率隨著亞硝酸鹽含量的增加而提升，但其生物量隨著亞硝酸鹽濃度的增加而減少，但是降幅較小，說(shuō)明該酵母菌具有較強(qiáng)的高亞硝酸鹽耐性，且對(duì)亞硝酸鹽的降解能力較強(qiáng)。

目前，有關(guān)降解亞硝酸鹽菌株的研究中，關(guān)于酵母菌的研究報(bào)道尚不多見(jiàn)，該研究結(jié)果為以后酸肉、泡菜等發(fā)酵食品的菌種選擇提供了參考，也為生產(chǎn)廠家提供了明確的菌種資源。