鄒 敏，翟 陽，肖持堅(jiān)，梁 敏，徐怡輝，蘭小婉，梅小平

（1.廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院兒科，廣西 南寧 530001； 2.廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院腦病科，廣西 南寧 530001；3.廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院內(nèi)分泌代謝病科，廣西 南寧 530001）

病毒性呼吸道感染（如甲型流感病毒） 是世界范圍內(nèi)常見且危及生命的疾病［1］。肺上皮細(xì)胞是甲型流感病毒復(fù)制的主要部位，肺下呼吸道感染可能會發(fā)展為致命的肺炎［2］。Toll 樣受體3 （toll-like receptors 3，TLR3） 在肺上皮細(xì)胞對甲型流感病毒的免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用［3］。在病毒復(fù)制過程中產(chǎn)生的雙鏈RNA （dsRNA） 被TLR3 感知，甲型流感病毒優(yōu)先激活TLR3，TLR3 在感染致命的甲型流感病毒和隨后的炎癥過程中起關(guān)鍵作用［4］。轉(zhuǎn)化生長因子β激活激酶1 （transforming growth factor-β-activated kinase 1，TAK1） 已被證明是TLR 信號傳導(dǎo)介質(zhì)，TLR3 通過促進(jìn)TAK1 活化導(dǎo)致核因子-κB （nuclear factor-κB，NF-κB） 等下游反應(yīng)元件激活，最終導(dǎo)致促炎因子釋放［5-6］。故針對TLR3/TAK1/NF-κB 信號通路開發(fā)更安全有效的抗炎抗病毒藥物具有重要意義。

中醫(yī)藥及特定方劑在病毒感染防治上具有其獨(dú)特的優(yōu)勢和發(fā)展前景［7］。壯宣飲是在壯藥龍盤止咳方基礎(chǔ)上化裁而來，具扶正補(bǔ)虛、清熱宣肺、化痰止咳功效。現(xiàn)代藥理研究表明，壯藥龍盤止咳方對肺部炎癥損傷具有保護(hù)作用［8-9］，還可能通過抑制TLR3/NF-KB 信號通路，減輕甲型流感病毒感染小鼠肺損傷［10］。而壯宣飲是否對流感病毒性肺炎具有保護(hù)作用尚未可知。因此，本研究采用甲型流感病毒的常見亞型H1N1 誘導(dǎo)建立流感病毒性肺炎大鼠模型，探究壯宣飲抗流感作用，并分析其潛在機(jī)制。

1 材料

1.1 動物 SPF 級雄性Sprague-Dawley （SD） 大鼠72 只，體質(zhì)量300～350 g，7 ～8 周齡，購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動物繁育有限公司［實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號SCXK （魯） 2019-0003］，飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)［實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號SYXK （桂） 2019-0001］，環(huán)境溫度（20±2）℃，相對濕度45% ～55%，保持12 h/12 h 光照/黑暗循環(huán)。動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院動物倫理委員會審查通過 （倫理號GXZYY20210018）。

1.2 病毒 甲型流感病毒毒株A/PuertoRico/8/34 （PR8，H1N1） 由中國疾病預(yù)防控制中心提供。病毒接種在Madin-Darby 犬腎細(xì)胞（MDCK） 中進(jìn)行純化，在10 日齡的雞胚中進(jìn)行復(fù)制，通過噬斑測定確定病毒滴度。實(shí)驗(yàn)開始前，在大鼠中預(yù)先滴定不同濃度病毒以確定合適的攻擊劑量，最終確定1×106PFU/mL 的濃度建立H1N1 肺炎大鼠模型。所有涉及病毒感染的實(shí)驗(yàn)均在生物安全三級（BSL-3） 實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.3 藥物 壯宣飲由龍脷葉10 g、魚腥草10 g、不出林5 g、柿葉5 g、盤龍參5 g、陳皮10 g、法半夏5 g、炙麻黃5 g、五味子5 g、白術(shù)8 g、炒麥芽8 g、甘草3 g 組成，均購自北京同仁堂南寧大藥房，經(jīng)專家鑒定為正品，由廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院制劑室制備。將上述藥材加水煎煮2 次后合并藥液，濃縮至生藥量0.7 g/mL。磷酸奧司他韋顆粒（宜昌東陽光長江藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20080763，15 mg，批號190614）。

1.4 試劑 蘇木精-伊紅（HE） 染色試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號C0105S）； 大鼠IL-6、TNF-α、IFN-γ ELISA 試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，貨號ml102828、ml002859、ml064291）； 兔源一抗TLR3、TAK1、p-TAK1、NF-κB p65、p-NF-κB p65、β-actin （英國Abcam公司，貨號 ab137722、ab109526、ab109404、ab16502、ab76302、ab8227）。

1.5 儀器 iMark680 多功能酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad 公司）；ABI Prism?7500型熒光定量PCR 儀（美國Applied Biosystems公司）； BX53 光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司）。

2 方法

2.1 分組、建模及給藥 將大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、奧司他韋組（13.5 mg/kg） 和壯宣飲高、中、低劑量組（14.0、7.0、3.5 g/kg），每組12 只，腹腔注射戊巴比妥鈉（40 mg/kg） 麻醉，除對照組外其余各組大鼠鼻內(nèi)滴入100 μL 甲型流感病毒 （PR8） 病毒溶液 （1 × 106PFU/mL） 誘導(dǎo)建立感染肺炎模型［11］； 對照組滴入等量無菌生理鹽水，感染大鼠均未死亡。感染24 h 后，各給藥組灌胃給予相應(yīng)劑量藥物，對照組灌胃給予等體積生理鹽水，每天2 次（早晚各1 次），持續(xù)5 d。

2.2 指標(biāo)檢測

2.2.1 大鼠一般狀態(tài) 在實(shí)驗(yàn)過程中觀察大鼠一般狀態(tài)變化，包括精神狀態(tài)、活動、飲食、毛色、體質(zhì)量等。

2.2.2 支氣管肺泡灌洗液（BALF） 中炎性因子水平 給藥結(jié)束后，每組隨機(jī)選取6 只大鼠，在無菌條件下于頸部正中行氣管插管，分離氣管叉并結(jié)扎右側(cè)肺主支氣管，將2 mL 生理鹽水通過注射器緩慢注入左肺，重復(fù)3 次，回收BALF （約3 mL）。紗布過濾后將BALF 于4 ℃下2 000 r/min離心10 min，取上清液于-20 ℃冰箱中保存待測。通過ELISA 法檢測BALF 中TNF-α、IFN-γ、IL-6 水平。

2.2.3 肺濕/干重比 收集BALF 后處死大鼠，取左側(cè)肺組織，PBS 洗滌后濾紙干燥并稱量濕重，然后放入80 ℃烘箱中連續(xù)干燥48 h，再稱量干重，計(jì)算肺濕/干重比。

2.2.4 肺組織病理學(xué)觀察 剩余6 只大鼠處死后取肺組織，將左肺于4%多聚甲醛中固定用于組織病理學(xué)分析； 右肺置于-80 ℃保存。將固定的左肺組織用石蠟包埋，然后切5 μm 切片，經(jīng)脫蠟水化后，用HE 染液進(jìn)行染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察，并評估肺損傷的嚴(yán)重程度［12］。評分標(biāo)準(zhǔn)為0 分，肺組織正常，未見明顯病理損傷； 1 分，肺組織炎性細(xì)胞浸潤低于25%，肺泡腔內(nèi)無炎性分泌物； 2 分，肺組織炎性細(xì)胞浸潤范圍25% ～50%，肺泡腔內(nèi)有少量炎性分泌物和炎性細(xì)胞； 3 分，肺組織炎性細(xì)胞浸潤范圍50% ～75%，肺泡腔內(nèi)可見大量炎性分泌物和炎性細(xì)胞； 4分，肺受累范圍大于75%，肺泡腔內(nèi)充滿炎性分泌物和炎性細(xì)胞并擴(kuò)張。

2.2.5 RT-qPCR 法檢測肺組織H1N1 病毒載量 使用TRIzol 試劑提取右肺下葉組織總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用SYBR ? Premix Ex TaqTMII 試劑盒在ABI Prism?7500 型熒光定量PCR 儀上進(jìn)行RT-qPCR 反應(yīng)。反應(yīng)體系（20 μL） 為1 μL cDNA、10 μL 2×SYBR Green Supermix、正反向引物各1 μL、7 μL ddH2O。擴(kuò)增條件為95 ℃5 min，95 ℃10 s，60 ℃30 s，72 ℃20 s，共40 個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因，2-ΔΔCT法計(jì)算病毒相對定量。H1N1 病毒M 基因正向引物序列5′-GAGAAAGAAGTCCTTGTGC-3′，反 向 引 物 序 列 5′-TCTATCATTCCAGTCCATCCC-3′；GAPDH正向引物序列5′-GACATCAAGAAGGTGGTGAAG-3′，反向引物序列 5′-GGAAATTGTGAGGGAGATGC-3′。

2.2.6 Western blot 法檢測肺組織TLR3/TAK1/NF-κB 信號通路相關(guān)蛋白表達(dá) 將右肺中、下葉組織加RIPA 緩沖液（含蛋白酶和磷酸酶抑制劑） 裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液，即為總蛋白溶液。使用BCA試劑盒測量蛋白質(zhì)濃度，經(jīng)煮沸變性后取等量蛋白（30 μg），用10% SDS-PAGE 凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF） 膜上，室溫下5% 脫脂牛奶封閉1 h，加一抗TLR3、TAK1、p-TAK1、IκBα、p-IκBα、p-NF-κB p65、NF-κB p65、β-actin （1 ∶2 000） 4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3 次，與HRP 偶聯(lián)的二抗在室溫下孵育1 h。增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑（ECL） 顯色，通過Image J 軟件量化條帶的灰度值，以β-actin 為內(nèi)參計(jì)算目的蛋白表達(dá)量。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

近年來，中國銀行云南省分行堅(jiān)持科技引領(lǐng)，大力發(fā)展金融科技，借助大數(shù)據(jù)、人工智能等新技術(shù)、新手段，開展產(chǎn)品與服務(wù)模式創(chuàng)新，研發(fā)推廣中銀E貸、中銀慧投、移動柜臺等金融科技產(chǎn)品和終端，使傳統(tǒng)銀行服務(wù)網(wǎng)絡(luò)化、智能化，為客戶提供更加便捷和人性化的服務(wù)。同時(shí)，創(chuàng)新應(yīng)用區(qū)塊鏈、人臉識別、指紋識別等生物識別技術(shù)，為客戶打造更加安全、快捷、方便的使用體驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 壯宣飲對流感病毒性肺炎大鼠一般狀態(tài)的影響 對照組大鼠精神狀態(tài)良好，皮毛潔白有光澤，飲食和呼吸均正常，行動和反應(yīng)靈敏，體質(zhì)量增加； 模型組大鼠精神萎靡，毛色枯黃無光澤，飲食減少，呼吸加快，行動遲緩，體質(zhì)量降低； 奧司他韋組和壯宣飲高劑量組大鼠精神狀態(tài)較正常，皮毛有光澤，飲食增加，呼吸較平穩(wěn)，體質(zhì)量增加；壯宣飲中、低劑量組大鼠精神狀態(tài)一般，皮毛欠光澤，飲食尚可，呼吸有急促現(xiàn)象，行動和反應(yīng)略遲鈍，體質(zhì)量增加較少，大鼠整體狀態(tài)較模型組有所好轉(zhuǎn)，見表1。

表1 壯宣飲對流感病毒性肺炎大鼠體質(zhì)量的影響（g，±s，n＝12）

表1 壯宣飲對流感病毒性肺炎大鼠體質(zhì)量的影響（g，±s，n＝12）

注： 與對照組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃P＜0.05。

組別給藥前給藥后對照組319.65±28.29370.98±31.20模型組314.40±30.05325.46±27.35**奧司他韋組315.37±25.62359.80±30.71＃壯宣飲高劑量組312.25±26.48361.25±28.04＃壯宣飲中劑量組317.81±24.59342.30±26.18壯宣飲低劑量組316.60±25.02330.72±24.26

3.2 壯宣飲對流感病毒性肺炎大鼠BALF 中TNF-α、IFNγ、IL-6 水平的影響 與對照組比較，模型組大鼠BALF 中TNF-α、IFN-γ、IL-6 水平升高（P＜0.01）； 與模型組比較，奧司他韋組和壯宣飲各劑量組大鼠BALF 中TNF-α、IFNγ、IL-6 水平降低（P＜0.01），并呈劑量依賴性，見表2。

表2 壯宣飲對流感病毒性肺炎大鼠BALF 中TNF-α、IFN-γ、IL-6 水平的影響（pg/mL，±s，n＝6）

表2 壯宣飲對流感病毒性肺炎大鼠BALF 中TNF-α、IFN-γ、IL-6 水平的影響（pg/mL，±s，n＝6）

注： 與對照組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃＃P＜0.01。

組別TNF-αIFN-γIL-6對照組31.15±5.2815.96±2.0124.81±3.59模型組162.90±8.79** 89.72±5.25** 115.20±7.10**奧司他韋組59.72±6.03＃＃ 35.30±4.20＃＃ 47.53±4.21＃＃壯宣飲高劑量組56.45±6.14＃＃ 33.54±3.61＃＃ 41.66±5.17＃＃壯宣飲中劑量組88.31±7.50＃＃ 58.18±4.79＃＃ 65.85±5.90＃＃壯宣飲低劑量組 124.25±9.01＃＃ 70.23±5.04＃＃ 83.14±6.82＃＃

3.3 壯宣飲對流感病毒性肺炎大鼠肺濕/干重比的影響 與對照組比較，模型組大鼠濕/干重比值升高（P＜0.01）；與模型組比較，奧司他韋組和壯宣飲各劑量組大鼠濕/干重比值降低（P＜0.05，P＜0.01），并呈劑量依賴性，見表3。

表3 壯宣飲對流感病毒性肺炎大鼠肺濕/干重比、組織病理學(xué)評分的影響（±s，n＝6）

表3 壯宣飲對流感病毒性肺炎大鼠肺濕/干重比、組織病理學(xué)評分的影響（±s，n＝6）

注： 與對照組比較，**P ＜0.01； 與模型組比較，＃P ＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別濕/干重比病理學(xué)評分/分對照組2.68±0.320.39±0.05模型組4.79±0.50**2.85±0.31**奧司他韋組3.25±0.38＃＃1.47±0.19＃＃壯宣飲高劑量組3.19±0.35＃＃1.42±0.16＃＃壯宣飲中劑量組3.64±0.42＃＃1.89±0.20＃＃壯宣飲低劑量組4.00±0.45＃2.36±0.27＃＃

3.4 壯宣飲對流感病毒性肺炎大鼠肺組織病理形態(tài)的影響 對照組大鼠肺泡壁正常，肺泡腔完整，無炎性細(xì)胞浸潤； 模型組可見肺泡壁增厚，肺泡腔內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤和滲出物，肺組織病理學(xué)評分較對照組升高（P＜0.01）；與模型組比較，奧司他韋組和壯宣飲各劑量組大鼠肺泡壁增厚不明顯，肺泡腔內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤和滲出物減少，肺組織病理學(xué)評分降低（P＜0.01），并呈劑量依賴性，見表3、圖1。

圖1 各組大鼠肺組織HE 染色（×200）

3.5 壯宣飲對流感病毒性肺炎大鼠肺組織H1N1 病毒載量的影響 與對照組比較，模型組大鼠肺組織中H1N1 病毒載量升高（P＜0.01）； 與模型組比較，奧司他韋組和壯宣飲各劑量組大鼠肺組織中H1N1 病毒載量降低（P＜0.01），并呈劑量依賴性，見表4。

表4 壯宣飲對流感病毒性肺炎大鼠肺組織H1N1 病毒載量的影響（±s，n＝6）

表4 壯宣飲對流感病毒性肺炎大鼠肺組織H1N1 病毒載量的影響（±s，n＝6）

注： 與對照組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃＃P＜0.01。

組別H1N1 病毒拷貝數(shù)/cop對照組1.43±0.19模型組234 562.18±27 682.52**奧司他韋組68 357.41±10 857.08＃＃壯宣飲高劑量組67 534.32±10 260.43＃＃壯宣飲中劑量組113 580.60±16 428.75＃＃壯宣飲低劑量組176 045.53±20 541.96＃＃

圖2 各組大鼠肺組織TLR3/TAK1/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白條帶

表5 壯宣飲對流感病毒性肺炎大鼠肺組織TLR3/TAK1/NF-κB 信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝6）

表5 壯宣飲對流感病毒性肺炎大鼠肺組織TLR3/TAK1/NF-κB 信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝6）

注： 與對照組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別TLR3p-TAK1/TAK1p-IκBαIκBαp-NF-κB p65/NF-κB p65對照組0.10±0.010.15±0.020.12±0.020.54±0.060.23±0.03模型組0.37±0.04**0.60±0.07**0.49±0.05**0.16±0.03**0.85±0.09**奧司他韋組0.19±0.03＃＃0.34±0.05＃＃0.25±0.04＃＃0.40±0.04＃＃0.46±0.06＃＃壯宣飲高劑量組0.16±0.02＃＃0.31±0.04＃＃0.21±0.03＃＃0.42±0.05＃＃0.43±0.05＃＃壯宣飲中劑量組0.24±0.03＃＃0.41±0.05＃＃0.30±0.04＃＃0.31±0.04＃＃0.59±0.07＃壯宣飲低劑量組0.30±0.04＃＃0.50±0.06＃0.39±0.05＃＃0.24±0.03＃0.73±0.08＃

4 討論

流感病毒性肺炎屬中醫(yī)“疫病” 范疇，病變重心在肺，可累及脾胃。外邪侵肺，肺失宣肅，導(dǎo)致發(fā)熱、咳嗽等癥狀，濕熱郁阻中焦，脾胃運(yùn)化失司，氣機(jī)郁滯，可見嘔吐、腹瀉［13-14］。因此，驅(qū)邪同時(shí)應(yīng)兼以清熱化濕、扶正補(bǔ)虛。壯宣飲是在壯藥龍盤止咳方基礎(chǔ)上結(jié)合臨床經(jīng)驗(yàn)及參考多部醫(yī)書古籍研制而成。方中龍脷葉潤肺止咳； 盤龍參清熱毒、止咳化痰； 陳皮理氣健脾、燥濕化痰； 法半夏燥濕化痰、降逆止嘔，共為主藥通氣道，調(diào)谷道，使之藥直達(dá)咪缽（肺）； 魚腥草清熱解毒、排膿消癰； 不出林清熱毒、除濕毒； 炙麻黃宣肺平喘； 五味子斂肺滋腎、益氣生津，與麻黃合用可宣肺祛邪、補(bǔ)肺益陰； 白術(shù)補(bǔ)氣健脾； 炒麥芽行氣消食、健脾開胃，共為幫藥。柿子葉通龍路； 甘草調(diào)和諸藥，共為帶藥。諸藥合用奏扶正補(bǔ)虛、清熱宣肺、化痰止咳之功。臨床研究表明，壯宣飲對呼吸系統(tǒng)急性感染性肺部炎癥、咳嗽、咯痰等癥狀有顯著療效，可促進(jìn)肺部炎癥吸收。課題組前期研究表明，龍盤止咳方對甲型流感病毒感染肺炎小鼠有保護(hù)作用［10］。

過度炎癥浸潤、病毒誘導(dǎo)的組織破壞和繼發(fā)性細(xì)菌合并感染是與流感病毒感染相關(guān)的高發(fā)病率和死亡率的重要因素［15］。TNF-α、IFN-γ 和IL-6 是流感感染過程中重要促炎細(xì)胞因子，其上調(diào)可能導(dǎo)致患者氣道炎癥和肺組織破壞［16］。TNF-α 抑制劑依那西普可提高小鼠存活率并抑制炎性細(xì)胞因子過度產(chǎn)生，減少肺損傷［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，H1N1感染大鼠肺組織中炎癥因子水平升高，肺濕/干重比增加，出現(xiàn)嚴(yán)重肺水腫，且肺泡腔內(nèi)存在大量炎性細(xì)胞浸潤和滲出物，表明H1N1 感染引發(fā)大鼠肺部炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，壯宣飲可降低H1N1 感染大鼠肺組織中促炎細(xì)胞因子水平，減輕肺水腫和肺部炎癥反應(yīng)。

NF-κB 是應(yīng)對損傷和感染的免疫和炎癥過程的主要調(diào)節(jié)因子［18］。TLR3 是RNA 病毒的主要先天免疫模式識別受體，通過轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 觸發(fā)炎癥反應(yīng)［19］。據(jù)報(bào)道，TLR3識別并結(jié)合dsRNA，導(dǎo)致TLR3 表達(dá)增強(qiáng)，TLR3 通過募集TRIF 和TRAF6，促進(jìn)TAK1 活化，TAK1 磷酸化將與核因子κB 激酶β （IKKβ） 的抑制劑結(jié)合，導(dǎo)致IκBα 磷酸化降解，隨后NF-κB 核易位激活炎癥細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄［20］。本研究結(jié)果顯示，H1N1 感染后大鼠肺組織中TLR3 蛋白表達(dá)、IκBα和TAK1 的磷酸化水平均升高，同時(shí)NF-κB p65 活化增加，表明H1N1 感染后TLR3/TAK1/NF-κB 信號通路的活化增強(qiáng)。給予壯宣飲干預(yù)后，H1N1 感染大鼠肺組織中TLR3 蛋白表達(dá)、IκBα、TAK1 和NF-κB p65 的磷酸化均降低，表明壯宣飲對H1N1 誘導(dǎo)的肺炎大鼠促炎細(xì)胞因子釋放的抑制作用可能是由于壯宣飲對TLR3 過表達(dá)和TAK1 磷酸化的抑制。

綜上所述，壯宣飲可降低促炎細(xì)胞因子的釋放，減輕H1N1 流感病毒性肺炎大鼠的肺損傷，可能與抑制TLR3/TAK1/NF-κB 信號通路有關(guān)。