李夢媛, 婁偉, 夏長秀, 張油兵, 陳兆星, 嚴翔

(贛州市柑橘科學(xué)研究所, 江西 贛州 341000)

柑橘黑點病, 又稱柑橘砂皮病。據(jù)報道, 該病在湖南、湖北、江西、廣東、浙江、上海等省市各個柑橘產(chǎn)區(qū)的發(fā)生情況均日益嚴重, 已經(jīng)成為我國廣大柑橘產(chǎn)區(qū)最主要的真菌性病害之一, 嚴重影響柑橘的外觀品質(zhì)[1]。有調(diào)查顯示, 在我國, 一般柑橘園中黑點病的病果率為6.5%～12.8%, 在發(fā)病嚴重的柑橘園內(nèi)病果率可達51.3%～77.9%[2],嚴重的柑橘黑點病往往能使柑橘的價格下跌70%左右。因此, 篩選出有效的化學(xué)防治藥劑, 引進低毒高效綠色農(nóng)藥, 對促進贛南臍橙產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。目前, 化學(xué)防治仍是黑點病防治最經(jīng)濟有效的手段, 我國柑橘產(chǎn)區(qū)主要以代森錳鋅和銅制劑類的氫氧化銅防治柑橘黑點病, 貯藏期以咪鮮胺為主防治青綠霉和褐色蒂腐, 但這些藥劑的頻繁使用易導(dǎo)致防效降低, 這可能與病原菌產(chǎn)生抗性有關(guān)[3-4]。

本研究選用了9 種殺菌劑, 采用菌絲生長速率法對柑橘黑點病菌株進行室內(nèi)毒力測定, 從中篩選出對柑橘黑點病防治效果較好的藥劑,以期為今后柑橘黑點病的田間試驗和科學(xué)防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

2020 年8 月, 從江西省贛州市柑橘科學(xué)研究所基地果園內(nèi)隨機選取黑點病發(fā)病較重的果實和葉片, 用清水沖洗干凈并晾干, 剪取病健交界處的組織, 將其剪成4～5 mm 的方塊, 在超凈工作臺內(nèi)將剪好的樣品先用75%的乙醇漂洗3～4 min, 后轉(zhuǎn)移到1%次氯酸鈉溶液中漂洗1 min 進行消毒, 消毒完成后用無菌水沖洗3～4 次后晾干。將晾干后的樣品放置到事先配好的裝有PDA 培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中, 維持在26 ℃條件下, 12 h/12 h 光暗交替持續(xù)培養(yǎng)5 d 左右, 將菌落特征為黑點病菌的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至新鮮PDA 培養(yǎng)基, 26 ℃, 12 h/12 h 光暗交替繼續(xù)培養(yǎng)約30 d, 待分生孢子器和分生孢子形成后, 對分生孢子的形態(tài)特征進行觀察[5], 能夠初步鑒定是否分離得到柑橘砂皮病菌。

用無菌挑針將菌株的分生孢子挑出加入無菌水中, 配成孢子懸浮液, 而后用70%乙醇對健康的柑橘果實進行表面消毒, 再用無菌水沖洗3 次, 在果實表面用針刺小孔, 將孢子懸浮液滴在小孔上,以滅菌水作對照。幾天后觀察是否發(fā)病。確認是柑橘黑點病菌后, 進行單孢純化: 取50 μL 孢子懸浮液用無菌涂棒均勻涂布于WA 培養(yǎng)基 (水瓊脂培養(yǎng)基: 瓊脂20 g, 水1 L), 26 ℃培養(yǎng)2 d 后, 在光線充足的超凈工作臺中, 用無菌鑷子小心地挑一小部分單孢菌絲移至新鮮PDA 培養(yǎng)基中于26 ℃培養(yǎng), 得到單孢菌株。將純化得到的單孢菌株保存于4 ℃冰箱中備用。

1.1.2 培養(yǎng)基的配制

PDA 培養(yǎng)基: 將洗凈去皮的200 g 馬鈴薯切塊, 加水1 000 mL, 煮沸0.5 h, 用紗布濾去馬鈴薯, 然后加瓊脂20 g 和葡萄糖15 g, 加熱使瓊脂完全融化, 加水補足至1 000 mL, 最后分裝在三角瓶中, 加棉塞后滅菌。

含藥培養(yǎng)基: 在無菌操作臺內(nèi)將表1 中不同藥劑分別用無菌水配制成所需濃度的10 倍, 然后以1 ∶9 的比例與PDA 培養(yǎng)基混合均勻后, 倒入培養(yǎng)皿中, 即得相應(yīng)濃度梯度的含藥培養(yǎng)基。

表1 供試藥劑及其稀釋倍數(shù)

1.1.3 供試藥劑

本試驗所用的藥劑種類、生產(chǎn)廠家及稀釋倍數(shù)見表1。

1.2 試驗方法

采用菌絲生長速率法測定殺菌劑對柑橘黑點病菌的毒力。將待測菌株在無菌條件下接種到含有PDA 培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中, 于26 ℃培養(yǎng)7 d 左右,后取直徑4 mm 左右菌餅 (取菌落邊緣生長旺盛的菌絲) 轉(zhuǎn)接到含有不同藥劑的PDA 平板上 (帶菌絲的一面接觸培養(yǎng)基)。以不加藥劑而加入無菌水的培養(yǎng)基作為對照, 每種藥劑設(shè)計5 個濃度處理,每個處理3 次重復(fù), 將接種完成的培養(yǎng)基置于26 ℃恒溫下培養(yǎng)5 d。用十字交叉法測量菌落直徑, 計算菌絲生長抑制率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

將菌絲生長抑制率換算成概率值, 藥劑有效成分濃度轉(zhuǎn)換成濃度對數(shù), 用SPSS 軟件作統(tǒng)計分析, Excel 統(tǒng)計輔助分析數(shù)據(jù), 鄧肯氏新復(fù)極差法檢驗差異顯著性, 以藥劑質(zhì)量濃度對數(shù)值 (x) 為橫坐標, 抑制率的概率值 (y) 為縱坐標, 求出毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù) (r) 和有效抑制中濃度(EC50), EC50值即表示殺菌劑對柑橘黑點病菌的抑制作用。

2 結(jié)果與分析

由表2、表3 可以看出, 在設(shè)定的稀釋倍數(shù)范圍內(nèi), 9 種殺菌劑對柑橘黑點病菌菌絲生長均有不同程度的抑制作用, 但各殺菌劑之間存在比較明顯的差異。根據(jù)EC50值的大小, 9 種殺菌劑的抑菌作用由強到弱依次為: 80%代森錳鋅可濕性粉劑、10%氟硅唑水乳劑、10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑、25%吡唑醚菌酯懸浮劑、60%唑醚·代森聯(lián)水分散粒劑、75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑、70%甲基硫菌靈可濕性粉劑、60%錳鋅·腈菌唑可濕性粉劑、30%苯甲·吡唑酯懸浮劑。80%代森錳鋅可濕性粉劑對柑橘黑點病菌菌絲生長抑制作用較強, EC50值為0.406 0 mg·L-1。10%氟硅唑水乳劑、10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑、25%吡唑醚菌酯懸浮劑的EC50值 分 別 為15.279 0、16.330 3 和19.987 4 mg·L-1; 其余幾種殺菌劑的抑菌作用一般或較差,其中, 60%唑醚·代森聯(lián)水分散粒劑、75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑和70%甲基硫菌靈可濕性粉劑的EC50值分別為53.384 9、60.429 8 和85.173 3 mg·L-1, 60%錳鋅·腈菌唑可濕性粉劑和30%苯甲·吡唑酯懸浮劑的抑菌效果最差, EC50值分別為105.252 1 和133.143 7 mg·L-1。

表2 供試9 種殺菌劑對柑橘黑點病菌菌絲生長的抑制作用

表3 供試9 種殺菌劑對柑橘黑點病菌的毒力測定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本研究采用菌絲生長速率法對柑橘黑點病菌株進行了室內(nèi)毒力測定, 試驗結(jié)果表明, 不同藥劑或同一藥劑不同濃度對病菌菌絲生長均有一定的拮抗作用。其中80%代森錳鋅可濕性粉劑、10%氟硅唑水乳劑、10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑、25%吡唑醚菌酯懸浮劑對黑點病病菌的毒力作用均優(yōu)于其他藥劑, 具有很好抑制作用。60%唑醚·代森聯(lián)水分散粒劑、75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑和70%甲基硫菌靈可濕性粉劑的毒力作用較低, 抑菌率也一般,60%錳鋅·腈菌唑可濕性粉劑和30%苯甲·吡唑酯懸浮劑的毒力作用均較低, 抑菌效果較差。

柑橘黑點病的病原菌為柑橘間座殼菌(Diaporthecitri), 為害柑橘果實、葉片和新梢會引起黑點病, 為害樹干引起樹脂病, 為害果蒂引起貯藏期的褐色蒂腐病[6]。柑橘黑點病菌是一種弱寄生真菌, 主要在枯枝上完成生活史?？萆疑袭a(chǎn)生的分生孢子通過風(fēng)雨傳播, 在枝梢、葉片和果實表面停留4 h 以上即可從表面直接侵入[7], 病菌入侵后, 通過寄主的防衛(wèi)反應(yīng), 被感染的組織會形成凸起的黑色硬粒[8], 也就是黑點。因此, 噴施保護性強的殺菌劑, 抑制落在果實表面的病菌孢子萌發(fā)侵入, 成為防治柑橘黑點病的必要措施之一[9-10]。代森錳鋅、氟硅唑、吡唑醚菌酯在中國均有登記用于柑橘黑點病的防治, 本試驗結(jié)果也表明, 這3 種殺菌劑均對柑橘黑點病有一定的抑制作用。其中,代森錳鋅的抑菌效果最好, 這與黃振東等[10]田間試驗的試驗結(jié)果一致, 認為代森錳鋅仍是防治黑點病的最佳藥劑。

本研究表明, 代森錳鋅仍可作為柑橘黑點病防治的主要藥劑, 而氟硅唑、苯醚甲環(huán)唑和吡唑醚菌酯可以作為柑橘黑點病防治的備選藥劑, 同時, 該試驗僅為室內(nèi)測定結(jié)果, 只能說明, 殺菌劑對離體條件的黑點病病菌菌絲有一定的抑菌作用, 不能顯示不同藥劑對病菌孢子發(fā)芽的致死和抑制效果[11],也不能反映藥劑的滲透能力, 其田間防效是否與室內(nèi)毒力測定的結(jié)果一致, 田間使用劑量、持效期、農(nóng)藥殘留等還需進一步研究。