丁 強(qiáng)，向繼武，周 明，程 波，譚小芳 ，閆 雪，沈 潔

1. 宜昌三峽制藥有限公司，湖北 宜昌 443000；

2. 武漢工程大學(xué)環(huán)境生態(tài)與生物工程學(xué)院，湖北 武漢 430205；

3. 宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司，湖北 宜昌 443000 ；

4. 中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院，安徽 合肥 230000

安普霉素是美國Eli Lilly 公司首次發(fā)現(xiàn)的，由黑暗鏈霉菌合成的一種氨基環(huán)醇類抗生素中尼拉霉素復(fù)合物的一個(gè)組分［1］，又名阿普拉霉素，其分子式為C21H41N5O11，由3 部分組成，分別為4-氨基-4-脫氧-α-吡喃型葡萄糖，辛二糖胺，2-脫氧鏈霉胺，其結(jié)構(gòu)如圖1 所示。安普霉素具有廣譜抗菌性，在獸藥范圍和畜禽類養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)領(lǐng)域被普遍使用于畜禽類的腸道感染治療，特別是對幼禽因?yàn)榇竽c桿菌、沙氏門菌等導(dǎo)致的腹瀉，腸道炎癥的治療和預(yù)防上，效果非常顯著［2］；在畜禽養(yǎng)殖上，適量的安普霉素用于飼料添加劑，可以使畜禽體重獲得明顯增加，達(dá)到提前出欄的效果［3］，研究還表明，安普霉素作為飼料添加劑的成分能有效提高水產(chǎn)養(yǎng)殖中魚、蝦增的重率和蛋白質(zhì)效率［4］，市場前景巨大。

圖1 安普霉素分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Molecular structure of apramycin

為了獲得適應(yīng)大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵的安普霉素優(yōu)良生產(chǎn)菌株，目前對安普霉素生產(chǎn)菌株的研究主要集中以下3 個(gè)方面：其一是采用傳統(tǒng)誘變方法如紫外、化學(xué)法等提高其產(chǎn)品效價(jià)［5］；其次對安普霉素的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化以獲得更高的生產(chǎn)效率［6-10］；另外對安普霉素合成途徑進(jìn)行了解析［11］，為安普霉素產(chǎn)品的開發(fā)和菌種選育提供了參考，例如李相豐等［12］推斷出了安普霉素可能的合成途徑，即葡萄糖起始合成巴龍霉胺后經(jīng)環(huán)合生成安普霉胺，進(jìn)一步與4-氨基-4-脫氧葡萄糖連接，最終生成了安普霉素，王普宏［13］通過阻斷tacA 基因獲得安普霉素單組份突變株。目前，不論是傳統(tǒng)誘變方法還是基因工程改造技術(shù)都在提高安普霉素效價(jià)方面取得了相當(dāng)?shù)某尚РV泛用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)?？梢?，通過誘變育種將安普霉素工業(yè)生產(chǎn)菌株的產(chǎn)品效價(jià)提高是行之有效的［14］。

常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）技術(shù)因其溫和安全、突變率高等特點(diǎn)，在菌種誘變上得到了廣泛的應(yīng)用［15］。而中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院通過結(jié)合近年來發(fā)展起來的大氣壓低溫等離子體誘變育種技術(shù)，集電子、離子、激發(fā)態(tài)中性分子、自由基、電場、紫外輻射等諸多生物誘變因素，提出氣液相等離子體，以空氣作為放電氣體，通過電極間形成的等離子體通道注入到水溶液中的改進(jìn)常壓室溫等離子體誘變系統(tǒng)［16］。由于采用空氣（主要成分為N2、O2）激發(fā)產(chǎn)生等離子，并且等離子體直接與水溶液接觸，可以產(chǎn)生豐富的高濃度活性氧（如OH、氧原子、O2-、H2O2等）和活性氮基團(tuán)（如激發(fā)態(tài)氮分子、NO 等），高含量活性氧、活性氮及磁場雙重作用下，將大大提高菌株突變率和突變庫容量，結(jié)合通量篩選技術(shù)，磁場協(xié)同氣液等離子體技術(shù)有望成為高效誘變育種的新方法［17］。改進(jìn)后的氣液相等離子體誘變技術(shù)具有操作方便，經(jīng)濟(jì)成本低；對菌株遺傳物質(zhì)損傷多樣性，可以提高獲得突變菌株的概率；誘變安全，對人體無害，對環(huán)境無污染等諸多優(yōu)點(diǎn)。因此本試驗(yàn)將中國科學(xué)院等離子體物理研究所的氣液等離子體技術(shù)應(yīng)用于安普霉素生產(chǎn)菌株的誘變育種，建立并優(yōu)化誘變工藝，期望為獲得穩(wěn)定高產(chǎn)的安普霉素工業(yè)菌株提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 菌 種

誘變出發(fā)菌株：黑暗鏈霉菌（Streptomyces tenebrarius）A-0，為本公司保藏菌種。

生物效價(jià)檢測用菌種：枯草芽孢桿菌（bacillus subtitles）。

1.2 培養(yǎng)基

平板選擇培養(yǎng)基各組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）：葡萄糖1.0 ，蛋白胨0.5 ，牛肉膏0.1，酵母膏0.1 ，NaCl 0.2 ，MgSO4.7H2O 0.025，瓊脂粉1.5，溶于pH 7.2的蒸餾水。

斜面培養(yǎng)基各組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）：可溶性淀粉2.0，NaCl 0.05，KNO30.1 ，K2HPO4.3H2O 0.05，MgSO4.7H2O 0.05 ，F(xiàn)eSO4.7H2O 0.001，瓊脂2.0，溶于pH 7.4~7.6 的自來水。

種子瓶培養(yǎng)基各組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）：葡萄糖3.0，玉米淀粉2.0 ，黃豆粉2.5 ，酵母粉0.1，碳酸鈣0.2，，硫酸鎂0.1，玉米漿1.5，硫酸銨0.1。

發(fā)酵瓶培養(yǎng)基各組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）：葡萄糖4.0，玉米淀粉2.0，黃豆餅粉4.0，酵母粉0.5，蛋白胨1.0，玉米漿0.5，硫酸銨0.5，硫酸鎂0.4，磷酸二氫鉀0.1，淀粉酶0.2，碳酸鈣0.5，豆油0.5。

1.3 試 劑

國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司：NaCl，MgSO4·7H2O，KNO3，K2PO4·3H2O，F(xiàn)eSO4·7H2O，硫酸銨，碳酸鈣，磷酸二氫鉀，氯化銨，瓊脂粉。

北京奧博星生物技術(shù)有限公司：葡萄糖，牛肉膏，可溶性淀粉，玉米粉，玉米漿，蛋白胨，黃豆餅粉，豆油，淀粉酶。

安琪酵母有限公司：酵母粉，酵母膏。

阿拉丁化學(xué)試劑網(wǎng)：安普霉素標(biāo)準(zhǔn)品（K0231610 1mg 含517 單位安普霉素）。

北京中海生物科技有限公司：抗生素檢定培養(yǎng)基1 號。

美國Fisher公司：甲醇（色譜純）。

1.4 儀器及設(shè)備

本實(shí)驗(yàn)使用的儀器設(shè)備見表1。

表1 儀器及設(shè)備型號Tab.1 Models of instruments and equipment

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

以Streptomyces tenebrarius菌株A-0 為出發(fā)菌株，采用改進(jìn)后的氣液相等離子體誘變技術(shù)進(jìn)行誘變育種，實(shí)驗(yàn)路線見圖2。

圖2 安普霉素菌種氣液相等離子體誘變實(shí)驗(yàn)路線Fig.2 Experimental route of gas-liqiud phase plasma mutagenesis of apramycin strains

1.5.1 安普霉素斜面培養(yǎng) 制備安普霉素茄子瓶斜面，30 ℃空培5~7 d，目測無雜菌后接種0.1 mL孢子液，37 ℃培養(yǎng)7 d，待斜面孢子轉(zhuǎn)白后收入冰箱保藏備用。

1.5.2 菌懸液制備 取滅菌后的純化水20 mL 將斜面孢子洗下打散并用紗布過濾，調(diào)整孢子量為1.0~1.2×108CFU/mL，備用。

1.5.3 氣液相等離子體誘變處理菌懸液 以孢子數(shù)為1.0~1.2×108CFU/mL 的菌懸液，進(jìn)行氣液相等離子體誘變，基本參數(shù)如下：無菌空氣流量2.5 L/h，放電功率10 W，溫度25~30 ℃，壓力為標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，調(diào)節(jié)離子噴射探頭至液面下，距杯底1.0~1.5 cm處，分別處理30、45、60、75、90、105、120 s。處理過程中，在到達(dá)預(yù)設(shè)處理時(shí)間時(shí)，通過特定取樣管道進(jìn)行取樣，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.85%生理鹽水稀釋不同梯度涂布平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d，進(jìn)行平板活菌計(jì)數(shù)（colony-forming units，CFU），計(jì)數(shù)誘變致死率，制作致死率曲線。

1.5.4 誘變菌懸液涂布分離 將誘變后的菌懸液用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.85%生理鹽水按10 的倍數(shù)進(jìn)行梯度稀釋，選擇10-3、10-4、10-5共3 個(gè)梯度進(jìn)行平板涂布，取樣量為100 μL/皿，每批涂布3 個(gè)平板，設(shè)置空白對照，37 ℃培養(yǎng)5~7 d。

1.5.5 安普霉素菌落初篩 不同單孢子接種的培養(yǎng)平板長滿后，分別用滅菌打孔器將（約2~3 cm2）菌片接種到24 孔板中，每孔裝5 mL 的發(fā)酵培養(yǎng)基，37 ℃，220 r/min，培養(yǎng)120 h。3 000 r/min，5 min 離心發(fā)酵液，取上清液用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）進(jìn)行含量測定，選擇安普霉素含量高的菌株。

1.5.6 安普霉素?fù)u瓶復(fù)篩 選擇安普霉素初篩后效價(jià)較出發(fā)菌株有明顯提高的突變菌株進(jìn)行搖瓶復(fù)篩。500 mL 搖瓶中裝50 mL 培養(yǎng)基，37 ℃，220 r/min，培養(yǎng)120 h，每個(gè)菌號做3 組平行實(shí)驗(yàn)，采用HPLC 測定安普霉素含量，同時(shí)通過枯草芽孢桿菌使用牛津杯法測定安普霉素突變菌株的生物效價(jià)。

1.5.7 突變菌株遺傳穩(wěn)定性考察 復(fù)篩得到的突變菌株連續(xù)傳代至第五代，37 ℃，220 r/min，120 h搖瓶考察突變菌株傳代的效價(jià)，選擇第一代和第五代之間效價(jià)差距低于5%的菌種，為選育成功，遺傳穩(wěn)定性較好，可以用于生產(chǎn)的菌株。

1.5.8 安普霉素檢測及計(jì)算方法［14］

（1）致死率計(jì)算

誘變后的菌懸液和未經(jīng)誘變的對照菌懸液分別進(jìn)行10 的倍數(shù)梯度稀釋，取10-4、10-5、10-6分別涂布3 個(gè)平板，37 ℃，7 d 后進(jìn)行活菌計(jì)算，根據(jù)平板上的菌落數(shù)量計(jì)算致死率。

其中：Q為誘變前對照品菌懸液的菌落數(shù)/（CFU/mL）；H為ARTP 誘變處理后菌懸液的活菌數(shù)/（CFU/mL）。

（2）突變率計(jì)算

以安普霉素出發(fā)菌A0的效價(jià)作為對照組，將效價(jià)提高20%及以上和效價(jià)降低20%及以下的菌株歸為突變菌株，其中效價(jià)提高20%及以上的稱為正突變菌株，根據(jù)下面公式計(jì)算突變率和正突變率。

（3）菌濃測定

體積法：用移液管取混合均勻的發(fā)酵液10 mL至離心管中，3 000 r/min 離心10 min，然后將上清液倒入計(jì)量管中，讀取上清液體積，計(jì)算菌渣體積，即菌濃。

（4）安普霉素生物效價(jià)測定

生物效價(jià)測定方法：培養(yǎng)基為抗生素檢定培養(yǎng)基1 號；檢測菌：枯草芽孢桿菌；樣品濃度：高濃度標(biāo)準(zhǔn)品、高濃度樣品、低濃度標(biāo)準(zhǔn)品、低濃度樣品；培養(yǎng)溫度：35~37 ℃；培養(yǎng)時(shí)間：16~18 h；R值選取范圍：0.9~1.1（若低于或高與則需要重新估供試品效價(jià)）。

（5）安普霉素高效液相色譜法測定含量

HPLC檢測：色譜柱為Apollo C18 5 μm×250 mm×4.6 mm；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：用20 mL/L 三氟乙酸和1 mL/L七氟丁酸混合后加超純水定容至1 000 mL；進(jìn)樣量：20 μL；流速：0.8 mL/min；蒸發(fā)光溫度：110 ℃；氣體流量：3.0 L/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 初始菌種A-0 的安普霉素生物含量

配制0.2 mg/mL 的安普霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液為100%，稀釋成5 個(gè)不同濃度的水平標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣檢測，以測得的響應(yīng)信號對應(yīng)被測物濃度作圖，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程lgA=1.213 2lgC+2.451（R2=0.999 9），其中l(wèi)gA為峰面積，lgC為樣品濃度，R值在0.99 范圍內(nèi)，可見安普霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液線性良好。將安普霉素?fù)u瓶發(fā)酵液離心后，取上清液，用0.22 μm 微孔濾膜過濾后進(jìn)樣檢測，獲得安普霉素的HPLC 圖譜，如圖3 所示，安普霉素的出峰時(shí)間在13.5 min 左右，將峰面積帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，經(jīng)過計(jì)算得出安普霉素初始菌株A-0 的安普霉素120 h 發(fā)酵的生物含量為0.282 mg/mL。

圖3 產(chǎn)安普霉素原始菌株A-0 發(fā)酵120 h 的HPLC 圖譜Fig.3 HPLC diagram of apramycin fermentation broth produced by original strain A-0 after 120 h fermentation

2.2 致死率曲線

通過平板涂布計(jì)算氣液相等離子誘變每間隔20 s 誘變下菌株的存活個(gè)數(shù)，確定誘變的致死率，得到最佳的誘變時(shí)間。以0 min 誘變時(shí)間菌落的死亡率為0 制作致死率曲線，如圖4 所示。

圖4 氣液相等離子誘變黑暗鏈霉菌致死率曲線Fig.4 Streptomyces tenebrarius lethality rate curve of gas-liquid phase plasma mutagenesis

由圖4 可知，隨著氣液相等離子體誘變時(shí)間的延長，安普霉素菌種的存活率在不斷降低，在處理90 s后黑暗鏈霉菌的的致死率接近90%，處理120 s后基本不再變化，維持在100%的死亡率，。根據(jù)現(xiàn)代科學(xué)的誘變統(tǒng)計(jì)，致死率在75%左右是最佳的誘變點(diǎn)，因此，選擇誘變時(shí)間75 s 作為后續(xù)誘變菌株的最佳節(jié)點(diǎn)，在該時(shí)間內(nèi)，黑暗鏈霉菌的致死率為78.6%，突變率經(jīng)過計(jì)算為43.5%，其中正突變率為22.6%。

2.3 突變菌株篩選結(jié)果

2.3.1 氣液相等離子體誘變誘變菌株初篩 選擇75 s 處理時(shí)間用氣液相等離子體誘變處理黑暗鏈霉菌，梯度稀釋誘變后的菌懸液，涂布平板選擇培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)7~12 d 后進(jìn)行挑單菌落。根據(jù)菌落的形態(tài)、大小、生長情況，選擇較飽滿、生長旺盛、單個(gè)或形態(tài)與原種相比發(fā)生很大變化的菌落進(jìn)行挑選傳代，然后將余下的菌苔整個(gè)挑下放入24 孔板發(fā)酵5 d 考察效價(jià)。通過HPLC 法檢測安普霉素發(fā)酵含量，與原種A-0 含量相比較，50 個(gè)篩選菌種里面，共獲得5 個(gè)較出發(fā)菌株安普霉素產(chǎn)量增幅大于5%~30%的突變菌種，如圖5 所示，挑選菌號分別為8，12，25，35，47，對突變菌種重新編號，分別對應(yīng)A-01，A-02，A-03，A-04，A-05。

圖5 氣液相等離子體誘變誘變后突變菌株安普霉素產(chǎn)量的初篩結(jié)果Fig.5 Preliminary screening results of apramycin yields after gas-liquid phase plasma mutagenesis

2.3.2 突變菌株復(fù)篩 通過初篩得到5 株突變的高效價(jià)菌株，將得到的菌株進(jìn)行3 輪搖瓶復(fù)篩，管碟法測定生物效價(jià)，與對照A-0 相比較，篩選出來的5 個(gè)突變菌株中A-4 的效價(jià)最為穩(wěn)定，基本3 輪復(fù)篩都維持在（3 300±100）U/mL 的范圍內(nèi)，其他4個(gè)突變菌株在復(fù)篩中效價(jià)相對穩(wěn)定，但效價(jià)水平均低于A-4 突變菌株，如下圖6 所示，故選擇A-4進(jìn)行連續(xù)傳代考察穩(wěn)定性。

圖6 安普霉素突變菌株三輪復(fù)篩數(shù)據(jù)Fig.6 Data of rescreening of apramycin mutant strains for three times

2.3.3 安普霉素A-4 傳代遺傳穩(wěn)定性考察 安普霉素突變菌株A-4 在初篩和復(fù)篩中菌表現(xiàn)優(yōu)良，對A-4 突變菌進(jìn)行連續(xù)五次傳代，以A-4 一代菌為對照組，搖瓶考察傳代后的穩(wěn)定性，如圖7 所示，A-4在連續(xù)傳代的過程中，一代效價(jià)3 330 U/mL，到第五代是效價(jià)3 274 U/mL，降低幅度在5%以內(nèi)，符合生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)，高效液相色譜測定含量一代最高達(dá)到0.375 mg/mL，傳代到第5 代，含量維持在0.358 mg/mL，可以進(jìn)行菌種保藏和生產(chǎn)應(yīng)用。

圖7 突變菌株A-4 連續(xù)傳代遺傳穩(wěn)定性考察Fig.7 Genetic stability test of mutant strain A-4 through continuous subculturing

2.3.4 安普霉素突變菌株A-4 搖瓶發(fā)酵過程監(jiān)控 以安普霉素出發(fā)菌株A-0 作為對照組，氣液相等離子體誘變突變菌株A-4 為試驗(yàn)組，進(jìn)行安普霉素突變菌的搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵過程中菌絲體積變化（菌濃）和安普霉素產(chǎn)物積累如圖8 所示。

圖8 A-0 對照菌與突變菌A-4 發(fā)酵過程菌濃變化和發(fā)酵過程產(chǎn)物積累情況：（a）菌濃變化情況，（b）發(fā)酵過程產(chǎn)物積累情況Fig.8 （a）Variation trends of strain concentration during fermentation process，（b）comparison of product accumulation during fermentation process of comparison strain A-0 and mutant strain A-4

從圖8 可以看出突變菌株的菌絲生長更快，在48 h 達(dá)到生長的最高峰，未誘變的出發(fā)菌株A-0 的菌絲開始溶解，菌濃在72 h 后不斷下降，而突變菌A-4 則在84 h 菌濃才開始下降，突變菌菌絲溶解速度較原始菌緩慢，可見突變菌的穩(wěn)定期要比原始菌株長，推測突變菌株A-4 生長和合成安普霉素的時(shí)間較長，從而在相同發(fā)酵時(shí)間內(nèi)積累更多產(chǎn)物，從而發(fā)酵水平有所提高。如圖8 所示，84 h 以后原始菌株A-0 安普霉素的積累變得緩慢，到發(fā)酵結(jié)束36 h 內(nèi)增長的效價(jià)不多，在500 U/mL 左右，但突變菌株A-4 在84 h 后產(chǎn)物仍維持較快的增長速度，到120 h 時(shí)，突變菌株的生物效價(jià)為3 420 U/mL，較84 h 效價(jià)增長了900 U/mL 左右，突變菌株較原始菌株A-0 發(fā)酵終點(diǎn)的生物效價(jià)2 580 U/mL，提高了32.6%。

3 結(jié) 論

本研究通過氣液相等離子體技術(shù)誘變安普霉素產(chǎn)生菌黑暗鏈霉菌A0，獲得了一株效價(jià)提高并具有穩(wěn)定遺傳性的安普霉素高產(chǎn)突變菌株A-4。結(jié)果表明氣液相等離子體誘變技術(shù)對黑暗鏈霉菌在一定的致死率下有較強(qiáng)的誘變效果，處理75 s后致死率達(dá)到78.6%，正突變率達(dá)到最佳效果28.9%，篩選得到的突變菌株A-4 生物效價(jià)達(dá)到3 420 U/mL，搖瓶發(fā)酵安普霉素含量0.375 mg/mL，較出發(fā)原始菌株A-0 效價(jià)提高了32.6%。氣液相等離子體誘變得到的突變菌株在經(jīng)過連續(xù)傳代后，仍維持在5%范圍內(nèi)的效價(jià)波動(dòng)，穩(wěn)定性高。可見誘變用的活性離子導(dǎo)致細(xì)胞DNA 損傷和破壞，在其自我修復(fù)的過程中形成了不完全修復(fù)的突變，獲得穩(wěn)定遺傳的突變菌株。