黃曉園 鄭凱文 張俊杰 徐鴻緒 王菊芳★

傳染病是指由各種病原體引起的疾病，如細(xì)菌、病毒、真菌或寄生蟲，能在人與人、動(dòng)物與動(dòng)物、人與動(dòng)物之間進(jìn)行相關(guān)傳播，對(duì)人類健康危害極大［1］。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）公布的數(shù)據(jù)，2019 年因傳染病死亡人數(shù)是全球死亡總?cè)藬?shù)的24.2%［2］。因此病原體的快速診斷在傳染病的防控與治療中至關(guān)重要。在臨床診斷中，傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)鑒定至少需要24～72 小時(shí)，時(shí)間長(zhǎng)且準(zhǔn)確率較低，導(dǎo)致無(wú)法對(duì)患者進(jìn)行快速有效的精準(zhǔn)治療，以至于臨床上需依靠經(jīng)驗(yàn)性用藥和抗生素廣泛用藥，導(dǎo)致病原菌耐藥性情況越來(lái)越嚴(yán)重［3］。因此，開發(fā)和應(yīng)用快速、精準(zhǔn)、高通量病原菌檢測(cè)技術(shù)方法在臨床診斷中尤為重要。

如今，二代測(cè)序（Next Generation Sequencing，NGS）技術(shù)在病原菌檢測(cè)中發(fā)揮舉足輕重的作用，能更直接、客觀、高通量地鑒別感染病原菌。因此，本研究開發(fā)了一種基于多重PCR 靶向二代測(cè)序的高通量檢測(cè)方法，對(duì)22 株臨床中常見的病原菌（包括19 種細(xì)菌和3 種真菌）進(jìn)行精準(zhǔn)、快速診斷，并將該技術(shù)用于多種臨床樣本多種病原菌高通量檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

根據(jù)CHINET 中國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)（2017 年）的結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析［4］，篩選出臨床樣本中常見的22 種病原菌。菌株名稱、常見臨床感染類型和引物終濃度見表1。所有菌株均購(gòu)置于廣東省微生物研究所。

表1 病原菌標(biāo)準(zhǔn)菌株相關(guān)信息Table 1 Pathogenic microorganism and relevant information used in this study

1.1.2 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

收集2018 年12 月至2019 年2 月中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸道感染患者的肺泡灌洗液（62 例）和痰液（11 例），收集2018 年10 月至11 月廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院呼吸科的血液樣本（11 例）。見表2。臨床診斷結(jié)果來(lái)源于醫(yī)院的VITEK 2 或Vitek MS 全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)。

表2 臨床樣本類型Table 2 Types of specimens included in the study

1.1.3 主要儀器與試劑

采用PCR 基因擴(kuò)增儀（美國(guó)Bio-Rad，C1000TM）、DNA 電泳儀（美國(guó)Bio-Rad，164-5050）、熒光定量PCR 儀（瑞士Roche，Lightcycler96）、全自動(dòng)研磨儀（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司，JXFSTPRP-15）、核酸自動(dòng)化提取儀（西安天隆科技有限公司，NP968）、熒光定量?jī)x（美國(guó)ThermoFisher Scientific，Qubit 4）、DNA 片段分選純化試劑盒（無(wú)錫百邁格生物科技有限公司，BMSX-5）。引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成，建庫(kù)產(chǎn)物均送至廣州艾基生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序后根據(jù)barcode 引物序列分離出所有樣本的數(shù)據(jù)。

1.2 方法

1.2.1 特異性PCR 引物設(shè)計(jì)與驗(yàn)證

基于NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中目標(biāo)病原菌基因序列，使用生物信息學(xué)方法篩選出無(wú)堿基突變及序列間隔保守區(qū)域［5］，并且將PCR 產(chǎn)物的長(zhǎng)度控制在90 bp～110 bp 之間［6］。引物驗(yàn)證按照常規(guī)PCR 反應(yīng)程序進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)束后取7 μL PCR 產(chǎn)物，進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并觀察結(jié)果。針對(duì)每種病原菌均設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物，經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)分析和PCR 驗(yàn)證后采用。

1.2.2 多重PCR 引物擴(kuò)增效率

將上述44 種PCR 產(chǎn)物洗脫后并混合，所有擴(kuò)增片段的終濃度均為105copies/μL。并將所有引物以終濃度為20 pM 的比例混合，取1 μL 混合擴(kuò)增片段進(jìn)行多重PCR 擴(kuò)增和二代測(cè)序，根據(jù)分析后的數(shù)據(jù)進(jìn)行引物濃度調(diào)整。采用均一值去評(píng)估多對(duì)引物在PCR 反應(yīng)過(guò)程中的擴(kuò)增效率，計(jì)算方式如下：擴(kuò)增均一值（uniformity value）=靶向引物的reads/測(cè)序總reads 的平均值。

1.2.3 多重PCR 建庫(kù)和二代測(cè)序

將44 對(duì)引物按照表1 的引物終濃度混合組成Primer mix，-20℃儲(chǔ)蓄備用。mPCR 反應(yīng)體系（40 μL）：mPCR Taq 酶（2×）20 μL，Primer mix 4 μL，病原菌基因組12 μL，ddH2O 16 μL。第一輪多重PCR 擴(kuò)增：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性20 sec；60℃退火4 min；共進(jìn)行25 cycles，循環(huán)結(jié)束后72℃延伸4 min；16℃結(jié)束反應(yīng)。第二輪添加barcode 引物的PCR 體系（30 μL）：第一輪PCR 產(chǎn)物為模板，mPCR Taq 酶（2×）15 μL，barcode 引物F 1 μL，barcode 引物R 1 μL，ddH2O 13 μL。接下來(lái)建庫(kù)PCR 反應(yīng)：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性15 sec；58℃退火15 sec；72℃延伸1 min；共進(jìn)行7 cycles，循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10 min；10℃結(jié)束反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行洗脫，并送樣進(jìn)行二代測(cè)序。

1.2.4 模擬病原菌驗(yàn)證

將鮑曼不動(dòng)桿菌、白色念珠菌、肺炎鏈球菌、大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌的PCR 產(chǎn)物純化后混合，模擬多重感染臨床樣本，并且稀釋成105、104、103、102、101、100copies/μL，分別取3 μL 作為模板，進(jìn)行多重PCR 擴(kuò)增并送樣進(jìn)行二代測(cè)序。

1.2.5 臨床樣本檢測(cè)

將血液樣本靜置30 min，1 600×g離心10 min，離心半徑為10 cm，取400 μL 血清層以及全部的白細(xì)胞層轉(zhuǎn)移離心管中，對(duì)樣本進(jìn)行自動(dòng)化物理破壁，并對(duì)基因片段進(jìn)行提?。惶狄汉头闻莨嘞匆菏褂靡让?7℃水浴30 min 處理后再提取核酸。將提取的核酸作為模板，進(jìn)行多重PCR 擴(kuò)增并送樣進(jìn)行二代測(cè)序。

1.2.6 qPCR 驗(yàn)證

qPCR 反應(yīng)擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性30 sec；95℃變性5 sec；60℃退火30 sec；共進(jìn)行40 cycles，最后65℃～95℃制備溶解曲線。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；計(jì)量資料以n（%）表示，采用配對(duì)χ2檢驗(yàn)；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR 引物驗(yàn)證

通過(guò)常規(guī)PCR 后均能獲得明亮、單一、清晰的DNA 條帶，大小約為150 bp（含約50 bp 測(cè)序接頭序列）。44 對(duì)特異性引物敏感性驗(yàn)證結(jié)果見圖1。

圖1 特異性引物敏感性的驗(yàn)證Figure 1 The sensitivity verification of primer pairs

2.2 引物擴(kuò)增效率調(diào)整

當(dāng)每對(duì)引物的終濃度均為20 pM 時(shí)，引物的擴(kuò)增均一值在0～8.70 之間，44 對(duì)引物組成的Primer mix 中不同引物擴(kuò)增效率有很大差異。按照表1的引物終濃度調(diào)整后，用上述混合基因片段做PCR 擴(kuò)增模板的擴(kuò)增均一值差異縮小到0.33～2.37之間。見圖2。

2.3 病原菌擴(kuò)增驗(yàn)證

調(diào)整鮑曼不動(dòng)桿菌、白色念珠菌、肺炎鏈球菌、大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌模擬樣本的模板分別為3×105copies、3×104copies、3×103copies、3×102copies、3×101copies、3×100copies 時(shí)，每對(duì)引物平均的測(cè)序reads 分別 為152317.1、51168.4、28488.3、768.9、483.1、227.3。本研究建立的mPCR-NGS 方法的檢測(cè)下限為3 copies。見圖3。

圖3 不同濃度5 種菌的模擬樣本mPCR-NGS 結(jié)果Figure 3 The NGS results of different concentrations in simulated sample

2.4 血液樣本不同方法檢測(cè)結(jié)果分析

11 例血液樣本中，有6 例樣本屬于單一感染，與臨床結(jié)果完全一致；5 例樣本屬于混合感染，其中樣本1、3、7、10 的病原菌感染種類與臨床結(jié)果不完全一致。對(duì)1、3、7、10 的樣本進(jìn)行qPCR 反應(yīng)驗(yàn)證，1、3、10 樣本中分別還存在臨床檢驗(yàn)未檢出的鮑曼不動(dòng)桿菌、表皮葡萄球菌和沃氏葡萄球菌，樣本7 則存在大腸埃希氏菌和化膿鏈球菌。見圖4。

圖4 不同方法檢測(cè)血液樣本的結(jié)果Figure 4 The results of using different test methods onblood samples

2.5 所有臨床樣本檢測(cè)結(jié)果分析

臨床培養(yǎng)陽(yáng)性結(jié)果為45 例（53.57%），陰性結(jié)果為39 例（46.63%）。兩種方法的檢測(cè)結(jié)果的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.241，P＜0.05）。兩種檢測(cè)方法結(jié)果完全一致的樣本共39 例，總一致率為46.43%。見表3。84 例臨床樣本的mPCR-NGS 陽(yáng)性結(jié)果有58 例（69.05%），陰性結(jié)果為30 例（30.95%），混合感染例數(shù)為54 例（64.29%）。其中mPCR-NGS 方法檢測(cè)出16 種病原菌，其中檢出最多是鮑曼不動(dòng)桿菌28 例（28.57%），緩癥鏈球菌次之，13 例（15.48%），第三位嗜麥芽窄食單胞菌12例（14.29%）。見圖5。

圖5 mPCR-NGS 檢測(cè)臨床樣本病原菌豐度熱圖Figure 5 Heat map of pathogen abundance in clinical samples detected by mPCR-NGS

3 討論

隨著二代高通量檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，NGS被認(rèn)為是用于分析鑒定微生物的最有效方法［7］，它具有通量高、分辨率高、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)［8］，還可以提高基因檢測(cè)效率，降低基因檢測(cè)的成本［9］。多重PCR 靶向二代高通量檢測(cè)不僅滿足細(xì)菌/真菌多重感染高通量檢測(cè)需求［10］，還更好地降低混合感染中低濃度病原菌的測(cè)序誤差，提高基因檢測(cè)的專一性［11］。近年來(lái)，臨床患者感染的病原菌的耐藥性越來(lái)越高，相比于僅對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌耐藥性進(jìn)行檢測(cè)的高通量核酸診斷（Nucleic Acid Diagnostics，NAD），mPCR-NGS 技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)細(xì)菌真菌耐藥性的快速高通量檢測(cè)，彌補(bǔ)NAD 不足的同時(shí)擺脫臨床藥敏實(shí)驗(yàn)時(shí)間［12］。引入高通量快速診斷技術(shù)是解決其耐藥問(wèn)題的關(guān)鍵。

本研究通過(guò)五種病原菌模擬樣本的檢測(cè)，可知mPCR-NGS 的檢測(cè)下限為3 copies，與數(shù)字PCR 的檢測(cè)下限11 個(gè)/mL［13］相比具有一定的優(yōu)勢(shì)。mPCR-NGS 檢測(cè)的陽(yáng)性率為69.05%，高于臨床培養(yǎng)結(jié)果的陽(yáng)性率（53.57%），這可能是由于臨床培養(yǎng)依賴于活菌的生長(zhǎng)［14］，而mPCR-NGS 技術(shù)只需要對(duì)病原菌的核酸進(jìn)行富集（包括完整的病原菌基因組以及被分解的病原菌游離DNA），并對(duì)游離DNA 片段進(jìn)行高通量檢測(cè)即可鑒定是否存在病原菌［15］。本研究是通過(guò)自動(dòng)化平臺(tái)快速提取病原菌核酸，到多重PCR 文庫(kù)構(gòu)建，以及在Illumina 平臺(tái)的MiSeq 系統(tǒng)測(cè)序與數(shù)據(jù)分析需要15 個(gè)小時(shí)，可滿足臨床上樣本快速檢測(cè)的需求。

本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法篩選和設(shè)計(jì)出三種臨床樣本結(jié)果中常見22 種病原菌的44 對(duì)特異性引物，通過(guò)引物敏感性和均一性的驗(yàn)證，建立了一種基于多重PCR 和二代測(cè)序的高通量檢測(cè)方法，應(yīng)用到84 例臨床樣本中，通過(guò)測(cè)序序列區(qū)分病原菌種類，實(shí)現(xiàn)了22 種臨床常見病原菌的快速高通量檢測(cè)。