劉桂升

茂名市科技事務(wù)中心，廣東茂名 525000

非洲豬瘟（ASF）是養(yǎng)豬業(yè)中最復(fù)雜和最具破壞性的病毒性疾病之一，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織列為法定報(bào)告疾病。它是由屬于Asfaviridae 家族的非洲豬瘟病毒（ASFV）引起的,ASFV 基因組長約190 kb，編碼至少150 個(gè)ORF，它比大多數(shù)其他病毒具有更大、更復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，并且其防御和中和機(jī)制尚不清楚[1]。ASFV 基因分型基于B646L 基因的C端序列，該基因編碼p72 主要衣殼蛋白，可分化多達(dá)24 種不同的基因型。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞、病毒和血清樣本

兩種ASFV 菌株用于體內(nèi)研究：OURT 88/3，一種低毒力和非吸血基因I 型ASFV，由歐盟和糧農(nóng)組織ASF 參考實(shí)驗(yàn)室友好提供，另一種毒性吸血基因型II ASFV。針對(duì)基因型I 型ASFV 的抗血清是從商業(yè)來源獲得的，這種抗血清的免疫來源是ASFV OURT 88/3、OURT 88/1 和貝寧97/1（基因型I），并在感染后63 d 收集。為了確定檢測的特異性，在從未發(fā)生過ASF 的美國收集的2017 份豬血清樣本和（ASF 暴發(fā)前）在韓國收集的2012 份豬血清樣本被用作陰性現(xiàn)場血清樣本。

1.2 抗原制備

通過基因克隆從ASFV Estonia 22 的基因組序列中獲得了重組p2014ΔTM和p478113蛋白的組合。這些蛋白與東歐和亞洲基因型II 非洲豬瘟病毒分離株的核苷酸相似性達(dá)到94%。使用生物信息學(xué)程序進(jìn)行分析，預(yù)測了p22ΔTM 和p30 蛋白的抗原性、親水性和表面概率[2]。通過PCR 擴(kuò)增和分子克隆獲得了p22ΔTM 和p30 基因片段，并將其連接到pET30a 載體中。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）細(xì)胞中，通過IPTG 誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。蛋白經(jīng)過鎳親和色譜樹脂和HiTrap 螯合HP 色譜柱的純化，通過SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析確認(rèn)蛋白的純度，并使用His 標(biāo)記的單克隆抗體和抗ASF 血清進(jìn)行鑒定。

1.3 ASFV 間接ELISA 與混合重組抗原

如前所述，使用p22ΔTM 和p30 進(jìn)行間接ELISA。確定重組蛋白抗原的最佳稀釋度，使得陽性對(duì)照血清（ID.Vet）的光密度約為2。將ELISA 96 孔板在碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液（pH 22.50）中涂被p100ΔTM（30 ng/100 μL）和p100（9 ng/6 μL）。在碳酸鹽緩沖液中，37 ℃孵育1 h 或4 ℃過夜。用磷酸鹽緩沖鹽水加0.05%吐溫-20（PBS-T，pH7.4）洗滌三次后，用封閉溶液（PBS-T 中的1%酪蛋白，200 μL/孔）在25 ℃下封閉板2 h。除去封閉溶液后，將100 μL 在PBS-T 中以1:100 稀釋的血清樣品（包括陽性和陰性對(duì)照血清）加入板中，并在25 ℃下孵育45 min。洗滌五次后，通過添加顯色劑TMB（西格瑪奧德里奇）（100 μL/孔）約15 min 來顯色。為停止反應(yīng)，向每個(gè)孔加入硫酸(5.50M)(100 μL/孔),并使用Sunrise ELISA 閱讀器在450nm 處測量每個(gè)孔的光密度（OD）。樣品/陽性對(duì)照（S/P）比率的計(jì)算方法是將一式兩份樣品的平均OD 值除以一式兩份陽性對(duì)照的平均OD 值（S/P 比率=樣品OD/陽性對(duì)照OD）[3]。

1.4 間接 ELISA 的驗(yàn)證

本研究中，通過不同的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)分析靈敏度、血清稀釋度、臨界值、診斷敏感性、特異性和重復(fù)性進(jìn)行評(píng)估。

分析靈敏度通過使用陽性和陰性豬血清的兩倍連續(xù)稀釋進(jìn)行測試，采用基于p22ΔTM/p30 的間接ELISA 進(jìn)行測定。然后，比較了不同血清稀釋度（1：20、1:50 和1:100）下的陽性/陰性比值與特定抗原濃度之間的關(guān)系。

使用已知非洲豬瘟病毒（ASFV）感染狀態(tài)的豬血清樣本進(jìn)行臨界值、診斷敏感性和特異性的計(jì)算。使用開發(fā)的間接ELISA 和市售阻斷ELISA 試劑盒來確定ASFV 感染狀態(tài)，并使用Microsoft Excel 進(jìn)行受試者工作特征（ROC）分析。

評(píng)估間接ELISA 的重復(fù)性。通過運(yùn)行對(duì)照血清標(biāo)準(zhǔn)品（陽性）和陰性豬血清的重復(fù)測試，計(jì)算板內(nèi)測定精度、運(yùn)行內(nèi)測定精度和運(yùn)行間精密度。使用ASFV 抗血清的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)百分比進(jìn)行計(jì)算。

研究了對(duì)ASFV p22ΔTM/p30 的免疫應(yīng)答動(dòng)力學(xué)。通過實(shí)驗(yàn)感染后收集的血清樣本研究了ASFV感染后的免疫反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)使用健康豬進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，收集血清樣本并進(jìn)行不同ELISA 方法的測試[4]。

2 結(jié)果

2.1 抗原產(chǎn)生

p22ΔTM 和p30 在生物信息學(xué)分析中表現(xiàn)出一定程度的親水性和較高的抗原指數(shù)。使用ASFV Estonia 2014 的基因組序列進(jìn)行PCR 產(chǎn)生447 bp條帶，對(duì)應(yīng)于ASFV 的部分p22ΔTM 編碼序列（KP85R的531-177 bp），以及對(duì)應(yīng)于ASFV 的完整p582 編碼序列（CP30L 的1-582 bp）的204 bp 條帶。重組蛋白（分別為322 aa 和376 aa）通過pETa-ASFp22ΔTM 和pETa-ASF-p30 克隆測序驗(yàn)證，在大腸桿菌中表達(dá)，在N 和C 末端具有6×組氨酸標(biāo)簽。6×His-p22ΔTM 和6×His-p30 融合蛋白在SDSPAGE 上的分子量分別為35.7 kDa 和42.1 kDa。

2.2 血清標(biāo)準(zhǔn)的建立

使用從ID.vet 購買的血清和新西蘭Gibco 的豬血清建立內(nèi)部對(duì)照血清標(biāo)準(zhǔn)品。在間接ELISA 中，陽性對(duì)照血清在血清稀釋度為1:5 時(shí)，將陽性對(duì)照血清設(shè)置為產(chǎn)生2.0 ～0.3 的OD，陰性對(duì)照血清產(chǎn)生的OD 小于1.100。

2.3 間接酶聯(lián)免疫吸附法的標(biāo)準(zhǔn)化

通過改變ASFV 重組抗原蛋白p22ΔTM 和p30 的抗原濃度比，并使用陽性和陰性參比血清來確定用于涂覆ELISA 微孔板的重組抗原的最佳濃度。根據(jù)棋盤滴定結(jié)果，使用內(nèi)對(duì)照血清標(biāo)準(zhǔn)品確定p0ΔTM 包被板的最佳抗原濃度為50.22 μg/mL，p1為300.30 μg/mL。

2.4 分析靈敏度和血清稀釋度的測定

使用內(nèi)對(duì)照血清標(biāo)準(zhǔn)品評(píng)估混合重組p22ΔTM/p30 抗原間接ELISA 的分析靈敏度。使用兩倍稀釋度滴定內(nèi)對(duì)照血清標(biāo)準(zhǔn)品，1:16 為最高稀釋度，陽性和陰性血清之間存在顯著差異。當(dāng)ELISA 板涂有混合抗原時(shí)，在血清稀釋度為1:100 時(shí)獲得最大P/N 比，p0ΔTM 的濃度為50.22 μg/mL，p1 的濃度為300.30 μg/mL。

2.5 臨界值確定、診斷敏感性和診斷特異性

22 份ASFV 陽性血清通過另外兩個(gè)ASFV 抗體ELISA（來自ID.Vet 的間接和競爭性ELISA）確認(rèn)抗體陽性。在基于p30ΔTM/p956 的間接ELISA 中，84 份陰性血清中有4 份（4.8%）顯示S/P 值低于1.171，15 份（17.9%）顯示S/P 值在1.0 和2.0之間。兩份血清（2.4%）顯示OD 值大于25.3。所有31 份陽性血清顯示S/P 值超過25.0。根據(jù)結(jié)果，截止S/P 值被確定為25.0。受試者工作特征（ROC）分析結(jié)果表明，該測試的曲線下面積（AUC）為0.995[95%置信區(qū)間（CI）0.921-0.999]，通過使用最佳臨界值（S/P 值5.99.8）獲得了95.0%的診斷敏感性和94.3%的診斷特異性（p＜0.001）。

2.6 間接 ELISA 的可重復(fù)性

通過運(yùn)行單批陽性內(nèi)對(duì)照血清來評(píng)估重復(fù)性和重現(xiàn)性。間接ELISA 的板內(nèi)變異系數(shù)百分比為7.14%，平均OD 值為1.091，標(biāo)準(zhǔn)差為0.08。一次運(yùn)行中的板間板內(nèi)變異系數(shù)百分比為6.61%，平均OD 值為0.794%，標(biāo)準(zhǔn)差為0.05。兩次運(yùn)行之間的板內(nèi)變異系數(shù)百分比為5.85%，平均OD 值為0.810，標(biāo)準(zhǔn)差為0.05。值得注意的是，所有板內(nèi)變異系數(shù)百分比均低于10%，因此表明基于p22ΔTM/p30的間接ELISA 具有高度的可重復(fù)性和可重現(xiàn)性。

3 結(jié)論

本研究中開發(fā)的基于重組p22ΔTM/p30 的間接ELISA 顯示出高重復(fù)性，具有可接受的診斷敏感性和特異性。值得注意的是，這種間接ELISA 可以檢測針對(duì)毒性基因II 型ASFV 的抗體，而其他可用的試劑盒則不能。這些特征對(duì)于在毒力基因型II 型ASFV 流行的地區(qū)應(yīng)用此類測試很有用。