苗永美 苗翠蘋 于慶才

（1.安徽科技學(xué)院生命與健康科學(xué)學(xué)院，鳳陽 233100；2.云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，昆明 650504）

鐮刀菌（Fusarium）是一種世界性真菌，已鑒定的有300多種，常以物種復(fù)合體存在，其中23種復(fù)合體已被研究，近年來，該病原菌因在世界范圍內(nèi)侵染大量農(nóng)作物造成巨大經(jīng)濟(jì)損失而備受關(guān)注［1］。如棉花枯萎病和香蕉枯萎病均由尖孢鐮刀菌引起［2-3］，小麥赤霉病由禾谷鐮刀菌復(fù)合種引起［4-5］。鐮刀菌不僅侵染植物，還有70多個(gè)種使人類致病，如鐮刀菌性角膜炎菌對(duì)免疫力缺陷患者會(huì)造成較為嚴(yán)重的感染［1］。此外，鐮刀菌代謝毒素如鐮刀酸、伏馬菌素和白僵菌素會(huì)污染食品，引起人畜食用急性中毒［6］。鐮刀菌具有多宿主性和強(qiáng)侵染力，通過侵染寄主植物維管束系統(tǒng)破壞輸導(dǎo)組織，引起植物器官腐爛、萎蔫等，導(dǎo)致作物產(chǎn)量損失和品質(zhì)下降。鐮刀菌通過形成厚垣孢子及與寄主、輪作物、雜草等形成寄生和致病關(guān)系，持續(xù)存于生產(chǎn)系統(tǒng)中［2］，診斷和控制具有挑戰(zhàn)性，尤其是土傳病菌尖孢鐮刀菌的防治。生物防治具有高效、安全、環(huán)保等優(yōu)勢(shì)，符合現(xiàn)代農(nóng)業(yè)持續(xù)發(fā)展趨勢(shì)。

脂肽是一種具有獨(dú)特兩親性的微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物，一部分是由多個(gè)氨基酸組成的肽鏈，為親水基，另一部分是具有β-羥基或氨基的脂肪酸鏈，為親油基［7］。脂肽因其低耐藥性而被認(rèn)為是抗生素安全替代品從而受到廣泛關(guān)注，具有抗真菌、細(xì)菌、病毒、腫瘤和殺蟲等功能。近期研究表明，絕大多數(shù)芽孢桿菌菌株都可以產(chǎn)生LPs，如枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌?？咕鶯Ps根據(jù)結(jié)構(gòu)分為Iturins、Surfactins 和Fengycins三大家族，其氨基酸殘基序列、肽的環(huán)化以及脂肪酸鏈的長(zhǎng)度和分支決定其性質(zhì)和生物活性［8］。不同芽孢桿菌產(chǎn)生的脂肽類型不同，其表面活性劑特性和抑菌活性也存在差異。目前關(guān)于脂肽抑菌機(jī)制研究大多是從形態(tài)上通過電鏡掃描觀察細(xì)胞壁和細(xì)胞膜損傷、產(chǎn)生質(zhì)膜離子通道導(dǎo)致離子滲透、ROS導(dǎo)致細(xì)胞壁破壞等幾個(gè)層面。Li等［9］通過轉(zhuǎn)錄組分析脂肽中Fengycin和Iturins對(duì)黃曲霉的抑制機(jī)制發(fā)現(xiàn)，主要是通過下調(diào)核糖體發(fā)生途徑和黃曲霉毒素合成途徑中部分基因。

病原菌MF01（分子鑒定與黃色鐮刀菌F.culmorum相似性高），為實(shí)驗(yàn)室前期從發(fā)病棉花植株上分離，黃色鐮刀菌是重要的谷物冠腐病菌，易導(dǎo)致食品污染［10］。作者前期開展石豆蘭（Bulbophyllum sp.）離體培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)內(nèi)生菌豐富，通過平板對(duì)峙和發(fā)酵液抑菌兩級(jí)方法，篩選出一株細(xì)菌對(duì)MF01有較好抑制效果，分子鑒定與Bacillus subtilis subsp.subtilis strain 168相似性為98.93%，命名BBs-27［11］。為進(jìn)一步掌握發(fā)酵液中抑菌成分及抑菌機(jī)制，對(duì)發(fā)酵液理化性質(zhì)進(jìn)行初步分析發(fā)現(xiàn)，主要抑菌成分為脂肽（lipopeptides, LPs）。然而，BBs-27分泌的脂肽類型及其對(duì)F.culmorum抑菌機(jī)制尚不明確。本研究擬通過LC-MS分析抑制F.culmorum的脂肽類型，并從形態(tài)、生理和轉(zhuǎn)錄組3個(gè)方面分析其抑菌機(jī)理，旨在為鐮刀屬病原菌防治提供新思路，為開發(fā)新型、安全殺菌劑提供應(yīng)用基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

枯草芽孢桿菌BBs-27為前期從石豆蘭植物中分離［11］；病原菌MF01從發(fā)病棉花植株上切取莖段、經(jīng)表面消毒，接種PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)，經(jīng)過多次分離、純化獲得。

1.2 方法

1.2.1 MF01分子鑒定 擴(kuò)增18S RNA、28S RNA、tef-1α三個(gè)基因片段。引物（NS1: 5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′, NS4: 5′-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3′）擴(kuò)增18S RNA，引物（NL1: 5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′, NL4: 5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′）擴(kuò)增28S RNA，引物（EF1: 5′-ATGGGTAAGGA（A/G）GACAAGAC-3′, EF2: 5′-GGA（G/A）GTAC CAGT（G/C）ATCATG-3′）擴(kuò)增tef-1α［12］。DNA提取、引物合成、擴(kuò)增、序列拼接等工作委托通用生物（安徽）股份有限公司完成。根據(jù)各基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，從NCBI/GenBank數(shù)據(jù)庫中搜索并下載相關(guān)菌株的各基因序列，Sequencher軟件將下載的原始基因序列串聯(lián)拼接，用Clustal X軟件將拼接后的基因序列Alignment比對(duì)。用MEGA 7.0軟件，選擇Kimura 2-parameter+Gamma Distributed模型計(jì)算進(jìn)化距離，采用最大似然法（maximum-likelihood）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap method 1 000次評(píng)估系統(tǒng)發(fā)育樹各分支置信度。

1.2.2 BBs-27發(fā)酵上清液制備 參照苗永美等［13］方法依次進(jìn)行菌種活化、種子液制備、發(fā)酵、收集上清、微孔膜過濾。

1.2.3 發(fā)酵液理化性質(zhì)分析 1.2.2過濾液用4% HCl（V/V）和4% NaOH（m/V）將pH分別調(diào)至2、4、6、8、10、12，放置5 h，再調(diào)回至初始pH；取10 mL過濾液于直徑9 cm培養(yǎng)皿中，紫外照射5、10、15、20、25、30 min；取9 mL過濾液分別加入1 mL 10 mg/mL的胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K，37℃放置2 h；不進(jìn)行任何處理為對(duì)照組（pH 5.5）。各處理液：PDA（1∶10）混合制平板，選用瓊脂柱法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，計(jì)算抑菌率，具體方法參照苗永美等［13］方法。

1.2.4 粗脂肽提取 根據(jù)1.2.3結(jié)果，推斷發(fā)酵液中主要抑菌物質(zhì)為脂肽。按照Wu等［14］方法略作修改。具體方法：7 mol/L HCl調(diào)至pH 2，過夜、收集沉淀，少量蒸餾水溶解，1 mol/L NaOH調(diào)至中性，甲醇多次抽提、40℃減壓濃縮、35℃真空干燥得粗脂肽干品。配制10 mg/mL母液。

1.2.5 粗脂肽的純化與LC-MS鑒定 甲醇溶解粗脂肽，拌硅膠、陰涼處自然風(fēng)干。濕法裝柱、氯仿壓柱、上樣，用氯仿洗脫，依次用氯仿∶甲醇體積比為98∶2、95∶5、9∶1、8∶2進(jìn)行梯度洗脫，牛津杯法分析各組分抑菌活性。具抑菌活性的組分采用超高效液相色譜-線性離子阱靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀（型號(hào)：Ulitimate 3000- LTQ Orbitrap XL）進(jìn)行分析。色譜條件：C18柱（Hypersil GOLD，100 mm×2.1 mm），填料粒徑1.9 μm，柱溫27.5℃。流動(dòng)相：甲醇∶水（0.1%含甲酸）=98∶2，流速0.3 mL/min。質(zhì)譜條件：HESI離子源，離子源溫度300℃，噴霧電壓3.5 kV，高分辨FTMS模式，分辨率60 000，采集正離子，質(zhì)核比范圍100-1 200。

1.2.6 電鏡掃描 PDA 培養(yǎng)基中添加500 μg/L脂肽后接種病原菌，培養(yǎng)3 d，挑取菌絲電鏡掃描，具體步驟參見苗永美等［13］方法。

1.2.7 生理指標(biāo)測(cè)定 根據(jù)1.2.4試驗(yàn)結(jié)果，PDA中添加脂肽使終濃度分別為100、500、1 000 μg/L，蒸餾水為對(duì)照。培養(yǎng)3 d時(shí)，刮取菌絲于預(yù)冷研缽中，加pH 7.8、0.05 mol/L預(yù)冷PBS研磨成勻漿，4℃、12 000 r/min離心20 min，上清為待測(cè)酶液。超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍(lán)四唑法測(cè)定，以抑制NBT光化還原的50%為一個(gè)酶活單位（U）；過氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定，以每分鐘OD值變化（升高）0.1為1個(gè)酶活性單位（U）；過氧化氫酶（CAT）活性采用過氧化氫還原法測(cè)定，以每分鐘OD值變化0.1為1個(gè)酶活性單位（U）；可溶性蛋白質(zhì)采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定；可溶性糖含量采用苯酚硫酸法測(cè)定。

1.2.8 轉(zhuǎn)錄組分析 PDA+500 μg/L脂肽，鋪玻璃紙、接種、28℃培養(yǎng)3 d，刮取菌絲液氮速凍后送至美吉生物公司，3次生物學(xué)重復(fù)（T1-T3），蒸餾水為對(duì)照（C1-C3）。依次提取總RNA、Oligo dt富集mRNA、片段化，反轉(zhuǎn)錄、End Repair Mix將雙鏈cDNA補(bǔ)成平末端，加ployA接頭、擴(kuò)增、Illumina平臺(tái)測(cè)序。對(duì)原始數(shù)據(jù)過濾和質(zhì)控，使用比對(duì)工具Hisat2將高質(zhì)量序列與參照物種禾谷鐮刀菌（F.graminearum）基因組進(jìn)行mapping，統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品比對(duì)到每個(gè)基因上reads數(shù)；RSEM軟件以TPM＞1為衡量標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算每個(gè)基因表達(dá)量；DESeq2軟件分析差異表達(dá)基因DEGs，以P-adjust＜0.05和|log2FC|≥1為DEGs的篩選條件；用GO數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因功能注釋；以顯著性水平P-value≤0.5對(duì)功能注釋的基因進(jìn)行KEGG富集，確定DEGs主要富集的通路及其可能的生物學(xué)功能。

1.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、SPSS19.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析，Origin2018作圖。轉(zhuǎn)錄組分析及作圖均在美吉生物公司網(wǎng)站完成。

2 結(jié)果

2.1 病原菌MF01分子鑒定

18S RNA、28S RNA、tef-1α三個(gè)基因片段串聯(lián)拼接、比對(duì)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果（圖1）表明，MF01與F.culmorum、F.cerealis聚成一個(gè)支持強(qiáng)度為78%的末端分支。根據(jù)相似性高低，將MF01鑒定為黃色鐮刀菌（F.culmorum）。

圖1 基于三基因序列拼接的MF01系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of MF01 based on three-gene sequence splicing

2.2 抑菌物質(zhì)穩(wěn)定性分析

發(fā)酵液經(jīng)酸堿處理后抑菌活性有明顯變化，pH 6-8時(shí)抑菌活性與對(duì)照（pH 5.5）差異不顯著，說明抑菌成分能耐一定酸堿，當(dāng)pH ＜ 4或＞10時(shí)，活性會(huì)顯著降低（圖2-A）。短時(shí)間紫外線照射不會(huì)影響抑菌成分活性，超過10 min會(huì)明顯降低活性（圖2-B）。抑菌物質(zhì)對(duì)胃蛋白酶不敏感，但經(jīng)胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和蛋白酶K處理后其抑菌率顯著降低（圖2-C）。

圖2 不同處理后發(fā)酵液的抑菌效果Fig.2 Inhibitory effects of fermentation broths after different treatments

2.3 脂肽成分鑒定

硅膠柱共分離到24種組分，其中組分23具有抑菌活性。對(duì)組分23進(jìn)行UPLC-MS分析，0.94 min左右出現(xiàn)一個(gè)主要洗脫峰（圖3-A），收集洗脫物進(jìn)行HESI-MS，結(jié)果出現(xiàn)了兩大類物質(zhì)。第一大類主含物質(zhì)其m/z值為1 065.54、1 079.55、1 093.57（圖3-B），它們的相對(duì)分子量相差14 Da，與一個(gè)亞甲基-CH2的分子量大小一致，說明是相差一個(gè)脂肪鏈的同系物，對(duì)比脂肽類物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量推斷出為伊枯草菌素家族類物質(zhì)。第二大類主含物質(zhì)其m/z值為1 433.80、1 447.82、1 461.83、1 463.81、1 477.83、1 491.84、1 505.85、1 519.86、1 533.88，1 485.78、1 499.80、1 513.82（圖3-C），以上兩組物質(zhì)相對(duì)分子量也相差14 Da，根據(jù)分子量推測(cè)為豐原素同系物。

圖3 脂肽的LC-MS分析Fig.3 LC-MS analysis of LPs

2.4 電鏡掃描結(jié)果

電鏡掃描結(jié)果顯示，對(duì)照組菌絲表面光滑，粗細(xì)較為一致，生長(zhǎng)正常（圖4-A），脂肽處理組菌絲扭曲、不規(guī)則、粗細(xì)不均，異常擴(kuò)張，部分部位膨大為“氣球狀”（圖4-B）。由此看出，脂肽對(duì)黃色鐮刀菌的傷害在菌絲形態(tài)上體現(xiàn)較為明顯。

圖4 掃描電鏡下黃色鐮刀菌菌絲形態(tài)特征Fig.4 Mycelium morphology of F.culmorum by SEM

2.5 脂肽對(duì)黃色鐮刀菌保護(hù)酶活性影響

由圖5-A看出，100 μg/L脂肽處理菌絲體內(nèi)SOD活性與對(duì)照差異不顯著，當(dāng)濃度大于500 μg/L時(shí)，SOD活性顯著低于對(duì)照，兩個(gè)處理濃度下分別降低了49.78%和53.66%，說明此時(shí)已對(duì)SOD系統(tǒng)造成傷害。3個(gè)脂肽濃度會(huì)顯著降低菌體POD和CAT活性，POD比對(duì)照分別降低了41.05%、62.57%、63.68%（圖5-B），CAT活性比對(duì)照分別降低了30.66%、58.64%、74.70%（圖5-C），說明100 μg/L的脂肽濃度就會(huì)對(duì)POD和CAT系統(tǒng)造成傷害。3種保護(hù)酶系統(tǒng)受脂肽影響最大的是POD，其次是CAT，最小的是SOD。

圖5 脂肽對(duì)保護(hù)酶的影響Fig.5 Effects of lipopeptide on protective enzymes

2.6 脂肽對(duì)黃色鐮刀菌滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)影響

隨著脂肽濃度的提高，菌絲體內(nèi)可溶性蛋白和可溶性糖含量逐漸降低，顯著低于對(duì)照?？扇苄缘鞍追謩e降低了25.32%、39.09%、63.44%，但100 μg/L和500 μg/L處理上含量差異不顯著（圖6-A）。3個(gè)脂肽處理下可溶性糖比對(duì)照分別降低了28.40%、43.85%、78.13%（圖6-B）。說明大于100 μg/L的脂肽已顯著影響菌體中兩種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成。

圖6 脂肽對(duì)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)影響Fig.6 Effects of lipopeptide on osmoregulatory substances

2.7 指標(biāo)相關(guān)性分析

抑菌率高說明菌絲生長(zhǎng)緩慢，菌絲受到傷害大。相關(guān)性分析顯示（表1），抑菌率與5項(xiàng)指標(biāo)呈極顯著負(fù)相關(guān)，說明菌絲體內(nèi)3種保護(hù)酶、可溶性糖和可溶性蛋白受到脅迫后都作出強(qiáng)烈響應(yīng)，或者說受到嚴(yán)重破壞。除SOD活性與其他4項(xiàng)指標(biāo)、POD與可溶性糖呈顯著相關(guān)外，其他指標(biāo)之間相關(guān)性均達(dá)到極顯著水平。每項(xiàng)指標(biāo)與其他5項(xiàng)指標(biāo)相關(guān)系數(shù)平均值從大到小依次為：抑菌率＞CAT活性＞可溶性蛋白＞可溶性糖＞POD活力＞SOD活力。

表1 指標(biāo)之間相關(guān)系數(shù)Table 1 Correlation coefficient among indexes

2.8 黃色鐮刀菌響應(yīng)脂肽的轉(zhuǎn)錄組分析

2.8.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析 T組和C組6個(gè)cDNA庫共產(chǎn)生316 765 242條reads，質(zhì)控后獲得305 671 078條reads，各樣品測(cè)得數(shù)據(jù)過濾后所占比例超過96%，樣品誤差率＜ 0.03%，Q20＞96%，Q30＞91%，GC含量在52.27%-52.87%，比對(duì)率＞78%，說明測(cè)得數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度較高，利于后期數(shù)據(jù)分析（表2）。

表2 質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 2 Quality control data statistics

2.8.2 基因表達(dá)及DEGs分析 利用TPM＞1為衡量指標(biāo)計(jì)算基因表達(dá)量，對(duì)照組中共鑒定出9 015個(gè)表達(dá)基因，特有表達(dá)基因187個(gè)；處理組中共有9 219個(gè)基因，特有表達(dá)基因391個(gè)；共同表達(dá)的基因有8 828個(gè)（圖7）。與對(duì)照相比，處理組中篩選出712個(gè)DEGs，其中上調(diào)表達(dá)基因393個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因319個(gè)（圖8）。

圖7 不同樣品間表達(dá)量Venn分析Fig.7 Venn analysis of gene expressions between samples

2.8.3 DEGs的GO功能注釋分析 GO功能注釋分類結(jié)果表明，712個(gè)DEGs主要涉及到6個(gè)生物學(xué)過程、11個(gè)細(xì)胞組分和12分子功能，基因數(shù)量前20位GO分類見圖9。3個(gè)大類分別有300個(gè)（上調(diào)基因130個(gè)，下調(diào)基因170個(gè)）、453個(gè)（上調(diào)基因214個(gè)，下調(diào)基因239個(gè)）、570個(gè)（上調(diào)基因275個(gè)，下調(diào)基因295個(gè)）DEGs。根據(jù)富集DEGs數(shù)量，主要生物學(xué)過程有代謝進(jìn)程（metabolic process）和細(xì)胞進(jìn)程（cellular process），主要細(xì)胞組分有膜組分（membrane part）和細(xì)胞組分（cell part），主要分子功能有催化活性（catalytic activity）和結(jié)合功能（binding）。

2.8.4 DEGs的KEGG通路富集分析 對(duì)所有DEGs進(jìn)行KEGG通路富集分析，結(jié)果表明，712個(gè)DEGs中有185個(gè)富集到78條代謝通路中，涉及到代謝、細(xì)胞進(jìn)程、生物系統(tǒng)、人類疾病、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理6個(gè)一級(jí)分類，其中89個(gè)上調(diào)DEGs參與41個(gè)代謝通路，96個(gè)下調(diào)DEGs參與60個(gè)代謝通路（圖10）。P-value＜0.05顯著富集的有6條（表3）。

圖10 差異表達(dá)基因KEGG富集前20位代謝通路Fig.10 Top 20 metabolic pathways of differentially expressed genes enriched by KEGG

顯著富集到碳水化合物途徑共14個(gè)DEGs，參與半乳糖代謝（Map00052）、氨基糖和核苷糖代謝（Map00520），已知的有半乳糖氧化酶（galactose oxidase, GAO）前體、內(nèi)切幾丁質(zhì)酶（endochitinase,CHIT）前體，幾丁質(zhì)合成酶3（chitin synthase 3,CHS3）、甘露糖-1-磷酸鳥苷酰轉(zhuǎn)移酶（mannose-1-phosphate guanyltransferase, MPG1）基因，其他均為未知假設(shè)蛋白（hypothetical protein）（表3）。脂肽處理會(huì)使菌絲體中GAO和MPG1上調(diào)表達(dá)，而CHS3和CHIT都下調(diào)表達(dá)。

DEGs顯著富集到脂代謝通路是麥角甾醇合成途徑（Map00100），有具體名稱的3個(gè)DEGs分別是Δ（14）-甾醇還原酶基因（Delta（14）-sterol reductase, ERG24）、C-5甾醇去飽和酶基因（C-5 sterol desaturase, ERG3）、C-4甲基甾醇氧化酶基因（C-4 methylsterol oxidase, ERG25）［15］。ERG24、ERG25、ERG3和FGSG_06215均上調(diào)，而FGSG_02016下調(diào)表達(dá)，說明所用脂肽處理濃度對(duì)細(xì)胞膜傷害較小，菌體通過積極上調(diào)部分麥角甾醇合成相關(guān)酶表達(dá)來調(diào)整細(xì)胞膜流動(dòng)性以抵抗外界脅迫。

氨基酸代謝通路中有具體名稱的3個(gè)DEGs分別是3-異丙基蘋果酸脫水酶（3-isopropylmalate dehydratase, 3-IPDH）、酮酸還原酶（ketol-acid reductoisomerase, KARI）、鳥氨酸脫羧酶（ornithine decarboxylase, ODC），該4種酶參與支鏈氨基酸纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成（Map00290）。IPDH呈下調(diào)、KARI呈上調(diào)變化，另兩種未知酶分別呈上調(diào)和下調(diào)變化，其變化可能會(huì)影響3種支鏈氨基酸合成，尤其是變化幅度較大的下調(diào)基因如IPDH可作為BBs-27脂肽靶標(biāo)重點(diǎn)研究。脂肽處理組菌體中參與谷胱甘肽代謝的酶基因有3個(gè)上調(diào)、2個(gè)下調(diào)，下調(diào)表達(dá)且有具體功能描述的是ODC，該酶催化鳥氨酸形成的尸胺參與到谷胱甘肽代謝（Map00480），通過下調(diào)表達(dá)可能會(huì)影響生物體的谷胱甘肽代謝，從而影響抗氧化系統(tǒng)。

在輔助因子和維生素代謝（Map00770）中差異表達(dá)的DEGs有4個(gè)，包含1個(gè)下調(diào)和3個(gè)上調(diào)，具體名稱描述的是KARI，呈上調(diào)變化。

3 討論

3.1 脂肽的理化性質(zhì)及類型

目前研究表明有些枯草芽孢桿菌菌株的代謝物質(zhì)能抑制農(nóng)業(yè)病原菌［16］、動(dòng)物病原菌［17］或食品源致病菌［18］。不同菌株產(chǎn)生的活性物質(zhì)不同，抑菌效果也不同，目前報(bào)道的活性成分多是蛋白質(zhì)類［19-21］和脂肽類［3,7,22］，也有揮發(fā)性物質(zhì)研究的少量報(bào)道［23］。吳越等［19］研究表明，枯草芽孢桿菌HAINUP40分泌的能夠抑制羅非魚無乳鏈球菌的活性物質(zhì)對(duì)蛋白酶K敏感，不耐高溫，pH ＜ 4或＞ 8時(shí)失去抑菌活性，可以耐受短時(shí)間（＜ 180 s）紫外線照射，表明抑菌物質(zhì)為大分子蛋白質(zhì)，并非小分子脂肽。鄧陽等［20］研究枯草芽孢桿菌J-4菌株產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)在100℃水浴60 min、pH為2.8-8.0范圍內(nèi)均具有較高活性，CTAB和CaCl2還能增強(qiáng)其活性，但會(huì)被胃蛋白酶或胰蛋白酶分解，據(jù)此推測(cè)為抗菌蛋白類物質(zhì)。李麗等［21］也從枯草芽孢桿菌S6的發(fā)酵液中分離到抗棉花枯萎病的拮抗蛋白。關(guān)于枯草芽孢桿菌產(chǎn)脂肽類抑菌物質(zhì)的研究更多，脂肽是非核糖體途徑合成，具有活性強(qiáng)、穩(wěn)定性高、安全等特點(diǎn)。與抗菌蛋白質(zhì)不同的是多數(shù)脂肽耐受性強(qiáng)，曾國(guó)洪等［22］研究表明，枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的脂肽在25-80℃下抗菌活性幾乎保持不變，具良好熱和pH穩(wěn)定性，對(duì)胰蛋白酶和胃蛋白酶不敏感。BBs-27發(fā)酵液理化性質(zhì)分析結(jié)合前期耐熱性研究［13］，推測(cè)抑菌物質(zhì)是以脂肽類為主，且包括少量蛋白質(zhì)。不同菌株產(chǎn)生脂肽類型不同，LC-MS分析證實(shí)BBS-27抑制F.culmorum的抗菌肽主要是伊枯草菌素和豐原素兩大類，每類也都是復(fù)合物。B.velezensis產(chǎn)生的脂肽主要是伊枯草菌素和豐原素［18］，B.amyloliquefaciens能產(chǎn)生表面活性素、泛革素和伊枯草菌素三類脂肽類化合物以及Bacillibactin、Difficidin和Bacillaene三類聚酮類化合物［24］。

3.2 脂肽的抑菌機(jī)制

BBs-27分泌的兩類脂肽會(huì)導(dǎo)致菌絲畸形，細(xì)胞壁合成受阻，異常腫脹，部分呈“氣球狀”，與B.velezensis和B.amyloliquefaciens粗提脂肽分別對(duì)黃曲霉和香蕉枯萎菌絲細(xì)胞壁破壞結(jié)果非常相似［21,24］，也能使曲霉細(xì)胞呈“氣球狀”［25］。BBs-27分泌的兩類脂肽使菌體中SOD、POD、CAT酶活性和可溶性蛋白、可溶性糖含量顯著下降，相關(guān)性分析表明，脂肽是通過破壞SOD、POD、CAT等保護(hù)酶系統(tǒng)，及抑制可溶性蛋白和可溶性糖合成來抑制菌體生長(zhǎng)。

細(xì)胞壁是鐮刀菌侵染植物過程中最先接觸的結(jié)構(gòu)，是鐮刀菌保持致病力和正常發(fā)育所必須結(jié)構(gòu)。真菌細(xì)胞壁多糖包括幾丁質(zhì)、葡聚糖、甘露聚糖和半乳糖等，GAO、CHIT、CHS3、MPG1參與細(xì)胞壁形成。GAO 催化半乳糖形成乙醛糖和H2O2，注射D-半乳糖致小鼠衰老的機(jī)理是ROS的增加引起機(jī)能損傷，干擾細(xì)胞正常代謝［26］。脂肽處理會(huì)引起F.culmorum中GAO上調(diào)表達(dá)，推測(cè)真菌可能也與動(dòng)物體內(nèi)一樣因產(chǎn)生過多ROS損傷機(jī)體，此外乳糖的氧化還會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)遭到破壞。CHS3是參與合成禾谷鐮刀菌細(xì)胞壁的基因之一，是其致病和發(fā)育的關(guān)鍵基因［27］，還影響環(huán)境適應(yīng)能力［28］。值得注意的是，本研究中幾丁質(zhì)合成基因CHS3和降解基因CHIT都下調(diào)表達(dá)，推測(cè)脂肽主要是通過抑制幾丁質(zhì)合成來影響細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，因此，CHS3可作為農(nóng)藥靶標(biāo)深入研究。此外，MPG1上調(diào)表達(dá)會(huì)加大催化甘露糖形成GDP-甘露糖的力度，造成細(xì)胞壁穩(wěn)定性和強(qiáng)度減弱，也會(huì)使菌體變脆弱。

脂肽能增大Botrytis cinerea和F.oxysporum細(xì)胞膜通透性，導(dǎo)致滲透物質(zhì)流出和電導(dǎo)率上升［6,29］。麥角甾醇是真菌細(xì)胞膜主要固醇類物質(zhì)，本研究中參與麥角甾醇代謝通路的5個(gè)DEGs中有4個(gè)上調(diào)，說明脂肽對(duì)F.culmorum細(xì)胞膜會(huì)有一定影響，菌體能通過積極上調(diào)部分麥角甾醇合成相關(guān)酶表達(dá)來調(diào)整細(xì)胞膜流動(dòng)性以抵抗傷害，而FGSG_02016表達(dá)下降，后期可對(duì)序列信息、調(diào)控功能、與細(xì)胞膜損傷相關(guān)性等進(jìn)行深入研究。本研究也進(jìn)一步證實(shí)了麥角固醇合成途徑的酶類是唑類抗真菌藥物的主要靶點(diǎn)［15］。

脂肽破壞3種酶系統(tǒng)的分子響應(yīng)機(jī)制，可能是通過改變GAO和ODC等基因表達(dá)。方欣等［30］通過基因敲除和外源恢復(fù)等方法，證明3-異丙基蘋果酸脫水酶基因（FgLEU1）在禾谷鐮刀菌亮氨酸合成、菌絲孢子形成及產(chǎn)毒致病過程中發(fā)揮著重要作用。脂肽導(dǎo)致IPDH下調(diào)表達(dá)的結(jié)果可能會(huì)干擾支鏈氨基酸合成，進(jìn)而影響菌體蛋白合成和生長(zhǎng)。由于支鏈氨基酸合成途徑只在植物和微生物中存在，哺乳動(dòng)物中不存在，從農(nóng)產(chǎn)品安全角度出發(fā)，支鏈氨基酸合成酶成為安全藥劑的靶標(biāo)和研究熱點(diǎn)。

4 結(jié)論

BBs-27產(chǎn)生抑制F.culmorum的物質(zhì)主要是脂肽類且含有少量蛋白質(zhì)，抗菌肽包含伊枯草菌素和豐原素兩大類。脂肽使菌絲卷曲、畸形、異常膨大，能破壞SOD、POD、CAT和可溶性蛋白及可溶性糖合成系統(tǒng)，生理變化與生長(zhǎng)表現(xiàn)呈極顯著相關(guān)性。脂肽通過改變GAO、CHS3、MPG1的表達(dá)來干擾幾丁質(zhì)、半乳糖和甘露糖和麥角甾醇合成以破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)受阻；脂肽還能上調(diào)GAO而產(chǎn)生H2O2損傷機(jī)體，下調(diào)ODC干擾谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)，降低抗氧化酶活性。此外，脂肽還能通過下調(diào)IPDH表達(dá)干擾支鏈氨基酸代謝，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。GAO、CHS3、MPG1、IPDH均可作為脂肽作用靶點(diǎn)用于殺菌劑開發(fā)。