楊志曉 侯騫 劉國權(quán) 盧志剛 曹毅 芶劍渝 王軼 林英超

（1.貴州省煙草科學(xué)研究院，貴陽 550081；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，楊凌 712100；3.貴州省煙草公司銅仁市公司，銅仁 554300；4.貴州省煙草公司遵義市公司，遵義 563000）

煙草赤星病是由鏈格孢菌（Alternaria alternata（Fries）Keissler）侵染煙株引起的一類真菌性病害，屬于中國煙葉生產(chǎn)中的主要病害之一［1］。該病具有潛育期短、流行速度快的特點(diǎn)，在外界環(huán)境條件適宜情況下，短時間內(nèi)就能夠大面積爆發(fā)流行。煙草赤星病主要危害葉片，嚴(yán)重時還會影響莖稈、花梗與蒴果，造成產(chǎn)量、品質(zhì)降低，不利于優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)，但迄今尚無十分有效的防治途徑［2-3］。因此，深入研究煙草赤星病的致病機(jī)理，培育抗性良好的優(yōu)質(zhì)品種是目前煙葉生產(chǎn)中亟待解決的問題。

光合作用為植物生長發(fā)育提供所必需的物質(zhì)和能量，是決定產(chǎn)量、品質(zhì)的最關(guān)鍵因素［4］。大量研究證實，病原菌侵染能夠作用于寄主光合活動，最終改變光合作用進(jìn)程［5-6］。因此，病原菌如何影響植株的生理活性進(jìn)而抑制光合作用始終是植物-病原菌互作研究的重點(diǎn)。光合作用對外界環(huán)境變化十分敏感［7］。影響光合作用的各種外界逆境脅迫因子均通過影響葉綠體中的核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco）而發(fā)揮作用，但Rubisco必須經(jīng)過核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶活化酶（RCA）的活化方能顯現(xiàn)出其羧化/加氧活性，即Rubisco在植株中的活性高低取決于RCA對它的活化［8］。在外界逆境脅迫條件下，植物光合作用的變化與Rubisco、RCA活性具有密切關(guān)系［9-10］。在鹽脅迫下，四倍體金銀花葉片的Rubisco活化狀態(tài)與氣孔導(dǎo)度均處在較高水平，有助于保持較強(qiáng)的光合性能［11］。低產(chǎn)玉米具有較低的RCA活性，而提高RCA水平則有助于增加Rubisco活性和光合活動速率，并伴隨著玉米產(chǎn)量的上升［12］。干旱、高溫和二者復(fù)合脅迫均可降低Rubisco、RCA活性，進(jìn)而造成小麥葉片的葉綠素含量與光合速率出現(xiàn)明顯下降［13］。與此同時，Rubisco、RCA的基因表達(dá)水平也顯著影響植物對外界脅迫的適應(yīng)能力［14］。萵苣光合效率下降是由于Rubisco大亞基基因（rbcL）、小亞基基因（rbcS1、rbcS2）和RCA基因（rca1、rca2）表達(dá)量的降低所造成的［15］。弱光脅迫可抑制Rubisco大、小亞基（rbcL、rbcS）與RCA（rca）的mRNA表達(dá)，引起Rubisco活性降低，最終導(dǎo)致黃瓜光合作用下降［16］。在中度水分虧缺處理下，外源NO能提高玉米葉片的Rubisco、RCA活性及基因（rbcL、rbcS和rcaβ）表達(dá)水平，從而有助于增加Rubisco羧化效率［17］。

在赤星病發(fā)生后，煙草葉片出現(xiàn)病斑而褪綠變黃，嚴(yán)重時病斑融合成碎葉或枯焦葉，造成光合器官受損，顯示出赤星病對煙草葉片的危害和光合作用密切相關(guān)［18-20］。現(xiàn)階段關(guān)于煙草赤星病的研究大部分集中在赤星病菌生理小種的分化和遺傳多樣性［21］、病害主要發(fā)生規(guī)律［22］與防治途徑［23］，以及不同種質(zhì)資源抗病能力的綜合評價［24］等方面，而關(guān)于赤星病脅迫對煙草光合特性的影響及其作用機(jī)理的研究報道則相對較少。因此，深入探討赤星病脅迫下Rubisco、RCA變化對光合作用的調(diào)控具有重要意義。基于此，本研究以不同抗性煙草品系為對象，系統(tǒng)分析赤星病脅迫對Rubisco、RCA活性及其基因表達(dá)的影響，旨在進(jìn)一步闡明赤星病脅迫抑制煙草光合特性的相關(guān)生理機(jī)制，從而為抗病品種選育和病害防治提供有益借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

所用煙草（Nicotiana tabacum L.）材料分別為抗、感赤星病品系JYH、CBH（JYH是由CBH的抗赤星病突變單株經(jīng)系統(tǒng)選育而成）［25］。試驗采用漂浮育苗方式進(jìn)行育苗，于6葉1心時選擇生長整齊一致的壯苗移栽到盛有20 kg土的聚乙烯塑料盆（高27 cm×外徑33 cm×內(nèi)徑21 cm）內(nèi)，每盆種煙一株，每個品系共計種植150盆。供試土壤屬于壤質(zhì)潮土（有機(jī)質(zhì)8.53 g/kg、全氮0.92 g/kg、速效氮65.47 mg/kg、速效磷24.55 mg/kg、速效鉀108.16 mg/kg、pH 7.92）。每盆煙株N、P2O5、K2O的施用量是0.13、0.13和0.39 g/kg，肥料分3次施入，施入時間分別在移栽當(dāng)天、移栽后第1周及第2周，肥量比例2∶1∶1。

以致病力較強(qiáng)的煙草赤星病菌（Alternaria alternata（Fries）Keissler）GM831為供試菌株。在25℃環(huán)境下，將供試菌株在PDA平板上連續(xù)培養(yǎng)7 d。在充分產(chǎn)孢后，置于10 mL 1%（體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)）無菌葡萄糖溶液中浸泡15 min，采用無菌棉簽洗下孢子與菌絲體，經(jīng)過4層無菌紗布過濾后除去菌絲體，此后用1%無菌葡萄糖溶液配成孢子懸浮液（濃度為1.0×105個/mL）用于開展赤星病菌人工接種［26］。

移栽后50 d時，選擇煙株第3、4葉位葉片（從下向上數(shù)，下同），使用孢子懸浮液噴霧法進(jìn)行人工接種（赤星病菌孢子懸浮液在人工接種時現(xiàn)用現(xiàn)配）。用小型手持噴霧器將孢子懸浮液噴灑到煙草葉片上，葉面達(dá)到均勻布滿孢子懸浮液但不下淌的程度，以1%無菌葡萄糖溶液處理作為對照［27］。接種后將煙株置于人工氣候室中于25℃黑暗保濕24 h，此后進(jìn)行正常管理，保持晝/夜溫度為26℃/20℃，相對濕度達(dá)到65%。于接種赤星病菌后的第5、9天的上午9:00-11:00 選擇接種葉片進(jìn)行光合作用測定，然后進(jìn)行取樣。在去除主、側(cè)脈后，把葉片剪碎混勻用液氮速凍后保存在-80℃超低溫冰箱內(nèi)，用于各項指標(biāo)的測定。每個指標(biāo)測定重復(fù)3次。

1.2 方法

1.2.1 光合作用參數(shù) 使用Li-6400便攜式光合儀（Li-Cor Inc.，USA）分別測定凈光合速率［Pn, μmol CO2/（m2·s）］、氣孔導(dǎo)度［Gs, mmol/（m2·s）］、胞間CO2濃度（Ci, μmol/mol）［27］。測定時使用紅藍(lán)光源葉室，采用開放式氣路，葉室溫度達(dá)到25℃，空氣相對濕度為60%-70%，CO2濃度是400 μmol/mol，光照強(qiáng)度達(dá)到1 000 μmol/（m2·s），光量子通量密度是800 mol/（m2·s）。

1.2.2 Rubisco、RCA活性 取煙草葉片0.1 g，置于研缽內(nèi)分別加入液氮、1%不溶性PVP和1.9 mL預(yù)冷提取液［HEPES-KOH（pH 7.0）50 mmol/L，EDTA 1 mmol/L，MgCl25 mmol/L，ATP 0.4 mmol/L，DTT 15 mmol/L，PMSF 1 mmol/L，Benzamidine 2 mmol/L，Leupeptin 0.01 mmol/L］磨成均漿，此后15 000×g離心10 min［28］，所得的上清液使用植物酶聯(lián)免疫分析試劑盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）用于測定Rubisco、RCA活性。

1.2.3 Rubisco、RCA基因相對表達(dá)量測定 將煙草葉片10 g在研缽中用液氮研磨至發(fā)白粉末狀，此后使用RNAiso Plus試劑盒進(jìn)行RNA提取。cDNA第一鏈的合成采用Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒開展，Real-Time PCR使用SYBRRPremix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）試劑盒，均由上海寶生物工程有限公司生產(chǎn)。根據(jù)GenBank和煙草基因組數(shù)據(jù)庫的核苷酸序列，利用DNAMAN與Primer Premier 5.0軟件設(shè)計Rubisco大亞基基因（rbcL）、小亞基基因（rbcS）以及RCA基因（rca）引物序列，以Actin作為內(nèi)參基因（表1），依據(jù)2-ΔΔCT法計算各個基因的相對表達(dá)量［29］。

表1 實時熒光定量PCR引物Table 1 Primers for real-time quantitative RCR

1.2.4 Rubisco、RCA蛋白含量 Rubisco蛋白rbcL、rbcS及RCA蛋白rca含量根據(jù)間接Elisa法進(jìn)行測定［30］。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 利用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)開展統(tǒng)計分析, 并使用Sigma Plot 10.0軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果

2.1 赤星病脅迫對不同抗性煙草品系光合特性的影響

如圖1所示，赤星病脅迫引起CBH的Pn、Gs連續(xù)降低，而Ci卻呈增加趨勢，且與對照間的差異均達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。在脅迫9 d時，CBH的Pn、Gs較對照分別下降62.28%、66.67%，而Ci為對照的1.57倍。脅迫5 d時，JYH的Pn、Gs、Ci和對照間均無顯著差異，此后JYH的Pn、Gs和Ci呈現(xiàn)明顯下降，降幅分別達(dá)到39.24%、35.42%及30.74%。赤星病脅迫9 d，JYH的Pn、Gs分別為CBH的1.59、1.82倍，而CBH的Ci則是JYH的2.30倍，差異均達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。

圖1 赤星病脅迫對不同抗性煙草品系光合作用參數(shù)的影響Fig.1 Effects of brown spot stress on photosynthetic parameters in different resistant tobacco cultivars

2.2 赤星病脅迫對不同抗性煙草品系Rubisco、RCA活性的影響

與對照相比，CBH的Rubisco、RCA活性在赤星病脅迫下大幅降低，且呈顯著差異（P＜0.05）（圖2）。在脅迫9 d時，CBH的Rubisco活化狀態(tài)、初始活性、總活性和RCA活性較對照分別下降72.12%、84.79%、79.84%及86.67%。

圖2 赤星病脅迫對不同抗性煙草品系Rubisco、RCA活性的影響Fig.2 Effects of brown spot stress on the activities of Rubisco and RCA in different resistant tobacco cultivars

在赤星病脅迫5 d，JYH的Rubisco活化狀態(tài)、初始活性、總活性以及RCA活性均與對照不存在顯著差異，此后，Rubisco、RCA活性出現(xiàn)降低。在脅迫9 d時，JYH的Rubisco活化狀態(tài)、初始活性、總活性與RCA活性分別是CBH的3.79、5.23、3.32和4.44倍，差異達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。

2.3 赤星病脅迫對不同抗性煙草品系Rubisco、RCA基因表達(dá)水平的影響

從圖3可以看出，正常生長下，兩個品系的Rubisco、RCA基因表達(dá)水平無顯著差異。在赤星病脅迫下，CBH的rbcL、rbcS、rca相對表達(dá)量持續(xù)下降，與對照間的差異達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。脅迫9 d時，CBH的rbcL、rbcS、rca表達(dá)量分別比對照降低82.84%、70.97%及74.77%。

圖3 赤星病脅迫對不同抗性煙草品系rbcL、rbcS和rca相對表達(dá)量的影響Fig.3 Effects of brown spot stress on the relative expressions of rbcL, rbcS and rca in different resistant tobacco cultivars

與對照相比，JYH的Rubisco和RCA基因表達(dá)量在脅迫5 d時無明顯變化，此后呈增加趨勢，且與對照間存在顯著差異（P＜0.05）。在赤星病脅迫下，JYH的Rubisco、RCA基因表達(dá)水平均顯著高于CBH（P＜0.05），脅迫9 d時，JYH的rbcL、rbcS、rca表達(dá)量分別是CBH的7.48、4.69、5.82倍。

2.4 赤星病脅迫對不同抗性煙草品系Rubisco、RCA蛋白含量的影響

在赤星病脅迫下，CBH的rbcL、rbcS和rca含量明顯下降，脅迫9 d時，分別比對照低73.56%、84.74%、59.84%，均呈顯著差異（P＜0.05）（圖4）。JYH的rbcL、rbcS、rca含量在脅迫5 d時與對照間不存在顯著差異，然后上升，且顯著高于對照（P＜0.05）。在赤星病脅迫9 d時，JYH的rbcL、rbcS和rca含量分別是CBH的6.51、9.23、4.52倍，差異均達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。

圖4 赤星病脅迫對不同抗性煙草品系rbcL、rbcS和rca含量的影響Fig.4 Effects of brown spot stress on the contents of rbcL,rbcS and rca in different resistant tobacco cultivars

2.5 不同抗性煙草品系Pn和Rubisco、RCA基因表達(dá)特性的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果顯示（表2），在轉(zhuǎn)錄水平方面，Pn和rbcL、rbcS及rca相對表達(dá)量都具有極顯著正相關(guān)性（P＜0.01）。而在翻譯水平上，Pn與rbcL、rbcS、rca含量均無相關(guān)性。在翻譯后水平方面，Pn和Rubisco活化狀態(tài)、初始活性、總活性以及RCA活性存在顯著正相關(guān)性（P＜0.05）。與此同時，rca相對表達(dá)量與Rubisco初始活性及總活性存在顯著正相關(guān)性（P＜0.05），rbcL含量與rbcS含量具有顯著正相關(guān)性（P＜0.05），而rca含量和Rubisco活化狀態(tài)、初始活性、總活性則均呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。

表2 不同抗性煙草品系凈光合速率與Rubisco、RCA基因表達(dá)特性的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis betweennet photosynthetic rate andgene expression characteristics of Rubisco andRCA in different resistant tobaccocultivars under brownspot stress

3 討論

3.1 赤星病脅迫對不同抗性煙草品系光合作用的影響

光合作用是植株生長生產(chǎn)、質(zhì)量形成的生理基礎(chǔ)，主要包括光能的捕獲與轉(zhuǎn)化、電子傳遞、水光解、碳同化、光合磷酸化及同化物的轉(zhuǎn)化和運(yùn)輸?shù)纫幌盗写x過程［31］。Balachandran等［32］指出，病原菌侵染導(dǎo)致植物光合速率出現(xiàn)下降。前人研究證實，外界逆境脅迫抑制植物光合作用的原因主要分為氣孔限制、非氣孔限制兩種［33］。當(dāng)Gs、Ci同時降低時，導(dǎo)致Pn減弱的主要原因是氣孔限制因素；在Gs下降但Ci卻出現(xiàn)增加時，則顯示出非氣孔限制因素引起Pn降低［34］。在本研究，脅迫5 d時，抗病品系JYH的光合作用參數(shù)包括Pn、Gs、Ci與對照間都不存在顯著差異，顯示出此時光合作用未受到赤星病脅迫的不良影響，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗病性。而JYH的Pn、Gs及Ci在脅迫9 d均顯著降低，說明該階段的光合作用出現(xiàn)下降是由赤星病脅迫引起的氣孔限制因素造成的。這可能是因為赤星病菌能夠降低JYH葉片的Gs進(jìn)而導(dǎo)致CO2吸收量不足所致。與抗病品系JYH表現(xiàn)相反，赤星病脅迫使感病品系CBH的Pn、Gs顯著下降，但Ci卻呈上升趨勢，說明非氣孔限制因素明顯減弱光合作用，也即CBH葉肉細(xì)胞的光合能力受到抑制而造成CO2大量積累在細(xì)胞間隙內(nèi)［35］。這是由于赤星病脅迫對CBH葉片產(chǎn)生嚴(yán)重傷害，造成光合器官受損，使來自外界的CO2經(jīng)過葉片間隙直接轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)部，引起光能吸收量大幅減少，從而最終表現(xiàn)為光合作用的顯著降低。

3.2 赤星病脅迫對不同抗性煙草品系Rubisco、RCA的影響

Rubisco在卡爾文循環(huán)中對植株所吸收的CO2進(jìn)行固定、同化，其活性高低決定光合暗反應(yīng)中CO2同化能力，對植物光合作用效率發(fā)揮至關(guān)重要的作用［36］。RCA屬于一類由核基因組編碼的葉綠體蛋白，在ATP作用下，使Rubisco迅速和生理濃度的CO2（10 μmol/L）、Mg2+結(jié)合生成Rubisco-CO2-Mg2+三元復(fù)合物（ECM），從而達(dá)到最大活化程度［37］。RCA作為Rubisco的分子伴侶，主要承擔(dān)促進(jìn)及穩(wěn)定Rubisco催化活性的功能［38］。研究證實，蕪菁花葉病毒（TuMV）侵染可降低青菜的Rubisco、RCA含量，最終對光合作用造成不利影響［39］。本文研究表明，煙草赤星病對不同抗性煙草品系的Rubisco、RCA活性產(chǎn)生不同程度的抑制作用。與感病品系CBH相比，抗病品系JYH的Rubisco、RCA活性在脅迫前期均未出現(xiàn)明顯變化，此后降幅較小，顯示出JYH具有較高的CO2同化效率與光合電子傳遞效率，并且還能夠維持光反應(yīng)同化力（NADPH、ATP）的積累，從而減輕赤星病脅迫的不利影響。作為植物光合作用中固定CO2的一種關(guān)鍵酶，Rubisco活性降低是引起光合速率下降的非氣孔限制因素之一［40］。在本文中，JYH、CBH的Rubisco活化狀態(tài)、初始活性、總活性及RCA活性對煙草赤星病脅迫的響應(yīng)差異和Pn變化存在較強(qiáng)的一致性，充分表明赤星病脅迫對感病品系CBH的Rubisco、RCA活性造成嚴(yán)重影響，使CO2羧化能力減弱，導(dǎo)致Pn出現(xiàn)下降，最終表現(xiàn)為非氣孔限制因素顯著抑制光合作用［41］。這可能和赤星病脅迫造成CBH光合磷酸化受阻及ATP供應(yīng)量不足有關(guān)［42-43］。

植物對外界環(huán)境的適應(yīng)性主要通過調(diào)節(jié)自身基因表達(dá)而實現(xiàn)［44］。Rubisco、RCA活性及基因表達(dá)對光合作用均具有重要作用［45］。Rubisco大亞基基因rbcL、小亞基基因rbcS轉(zhuǎn)錄水平降低引起Rubisco活性大幅下降，最終使2個反義轉(zhuǎn)酮醇酶基因（CsTK）黃瓜幼苗的Pn明顯小于野生型［46］。RCA尤其是RCA大亞基基因RCAL也在調(diào)控逆境脅迫下水稻光合作用的適應(yīng)性中發(fā)揮重要作用［47］。本文研究結(jié)果顯示，抗病品系JYH的rbcL、rbcS、rca相對表達(dá)量在赤星病脅迫5-9 d均呈上升趨勢，表現(xiàn)為Rubisco、RCA蛋白含量增加，使RuBP對CO2的固定量得以提升，從而有利于保持較高的Rubisco羧化效率［48］。這表明JYH能夠通過調(diào)控Rubisco、RCA基因表達(dá)，以緩解煙草赤星病對光合特性的不利影響。而赤星病脅迫引起感病品系CBH的rbcL、rbcS以及rca表達(dá)量出現(xiàn)大幅下降，從而抑制Rubisco、RCA基因表達(dá)及蛋白合成，使Rubisco、RCA活性降低，最終造成葉片光合功能下降。需要指出的是，本文僅對2個抗、感煙草赤星病品系JYH、CBH的光合作用及Rubisco、RCA活性、基因表達(dá)水平和蛋白含量在赤星病脅迫下的變化進(jìn)行了研究，由于不同煙草品種（系）的赤星病抗性差異較大，因此本研究所用材料的研究結(jié)論不一定具有普適性。

4 結(jié)論

在赤星病脅迫下，感病品系CBH的Pn以及Rubisco、RCA活性與基因相對表達(dá)量均顯著下降，表明煙草赤星病對CBH光合作用的抑制效應(yīng)超出光合機(jī)構(gòu)的適應(yīng)能力，造成光合功能持續(xù)減弱；而抗病品系JYH能夠保持較高的Rubisco、RCA活性、基因表達(dá)水平及蛋白含量，其抗赤星病能力較強(qiáng)在很大程度上是由于具有較高的Pn及Rubisco、RCA活性。