宋金香，張念志

1 安徽中醫(yī)藥大學(xué) 安徽合肥 230038

2 安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 安徽合肥 230031

支氣管哮喘，簡稱哮喘，是受基因和環(huán)境影響的一種呼吸系統(tǒng)常見疾病，也是世界上最常見的慢性病之一。2015 年全球哮喘發(fā)病率為16.4%，患病人數(shù)約有3.58 億[1]。中國20 歲以上總患病率為4.2%，患病總?cè)藬?shù)超過4500 萬，由于快速變化的環(huán)境、生活方式、人口老齡化等因素，哮喘患病率正在逐漸年上升[2]。而這種慢性疾病經(jīng)過治療的癥狀控制情況，據(jù)2017年的一項(xiàng)研究表明，我國城區(qū)哮喘總體控制率僅為28.50%[3]。中醫(yī)學(xué)關(guān)于哮喘的記載從秦漢《黃帝內(nèi)經(jīng)》開始，歷朝歷代，諸多名醫(yī)從發(fā)病特點(diǎn)、病因病機(jī)及治療等方面對(duì)哮喘進(jìn)行了描述和研究，歷史悠久，療效確切，著作頗豐?，F(xiàn)代亦有諸多研究表明，以單一西藥治療作為對(duì)照，中西醫(yī)結(jié)合治療可以進(jìn)一步加快減輕癥狀，增強(qiáng)體質(zhì)、減少復(fù)發(fā)，提高患者的軀體功能、心理功能和社會(huì)功能評(píng)分和生活質(zhì)量[4]。并且通過每次復(fù)診對(duì)患者藥物的調(diào)整和了解患者用藥情況，長期持續(xù)的關(guān)注患者的病情，及時(shí)調(diào)整用藥，在減少激素等西藥藥量的同時(shí)，改善患者情緒，保證藥物治療效果，提高患者依從性大有裨益?？梢姡嗅t(yī)藥治療哮喘大有可為之處。

隨著基因芯片技術(shù)的發(fā)展，在研究疾病的分子機(jī)制、輔助疾病診斷和治療、篩選開發(fā)藥物等方面發(fā)揮重要作用。本研究借助生物信息學(xué)技術(shù)分析哮喘差異基因及免疫細(xì)胞浸潤水平，進(jìn)一步探討哮喘發(fā)病機(jī)制、治療靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物，并且借助數(shù)據(jù)庫篩選相關(guān)治療中藥，為臨床用藥提供新思路，也為中藥治療哮喘提供理論依據(jù)。

資料與方法

1 數(shù)據(jù)提取

從GEO 數(shù) 據(jù) 庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）以“asthma”為關(guān)鍵詞檢索哮喘相關(guān)的基因芯片數(shù)據(jù)集，并對(duì)數(shù)據(jù)集進(jìn)行篩選，獲得編號(hào)為GSE179156 中基因的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)集是由O’Beirne SL、 Salit J、Kaner RJ、Crystal RG 等研究者于2021 年7 月21 日上傳至GEO 數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)集包括29 個(gè)健康者樣本、57 個(gè)哮喘患者樣本，借助GPL570平臺(tái)，以芯片測序方法獲得基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)均可在線下載。

2 差異基因

GEO2R 是GEO 數(shù)據(jù)庫自帶的基于R 語言對(duì)基因芯片表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析的在線程序，可以獲得健康者和哮喘患者之間的差異基因?；赗 boxplot算法生成箱型圖，查看所選樣本的值分布，明確樣本是否適合做差異分析。獲得差異基因后，以條件P 值（P-value）＜0.05，|log2 fold change（log2 FC）|≥1 作為顯著差異基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)，log2 FC 值正數(shù)代表上調(diào)、負(fù)數(shù)代表下調(diào)，后對(duì)顯著差異基因進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，借助平臺(tái)注釋文件，即GPL570 平臺(tái)文件，匹配探針的基因名稱（gene symbol），刪除未匹配到基因名稱的探針，對(duì)匹配相同基因名稱的探針取均值處理，最終顯著差異基因結(jié)果以火山圖展示。借助基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)對(duì)顯著差異基因的表達(dá)量數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，結(jié)果以熱圖展示。

3 富集分析及核心基因

將顯著差異基因?qū)隡etascape 數(shù)據(jù)庫（https：//metascape.org/）進(jìn)行基因本體論（GO）的功能注釋富集分析，包括生物進(jìn)程（BP）、分子功能（MF）、細(xì)胞組分（CC）三個(gè)部分，以及京都基因和基因組百科全書（KEGG）的通路富集分析，以明確基因的功能及相關(guān)通路。借助STRING 數(shù)據(jù)庫（https：//cn.string-db.org/）獲得顯著差異基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，選取置信度＞0.4 的基因?qū)隒ytoscape 軟件進(jìn)行可視化，借助軟件內(nèi)置cytobubba、centisacpe 和MCODE 插件，篩選前10 位顯著差異基因作為核心基因，三個(gè)結(jié)果取并集。

4 免疫浸潤分析

CIBERSORT 是基于線性支持向量回歸原理推斷22 種免疫細(xì)胞在基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)的含量、比例。借助在線數(shù)據(jù)平臺(tái)Sangerbox（http：//sangerbox.com/）中CIBERSORT 反卷積法對(duì) GSE179156 表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析22 種免疫細(xì)胞浸潤組成分析，結(jié)果以P＜ 0.05 篩選可信樣本。使用Wilcox 檢驗(yàn)分析哮喘患者組與健康者組免疫細(xì)胞差異性。使用Pearson 相關(guān)系數(shù)計(jì)算，分析免疫細(xì)胞間相關(guān)性。結(jié)果借助Sangerbox 繪圖工具進(jìn)行可視化。

5 中藥預(yù)測

Coremine Medical 數(shù) 據(jù) 庫（https：//coremine.com/medical/）是由PubGene 公司及其合作者通過文本挖掘，進(jìn)行聚類，以網(wǎng)絡(luò)的形式表現(xiàn)各種生物醫(yī)學(xué)術(shù)語之間的關(guān)系，生物醫(yī)學(xué)術(shù)語包括疾病，包括醫(yī)學(xué)主題標(biāo)題，疾病、中藥、基因、癥狀、生物過程、分子功能、化學(xué)以及基因和蛋白質(zhì)術(shù)語等方面。通過核心基因和Coremine Medical 數(shù)據(jù)庫相互映射，以P＜0.05 為條件篩選，與核心基因相關(guān)的中藥，根據(jù)2020 年版《中華人民共和國藥典》，規(guī)范中藥名稱、功效、性味、歸經(jīng)等，對(duì)預(yù)測的中藥進(jìn)行分析。

結(jié) 果

1 顯著差異基因

對(duì)在GEO 數(shù)據(jù)庫中，對(duì)GSE179156 數(shù)據(jù)集的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行GEO2R 分析，借助箱式圖對(duì)表達(dá)譜數(shù)據(jù)初步評(píng)估，結(jié)果見圖1，可見各樣本基因表達(dá)數(shù)據(jù)的中位數(shù)、上限值、下限值差異不大，具有良好的可比性。以條件：P 值 （P-value）＜0.05，|log2 fold change（log2 FC）|≥1 獲得顯著差異基因，獲得上調(diào)基因128 個(gè)，下調(diào)基因92 個(gè)，并以火山圖和熱圖可視化，見圖2、圖3。

圖1 GSE179156 表達(dá)譜數(shù)據(jù)質(zhì)量分析圖

圖2 顯著差異基因火山圖

圖3 顯著差異基因聚類熱圖

2 差異基因富集分析

借助Metascape 數(shù)據(jù)庫對(duì)差異基因進(jìn)行富集分析，以P Value＜0.05 為閾值，獲得顯著富集排名前20的結(jié)果，如圖4 所示。富集分析結(jié)果在相關(guān)的生物進(jìn)程包括：內(nèi)肽酶活性的負(fù)調(diào)節(jié)、肽酶活性的負(fù)調(diào)節(jié)、水解酶活性的負(fù)調(diào)節(jié)、蛋白水解的負(fù)調(diào)節(jié)、內(nèi)肽酶活性的調(diào)節(jié)、肽酶活性的調(diào)節(jié)、催化活性的負(fù)調(diào)節(jié)、炎性反應(yīng)、白細(xì)胞活化、細(xì)胞活化、骨髓細(xì)胞分化的積極調(diào)節(jié)、管狀體發(fā)生、蛋白水解的調(diào)節(jié)、骨髓細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)骨髓白細(xì)胞分化、對(duì)MAPK 級(jí)聯(lián)反應(yīng)的陽性調(diào)節(jié)、生殖結(jié)構(gòu)發(fā)育、白細(xì)胞分化、單核細(xì)胞分化的積極調(diào)節(jié)、生殖系統(tǒng)發(fā)育等；參與的信號(hào)通路有造血細(xì)胞譜系、可卡因成癮、酒精中毒、唾液分泌、IL-17 信號(hào)通路、病毒蛋白與細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體的相互作用、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、阿米巴病、Ras 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、精氨酸和脯氨酸代謝等。

圖4 GO 和KEGG 富集分析（注：A：GO-BP 分析；B：GO-MF 分析；C：GO-CC 分析；D：KEGG 分析）

3 核心基因與信號(hào)通路

借助Cytoscape 軟件對(duì)顯著差異基因進(jìn)行PPI分析，首先從STRING 數(shù)據(jù)庫以combined score＞0.4為條件篩選，導(dǎo)入Cytoscape 軟件后，借助內(nèi)置工具cytobubba、centisacpe 和MCODE 模塊分析，cytohubba按照MCC 算法，選擇前10 位核心基因，結(jié)果如下：CD44、KIT、ESR1、CDH2、BDNF、AHSG、NTRK1、ITIH4、C3、GATA2；centisacpe 按照度值排序，選擇前10 位結(jié)果，如下：CD44、KIT、ESR1、BDNF、AHSG、LTF、C3、CDH2、CPA3、MUC5AC；MCODE 共篩選到6 個(gè)功能模塊，分值最高的模塊，由9 個(gè)核心基因組成，包括FETUB、ITIH4、BDNF、CDH2、GSN、AHSG、GIG25、NTRK2、C3。將三種方法所取結(jié)果取并集，共獲得核心基因17 個(gè)，其中上調(diào)基因11 個(gè)，F(xiàn)ETUB、BDNF、GSN、AHSG、NTRK2、CD44、KIT、CPA3、MUC5AC、NTRK1、GATA2，下調(diào)基因6 個(gè)，C3、ESR1、LTF、ITIH4、CDH2、GIG25。將核心基因和信號(hào)通路的關(guān)系可視化，見圖5，如圖中所示，核心基因中可能與哮喘關(guān)系更為密切的有NTRK1、NTRK2、BDNF、KIT、KIT、C3、CD44，與核心基因關(guān)系密切的通路為RAS 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路。

圖5 核心基因與KEGG 富集通路圖

4 免疫浸潤分析

在 CIBERSORT 反卷積法分析哮喘患者組與健康者組免疫細(xì)胞浸潤水平，以P＜ 0.05 篩選后，最終獲取64 個(gè)可信樣本。如圖6 所示，哮喘患者組的未活化的CD4+T 記憶性細(xì)胞（T cells CD4 memory resting）、γδT 細(xì)胞（gamma delta T cell）、未活化的肥大細(xì)胞（mast_cells_resting ）、活化的樹突狀細(xì)胞（dendritic cells activated）高于健康者組，健康者組的CD8+T 細(xì)胞（T cells CD8）、M2 巨 噬 細(xì) 胞（macrophages M2）、活化的肥大細(xì)胞（mast_cells_activated）、中性粒細(xì)胞（Neutrophils）高于哮喘患者組。各樣本具體免疫浸潤比例見圖7。左側(cè)16 個(gè)健康者樣本，右側(cè)48 個(gè)為哮喘患者樣本。對(duì)兩組免疫細(xì)胞浸潤水平進(jìn)行pearson 相關(guān)系數(shù)分析，結(jié)果見圖8。Pearson 相關(guān)系數(shù)計(jì)算發(fā)現(xiàn)活化的CD4+T 記憶性細(xì)胞（T cells CD4 memory activated）和M1 巨噬細(xì)胞（macrophages M1）有較強(qiáng)的正相關(guān)性（r=0.62），未活化的肥大細(xì)胞和活化的肥大細(xì)胞（mast cells activated）有較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)性（r=-0.69）。

圖6 哮喘患者組（A）與健康者組（NA）間的免疫浸潤差異分析差異箱線+散點(diǎn)圖

圖7 哮喘患者與健康者樣本中免疫相關(guān)細(xì)胞的浸潤組成及比例

圖8 免疫細(xì)胞間的相關(guān)性分析熱圖

5 中藥預(yù)測及分析

借助Coremine Medical 數(shù)據(jù)庫，映射核心基因相關(guān)中藥，以P 值＜0.05 作為有顯著意義，對(duì)中藥進(jìn)行篩選，通過查閱《中華人民共和國藥典》2020 年版，規(guī)范中藥名稱，歸納中藥的性味、歸經(jīng)、功效等，結(jié)果如圖9所示，可見與支氣管哮喘相關(guān)中藥多歸肝、肺、心、脾等經(jīng)，性味多選苦、甘、辛之品，寒溫均用。將核心基因與對(duì)應(yīng)的中藥導(dǎo)入Cytoscape 軟件進(jìn)行可視化，如圖7，該網(wǎng)絡(luò)圖中有199 個(gè)節(jié)點(diǎn)，284 條邊。該網(wǎng)絡(luò)圖中人參、淫羊藿、梔子、三七、山茱萸、甘草、何首烏、丹參、五味子、西洋參、水牛角、山藥、黃芩、郁金、姜黃、穿山龍、莪術(shù)等中藥的度值≥3，提示此17 味中藥可能在哮喘治療中發(fā)揮重要作用。

圖9 中藥歸經(jīng)、性味雷達(dá)圖

圖10 中藥—核心基因網(wǎng)絡(luò)圖

討 論

1 核心基因

本研究基于GEO 數(shù)據(jù)庫的GSE179156 數(shù)據(jù)集，發(fā)現(xiàn)以下基因在哮喘患者和健康者樣本中的表達(dá)具有顯著差異：FETUB、BDNF、GSN、AHSG、NTRK2、CD44、KIT、CPA3、MUC5AC、NTRK1、GATA2、C3、ESR1、LTF、ITIH4、CDH2、GIG25。目前普遍認(rèn)為哮喘發(fā)生發(fā)展與氣道慢性炎癥、氣道高反應(yīng)性、免疫失衡、氣道神經(jīng)調(diào)節(jié)失常、遺傳機(jī)制等有關(guān)。BDNF 名為腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子，在外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中各種神經(jīng)元的發(fā)育，存活和功能中起著至關(guān)重要的作用。聶穎等研究發(fā)現(xiàn)，BNDF 亦可能影響哮喘氣道炎癥的發(fā)生發(fā)展，具體可能通過上調(diào)IL-17A 的分泌，誘導(dǎo)相關(guān)炎性因子Eotaxin 的表達(dá)，使嗜酸性粒細(xì)胞活化、聚集[5]。KIT，又稱受體酪氨酸激酶、KIT 原癌基因、c-kit，可以作為 KITLG/SCF 的細(xì)胞表面受體，參與PIK3-akt、MAPK、ERK 等信號(hào)通路，激活STAT 家族，在調(diào)節(jié)細(xì)胞存活和增殖、造血、干細(xì)胞維持、配子發(fā)生、肥大細(xì)胞發(fā)育、遷移和功能以及黑色素生成方面起著至關(guān)重要的作用。陳暉等通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)抑制KIT與細(xì)胞因子的結(jié)合，可以抑制PI3K/Akt/NF-κB 的激活，以及影響MUC5AC 表達(dá)，減輕哮喘小鼠的炎癥和氣道黏液分泌[6]。CD44 是一種細(xì)胞表面受體，通過細(xì)胞外基質(zhì)成分在細(xì)胞-細(xì)胞之間作用，影響細(xì)胞粘附和遷移，參與T 淋巴細(xì)胞的激活、再循環(huán)和歸巢、造血、炎癥和對(duì)細(xì)菌感染的反應(yīng)等細(xì)胞功能，也可作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的平臺(tái)[7]。目前多認(rèn)為作為一種黏附分子，在腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中起促進(jìn)作用。有研究表明該基因在哮喘的氣道炎癥、氣道高反應(yīng)及氣道重塑過程中均發(fā)揮作用，李婷通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明在慢性哮喘致使氣道平滑肌細(xì)胞分泌透明質(zhì)酸升高，致使作為受體的CD44 升高，透明質(zhì)酸和CD44 通過ERK1/2 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)氣道平滑肌細(xì)胞的異常增殖，從而參與慢性哮喘氣道重塑過程[8]。MUC5AC 和呼吸道上皮凝膠形成的糖蛋白有關(guān)，參與哮喘氣道粘液高分泌，可導(dǎo)致哮喘急性加重，有臨床研究表明，哮喘患者觀察組誘導(dǎo)痰中MUC5AC 表達(dá)明顯高于健康對(duì)照組，并且和哮喘分級(jí)嚴(yán)重程度相關(guān)，治療后表達(dá)量明顯減低[9]。目前中藥單體或成分及中藥復(fù)方在降低哮喘患者M(jìn)UC5AC 表達(dá)量具有肯定效果[10]。

以下基因關(guān)于哮喘的研究較少，可能作為輔助診斷哮喘和評(píng)估病情的生物標(biāo)志物。FETUB（胎球蛋白B），主要由肝臟分泌一種血漿蛋白，現(xiàn)代研究認(rèn)為與代謝、心血管疾病、腫瘤、生殖等方面相關(guān)，在呼吸道疾病中，有臨床研究表明FETUB 在COPD 患者中的表達(dá)量高于對(duì)照組，通過分析可以預(yù)測COPD 急性發(fā)作，可能對(duì)疾病進(jìn)展有預(yù)測作用，通過隨訪患者的肺功能、胸部CT，F(xiàn)ETUB 可以反映肺功能或氣道受限、肺氣腫的嚴(yán)重程度[11]。C3，補(bǔ)體C3，是一種蛋白質(zhì)編碼基因，在補(bǔ)體系統(tǒng)激活引發(fā)免疫失衡中起著核心作用，主要有微生物裂解，促進(jìn)吞噬作用，引發(fā)炎癥和免疫清除。盧洪華在研究用于兒童哮喘穩(wěn)定期病情及預(yù)后評(píng)估的生物靶標(biāo)研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，C3 表達(dá)在對(duì)照組高于哮喘組，可以輔助診斷哮喘，但目前相關(guān)研究較少[12]。

自奧馬珠單抗作為哮喘的靶向藥物上市以來，諸多研究圍繞哮喘的精準(zhǔn)、個(gè)體化治療研發(fā)新藥，同時(shí)探尋諸多生物標(biāo)志物進(jìn)一步評(píng)估哮喘病情、預(yù)后等，如呼出性一氧化氮、嗜酸性粒細(xì)胞、編碼POSTN 基因編碼的骨膜蛋白、IL-4、IL-6、IL-8、IL-17、TGF-β2、TNF-α、HMGB1、Eotaxin、YKL-40 等[13]。因此，本次研究所得核心基因，可以作為哮喘治療的潛在靶標(biāo)或生物標(biāo)志物。

2 哮喘相關(guān)信號(hào)通路

差異基因借助Metascape 數(shù)據(jù)庫經(jīng)過富集分析獲得13 條相關(guān)信號(hào)通路，經(jīng)過查閱文獻(xiàn)，和哮喘密切相關(guān)的有IL-17 信號(hào)通路、Ras 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路，篩選所得核心基因多位于RAS 信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路上。RAS 信號(hào)通路的核心是RAS 蛋白，位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，它在傳遞細(xì)胞生長分化信號(hào)方面起重要作用，通過影響ERK、PI3K-AKT、Rho-Rac、JNKSAPK 等信號(hào)通路，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、存活、生長、遷移、分化或細(xì)胞骨架活力方面發(fā)揮重要作用，見圖11。有研究表明，RAS 蛋白作為生物標(biāo)志物用于癌癥診斷、評(píng)估病情、判斷預(yù)后及研發(fā)抑制劑抑制通路激活，治療癌癥[14]。手?？∥牡劝l(fā)現(xiàn)RAS 信號(hào)通路在 IL-33 誘導(dǎo)的 ILC2s 激活過敏性哮喘的氣道重塑中起重要作用，RAS 抑制劑可以改善小鼠的過敏性氣道炎癥，并且與氟替卡松聯(lián)合時(shí)，在改善嗜酸性粒細(xì)胞炎癥的同時(shí)，進(jìn)一步改善了支氣管上皮下厚度，影響過敏性哮喘的氣道重塑，可能具有治療難治性哮喘的潛力[15]。MAPK 信號(hào)通路是一個(gè)三級(jí)信號(hào)傳遞通路，通過MAPK，MAPK 激酶（MEK 或MKK）以及MAPK 激酶的激酶（MEKK 或MKKK），這三種激酶能依次激活，共同調(diào)節(jié)著細(xì)胞的生長、分化、應(yīng)激、炎性反應(yīng)等多種重要的生理、病理效應(yīng)。見圖12。MAPK 信號(hào)通路和哮喘密切相關(guān)，齊莎莎等研究發(fā)現(xiàn)，哮喘幼鼠的p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2 升高，使用p38 MAPK 通路激活劑后，上述指標(biāo)可升高，肺泡灌洗液中炎癥相關(guān)指標(biāo)IL-1β、TNF-α 升高，氣道重塑相關(guān)指標(biāo)管壁厚度/外徑、管壁面積/氣管總面積升高，兩種指標(biāo)變化與的p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2 變化一致，可見MAPK 信號(hào)通路在哮喘的氣道炎癥和氣道重塑中發(fā)揮作用[16]。

圖11 RAS 信號(hào)通路圖

圖12 MAPK 信號(hào)通路圖

3 免疫細(xì)胞浸潤分析

免疫失衡是哮喘重要的發(fā)病機(jī)制之一，大致過程為過敏原刺激后，活化樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等抗原遞呈細(xì)胞給T 淋巴細(xì)胞，引發(fā)Th1/Th2 細(xì)胞、Th17/Treg 細(xì)胞等免疫失衡。Th1/Th2 失衡表現(xiàn)為向Th2 傾斜，主要表現(xiàn)為Th2 分泌的IL-4、IL-6、IL-13 等炎性因子增多，促進(jìn)氣道炎癥、升高嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子水平、增加IgE 生成進(jìn)一步活化肥大細(xì)胞，致使其產(chǎn)生的組胺、5-羥色胺、IL-33、白三烯、前列腺素等介質(zhì)，影響哮喘的氣道炎癥和重塑[17]。Th17、Treg 細(xì)胞均來源于輔助性T 細(xì)胞，Th17/Treg 失衡表現(xiàn)為向Th17 傾斜，Th17 細(xì)胞可分泌IL-17、IL-23 等炎性因子，加重哮喘的氣道炎癥和氣道高反應(yīng)，Treg 細(xì)胞分泌具有拮抗作用的IL-10，并減少Th17 細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[18]。此次對(duì)哮喘患者和健康者免疫浸潤的分析，結(jié)果顯示γδT 細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞在哮喘患者中比例較高，有臨床研究表明相對(duì)于正常組，哮喘小鼠γδT 細(xì)胞表面的TLR3 受體表達(dá)增加，提示γδT 細(xì)胞活化增多[19]。樹突狀細(xì)胞主要促進(jìn)Th2 反應(yīng)影響哮喘的發(fā)病機(jī)制，那么能夠誘導(dǎo)免疫耐受的樹突狀細(xì)胞群定義為耐受性樹突狀細(xì)胞，可以降低輔助T 細(xì)胞激活的因子表達(dá)、促進(jìn)T 細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)eg 細(xì)胞生成、增加IL-10 水平等作用，起到治療哮喘的作用[20]。而結(jié)果所得健康者組活化的肥大細(xì)胞表達(dá)更高，可能因數(shù)據(jù)樣本量較少，存在誤差，與實(shí)際有所不同。對(duì)差異基因進(jìn)行生物進(jìn)程富集分析結(jié)果顯示，哮喘的差異基因和多種酶反應(yīng)相關(guān)，研究表明有一類肥大細(xì)胞可以分泌類胰蛋白酶、糜蛋白酶、羧肽酶和組織蛋白酶等，可以破壞氣道屏障、影響炎性因子IL-33、收縮氣管、促進(jìn)氣道重塑等作用影響哮喘發(fā)生發(fā)展[21]。在免疫細(xì)胞間相關(guān)性分析中，活化的CD4+T 記憶性細(xì)胞、M1 巨噬細(xì)胞在哮喘免疫失衡中發(fā)揮協(xié)同作用，未活化的肥大細(xì)胞、活化的肥大細(xì)胞發(fā)揮拮抗作用。

4 治療哮喘的潛在中藥

本次研究所得哮喘相關(guān)的潛在中藥，如下：人參、淫羊藿、梔子、三七、山茱萸、甘草、何首烏、丹參、五味子、西洋參、水牛角、山藥、黃芩、郁金、姜黃、穿山龍、莪術(shù)。其中人參、淫羊藿、甘草、何首烏、西洋參、山藥為補(bǔ)虛藥，梔子、黃芩、水牛角為清熱藥，丹參、郁金、姜黃、穿山龍、莪術(shù)、三七具有活血化瘀功效，山茱萸既可補(bǔ)益肝腎，又可收澀固脫，五味子斂肺固脫。哮喘治療遵循“未發(fā)以扶正氣為主，既發(fā)以攻邪氣為急”；痰又為哮喘“夙根”，用藥需兼顧化痰；哮喘多反復(fù)發(fā)作，久病必瘀，活血化瘀類藥物必不可少。因此，這17 味中藥，補(bǔ)虛者可酌情選用于哮喘緩解期扶正氣為用，活血化瘀者可選用于病程較長，反復(fù)發(fā)作，纏綿難愈，有瘀血癥見者，清熱類選用于哮喘發(fā)作熱象癥見者。導(dǎo)師張念志教授認(rèn)為哮喘反復(fù)發(fā)作，責(zé)之于“虛、痰、瘀”，虛以肺脾腎三臟為主，立定益氣活血化痰之哮喘平?jīng)_劑，在聯(lián)合布地奈德福莫特羅吸入治療時(shí)，對(duì)哮喘發(fā)作癥狀的緩解、炎癥水平的降低，效果更佳[22]。

人參為補(bǔ)氣藥，具有大補(bǔ)元?dú)?，?fù)脈固脫，補(bǔ)脾益肺，生津養(yǎng)血，安神益智的功效，其主要成分為人參皂苷，研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷可以降低哮喘炎性因子的表達(dá)，影響上皮細(xì)胞趨化因子的產(chǎn)生來緩解氣道重塑，調(diào)節(jié)Th1/Th2 免疫失衡，治療哮喘[23]。淫羊藿為補(bǔ)陽藥，具有補(bǔ)腎陽，強(qiáng)筋骨，祛風(fēng)濕功效，研究表明淫羊藿苷可以抑制嗜酸性粒細(xì)胞生成和浸潤、調(diào)節(jié)Th1/Th2 分化、降低炎性因子表達(dá)等方面改善氣道炎癥，進(jìn)一步在氣道高反應(yīng)和氣道重塑方面治療哮喘[24]。梔子為清熱藥，功效為瀉火除煩，清熱利濕，涼血解毒；外用消腫止痛，主要活性成分為梔子苷，張雨等研究發(fā)現(xiàn)，梔子苷可能通過影響NF-κB 信號(hào)通路緩解哮喘氣道炎癥，如：減少嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)、炎性細(xì)胞總數(shù)，下調(diào)Th2 細(xì)胞因子IL-4、IL-5 等炎癥因子水平，降低IgE 含量等[25]。三七屬于活血化瘀藥，功效散瘀止血，消腫定痛，主要藥理成分為三七總皂苷，趙文娟等研究發(fā)現(xiàn)三七總皂苷可以抑制哮喘小鼠炎性因子IL-17 的表達(dá)，緩解哮喘氣道炎癥；調(diào)節(jié)Th1/Th2 平衡傾向于Th1 分化，恢復(fù)免疫平衡狀態(tài)[26-27]。除此之外，活血化瘀類藥物如：川芎、銀杏葉、當(dāng)歸、丹參、地龍等亦可通過影響炎癥、免疫機(jī)制治療哮喘[28]。郁金、姜黃亦為活血止痛藥，具有活血行氣、通經(jīng)止痛的功效，姜黃素是兩種藥物共有的有效成分，具有抗炎，抗氧化，抗增殖和抗血管生成等多種作用，尹正海通過實(shí)驗(yàn)研究明確，姜黃素抑制哮喘大鼠氣道炎癥的機(jī)制可能通過調(diào)節(jié)p38MAPK/NF-κB 信號(hào)通路來抑制炎癥細(xì)胞浸潤、炎癥因子表達(dá)水平[29]。梅拉爾·卡拉曼等研究證明姜黃素不但可以抑制哮喘炎癥水平，而且對(duì)于激素導(dǎo)致的口咽部真菌感染，姜黃素可降低真菌負(fù)荷量[30]。目前亦有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)嘗試姜黃素制作納米級(jí)干粉吸入劑或者懸液改善哮喘小鼠的氣道炎癥[31]。黃芩為清熱燥濕藥，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎功效，其有效成分主要為黃芩苷、黃芩素，余保等研究表明黃芩素可以降低炎性因子水平，可能通過抑制JAK2/STAT3 信號(hào)通路減輕氣道平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移，進(jìn)而改善哮喘的氣道重塑[32]。黃芩苷為黃芩素結(jié)合葡萄糖醛酸形成的化合物，郭雪冬等研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷可能通過調(diào)節(jié)Bax/Bcl2 促進(jìn)炎性細(xì)胞凋亡，抑制MUC5AC 表達(dá)減少氣道黏液蛋白分泌，激活呼吸道苦味信號(hào)通路，進(jìn)而可能在松弛氣道平滑肌、減輕氣道炎癥、氣道粘液高分泌狀態(tài)，發(fā)揮對(duì)哮喘的治療作用[33]。并且黃芩苷對(duì)白色念珠菌有抑菌作用，具體機(jī)制可能通過降低細(xì)胞膜上Ca2+-Mg2+ATPase 活性、破壞細(xì)胞壁致使真菌凋亡，以及抑制增殖[34]。白色念珠菌感染為長期ICS 治療常見的不良反應(yīng)，由此可見，黃芩中的有效成分不但在減輕哮喘氣道炎癥和念珠菌感染均可發(fā)揮作用。穿山龍為祛風(fēng)濕藥，具有祛風(fēng)除濕，舒筋通絡(luò)，活血止痛，止咳平喘的功效，有效成分為薯蕷皂苷，可以用于合成甾體類激素，江立斌等研究發(fā)現(xiàn)薯蕷皂苷降低哮喘氣道重塑相關(guān)指標(biāo)表達(dá)，如BRP-39、PI3K、AKT 等蛋白，和糖皮質(zhì)激素療效相當(dāng)，且中西醫(yī)聯(lián)用效果更佳[35]。

通過分析哮喘基因芯片數(shù)據(jù)，獲得哮喘17 個(gè)核心差異基因與哮喘患者，與哮喘患者γδT 細(xì)胞、活化的樹突狀細(xì)胞比例增高，作為哮喘發(fā)病機(jī)制之一。其中6 個(gè)核心基因可以作為治療哮喘的潛在靶標(biāo)、生物標(biāo)志物，來進(jìn)一步研究。引發(fā)哮喘的主要信號(hào)通路有Ras 和MAPK 信號(hào)通路，多表現(xiàn)為促進(jìn)哮喘氣道炎癥和氣道重塑。預(yù)測治療哮喘的17 種中藥，主要為補(bǔ)虛、活血化瘀類藥物，藥理學(xué)研究表明可治療哮喘，故可辨證選用，作為臨床用藥新思路，但后續(xù)可以借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，明確中藥治療哮喘是否通過核心基因發(fā)揮作用。后續(xù)仍須通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，哮喘核心基因表達(dá)量變化、信號(hào)通路相關(guān)指標(biāo)變化等是否符合生信理論研究。