榮尚，吳智恒，馬文元，吳睿哲，吳潔，孫紹裘

1 湖南中醫(yī)藥大學(xué) 湖南長(zhǎng)沙 410208

2 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院 湖南長(zhǎng)沙 410005

股骨頭壞死是因各種原因引起的股骨頭血供的中斷或者破壞，從而引起股骨頭里面骨細(xì)胞和骨髓成分的破壞、死亡的一種常見(jiàn)骨科疾病。學(xué)者們提出了的一些潛在機(jī)制有骨細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化紊亂、血管生成障礙等[1]。美國(guó)，每年約有2 萬(wàn)至3 萬(wàn)名患者被診斷。目前各種治療方法中，核心減壓是治療塌陷前股骨頭壞死最常用的治療方法，可緩解骨病早期的疼痛[2]。在中國(guó)已大約有800 萬(wàn)人患有股骨頭壞死，約有10%的創(chuàng)傷性患者需要進(jìn)行人工全髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)負(fù)擔(dān)。中醫(yī)藥治療具有不良反應(yīng)小、小創(chuàng)傷、可以有效緩解患者癥狀等優(yōu)點(diǎn)，成為現(xiàn)在臨床一線(xiàn)首選方案[3]。

現(xiàn)有大量文獻(xiàn)和實(shí)驗(yàn)表明桃紅四物湯可通過(guò)誘導(dǎo)局部血管新生及新骨生成從而促進(jìn)骨損傷的修復(fù)與重建，涉及TGF-β、MAPK、Notch 等多條信號(hào)通路[4]。TGF-β 下游分子骨形態(tài)發(fā)生蛋白相關(guān)的BMP/Smad 是一條重要的誘導(dǎo)成骨形成的信號(hào)通路。但關(guān)于中醫(yī)藥在此信號(hào)通路相關(guān)研究文獻(xiàn)的報(bào)道較少。故通過(guò)BMP/Smad 信號(hào)通路探究桃紅四物湯對(duì)創(chuàng)傷性股骨頭缺血性壞死模型大鼠成骨相關(guān)因子的影響，揭示桃紅四物湯對(duì)本病的療效機(jī)制，為防治股骨頭壞死提供新的治療策略。桃紅四物湯這一經(jīng)典名方最早見(jiàn)于清代的《醫(yī)宗金鑒》，該方開(kāi)始的用途是用來(lái)治療血瘀所致的月經(jīng)先期及骨關(guān)節(jié)炎[5]。相關(guān)研究已經(jīng)證明，桃紅四物湯可有效抑制膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)軟骨中基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，并降低局部組織中白細(xì)胞介素的水平，減輕關(guān)節(jié)炎癥[6]。中醫(yī)藥治療疾病的特點(diǎn)是揣外之內(nèi)、見(jiàn)微知著。結(jié)合骨傷科特點(diǎn)，進(jìn)行先辨病再局部辨證，最后通過(guò)靈活藥物的搭配，從整體疾病的角度出發(fā)，實(shí)現(xiàn)對(duì)機(jī)體紊亂的調(diào)節(jié)[7-8]。我們嘗試通過(guò)對(duì)GO 富集分析及KEGG 通路的分析和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步研究THSWD 治療股骨頭壞死的潛在機(jī)制，并進(jìn)行初步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。為研發(fā)THSWD 的有效成分和提供更廣的應(yīng)用。

資料與方法

1 數(shù)據(jù)來(lái)源

本項(xiàng)研究中所使用的網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)及應(yīng)用軟件如下：囊括了藥物、靶標(biāo)和疾病之間的關(guān)系的中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）、人類(lèi)基因數(shù)據(jù)庫(kù)（GeneCards）、在線(xiàn)人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)系統(tǒng)（OMIM）、STRING 平臺(tái)、Cytoscape 軟件、Python3.6 編程軟件、Jamovi 2.3.13 統(tǒng)計(jì)軟件。

2 桃紅四物湯有效成分庫(kù)及靶基因庫(kù)構(gòu)建

登錄TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)，分別以“桃仁”“紅花”“熟地黃”“當(dāng)歸”“芍藥”“川芎”檢索藥物所含的有效成分，并進(jìn)行初步篩選。進(jìn)入人體的藥物要經(jīng)過(guò)吸收、分布、代謝和排泄等過(guò)程才能到達(dá)靶器官發(fā)揮藥效作用，DL、OB 是中藥有效的活性成分參與ADME 過(guò)程的關(guān)鍵參數(shù)。條件為：OB（口服生物利用度是指一種藥物在攝入后進(jìn)入體內(nèi)循環(huán)的量）＞30%，生物類(lèi)藥性（DL）＞0.18，獲取符合條件的活性成分。并通過(guò)Python 編程軟件構(gòu)建靶基因庫(kù)。

3 股骨頭壞死靶基因庫(kù)

構(gòu)建以“Osteonecrosis of the Femoral Head”為關(guān)鍵詞的基因數(shù)據(jù)庫(kù)。以“Osteonecrosis of the Femoral Head”為關(guān)鍵詞分別在 GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)、 OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索疾病基因。刪除重復(fù)性，合并所查得的有關(guān)股骨頭壞死的靶基因，篩選并構(gòu)造股骨頭壞死疾病對(duì)應(yīng)的靶基因庫(kù)。

4 交集基因庫(kù)構(gòu)建

使用 Python 編程軟件，獲得桃紅四物湯有效成分治療的靶基因與股骨頭壞死對(duì)應(yīng)的靶基因的交集基因，并繪制 Veen 圖，篩查出共同靶點(diǎn)基因。

5 藥物成分-靶基因-疾病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用Cytoscape 軟件對(duì) STRING 網(wǎng)站物種設(shè)置為“Homo sapiens 得到的結(jié)果與桃紅四物湯有效成分以及共同靶點(diǎn)基因進(jìn)行分析，構(gòu)建藥物成分-靶基因-疾病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以介數(shù)和自由度的均值作為截點(diǎn)，將截點(diǎn)之上的靶點(diǎn)作為關(guān)鍵靶點(diǎn)，并分析其藥理作用。

6 GO 功能富集分析與 KEGG 通路富集分析

將所得到的桃紅四物湯-股骨頭壞死共同靶點(diǎn)基因進(jìn)行整理格式，通過(guò)David 分析平臺(tái)進(jìn)行GO 、KEGG 分析。David 數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)基因功能注釋分析工具，可以實(shí)現(xiàn)基因功能注釋?zhuān)⑦M(jìn)行基因相關(guān)的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)分析。

7 細(xì)胞試驗(yàn)

7.1 CCK8 檢測(cè) 將大鼠BMSC 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS+1% 雙 抗 的DMEM/F-12 中 培 養(yǎng)。分3 個(gè)組處理，分別為BMSC 組、BMSC+15% 桃紅四物湯血清組、BMSC+BMP 抑制劑UK383367 組。加入含有CCK8 的培養(yǎng)基，孵育后于Bio-Tek 酶標(biāo)儀分析450nm 處吸光度（OD）值，來(lái)測(cè)定細(xì)胞活力。

7.2 Western Blot 將BMP-2（美國(guó)proteintech 公司提供抗體）、BMP-4（博奧森公司提供抗體）、Smad1（美國(guó)proteintech 公司提供抗體）、Smad5（博奧森公司提供抗體）、Smad8 （博奧森公司提供抗體）、Runx2（博奧森公司提供抗體）、Osterix（英國(guó)abcam 公司提供抗體）、β-actin（美國(guó)proteintech 公司提供抗體）等在細(xì)胞中的表達(dá)蛋白提取后，按照BCA 蛋白定量試劑盒說(shuō)明書(shū)的規(guī)范操作，測(cè)定蛋白濃度。將樣品準(zhǔn)備好后，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜及封閉。最后顯色曝光。

結(jié) 果

1 桃紅四物湯有效成分庫(kù)及靶基因庫(kù)

篩選標(biāo)準(zhǔn)為：OB 值≥30%，DL 值≥0.18；檢索TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)后共得到62 個(gè)有效成分，196 個(gè)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。為了證實(shí)THSWD 對(duì)股骨頭壞死具有良好的治療作用，我們利用不同的數(shù)據(jù)庫(kù)收集了862 個(gè)不同的股骨頭壞死靶基因和196 個(gè)THSWD 靶基因。通過(guò)對(duì)它們的交叉點(diǎn)，我們得到了65 個(gè)共同的靶基因，見(jiàn)表1，圖1。

圖1 韋恩圖

圖2 靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)

表1 桃紅四物湯有效成分

2 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

圖中節(jié)點(diǎn)為靶點(diǎn)及化合物，Degree 值越大則節(jié)點(diǎn)越大、顏色越深，表示該節(jié)點(diǎn)與其他節(jié)點(diǎn)之間的關(guān)系越緊密，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，得出桃紅四物湯治療股骨頭壞死的核心靶點(diǎn)為PTGS2 、PTGS1、TNFRSF1A、VEGFA 等。蛋白質(zhì)基因之間的相互作用來(lái)自已經(jīng)證實(shí)研究的系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫(kù)。蛋白質(zhì)共同工作，以促進(jìn)共享的功能；利用 Cytoscape3.8.軟件建立活性成分與靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)，如圖3，共有91個(gè)節(jié)點(diǎn)和181 條邊。根據(jù)Cytoscape 網(wǎng)絡(luò)圖，核心有效化合物為MOL000098 槲皮素、MOL000006 木犀草素、MOL002714 黃芩素、MOL000422 山奈酚、MOL002773β-胡蘿卜素。

圖3 KEGG 通路富集

3 GO 富集與 KEGG 信號(hào)通路富集

疾病的發(fā)生和藥物的治療是多個(gè)尺度上相互作用的動(dòng)態(tài)過(guò)程，包括DNA 損傷、基因突變、細(xì)胞周期行為、種群動(dòng)態(tài)、炎癥、代謝-免疫平衡。為了探討THSWD 對(duì)股骨頭壞死的動(dòng)態(tài)演變過(guò)程。通過(guò)微生信平臺(tái)進(jìn)行了GO 與 KEGG 信號(hào)通路富集分析如圖4-7。以P＜0.05 作為篩選條件，篩選出前 20 位的基因本體和前 30 位 KEGG 通路，p 值越小、柱狀圖顏色越紅說(shuō)明富集程度越顯著。KEGG 富集分析得到131 條通路，其中有 105 條信號(hào)通路 P-Value＜0.01，對(duì) P 值及富集顯著的前 30 條信號(hào)通路進(jìn)行分析如圖所示，結(jié)果表明富集顯著的信號(hào)通路主要有MAPK 信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路、NF-κB 信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGERAGE 信號(hào)通路等。GO 注釋結(jié)果顯示桃紅四物湯的65 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)富集顯著的前10 個(gè)生物學(xué)功能：凋亡過(guò)程、凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控、細(xì)胞增殖的正調(diào)控、基因表達(dá)的正調(diào)控、炎癥反應(yīng)、對(duì)外來(lái)刺激的反應(yīng)、血管生成、凋亡過(guò)程的正調(diào)控、對(duì)藥物的反應(yīng)、缺氧反應(yīng)；位于前10 的細(xì)胞組分：細(xì)胞質(zhì)、質(zhì)膜、外泌體 、 細(xì)胞內(nèi)膜細(xì)胞器、線(xiàn)粒體、細(xì)胞胞外區(qū)、細(xì)胞表面、 高分子復(fù)合物、粘著斑、細(xì)胞外間隙 ；位于前10 的分子功能：蛋白質(zhì)結(jié)合、相同蛋白結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性，序列特異性DNA 結(jié)合、高分子復(fù)合物結(jié)合、蛋白質(zhì)同二聚體活性、生長(zhǎng)因子活性、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、酶結(jié)合、內(nèi)肽酶活性、血紅素結(jié)合。綜上提示THSWD 可通過(guò)調(diào)控多個(gè)生物過(guò)程治療股骨頭壞死。

圖4 生物學(xué)功能GO 富集圖3 KEGG 通路富集

圖5 細(xì)胞組分GO 富集

圖6 分子功能GO 富集

4 細(xì)胞驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

4.1 細(xì)胞增殖率 大鼠BMSC 細(xì)胞活力在培養(yǎng)24h時(shí)（見(jiàn)圖7、圖10），且差異與其他2 組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明桃紅四物湯對(duì)BMSC 細(xì)胞增殖抑制率隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)呈逐漸升高趨勢(shì)。

圖7 細(xì)胞增殖率

圖8 western blot 蛋白表達(dá)

圖9 各蛋白灰度分析

圖10 CCK8 檢測(cè)

4.2 蛋白的相對(duì)表達(dá)量 BMP-2，BMP-4，Smad1，Smad5， Smad8，Runx2，Osterix 在BMSC+15%桃紅四物湯血清組中的表達(dá)量均高于BMSC 組、BMSC+BMP抑制劑UK383367 組，提示桃紅四物湯可促進(jìn)以上蛋白的表達(dá)，將曝光后的底片掃描，并用quantity one 專(zhuān)業(yè)灰度分析軟件進(jìn)行分析。并用jamovi 2.3.13 軟件進(jìn)行繪圖（見(jiàn)圖8、圖9）。給藥 48 h 后，隨著藥物濃度增加，與空白組及對(duì)照組相比，桃紅四物湯組均顯著 升 高 了BMP-2、BMP-4、Smad1、Smad5、Smad8 、Runx2、Osterix 蛋白水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示桃紅四物湯對(duì)BMSC 的增殖作用可能與上調(diào)上述蛋白水平有關(guān)。

總 結(jié)

股骨頭壞死是一種常見(jiàn)的骨科疾病，治療難度大，發(fā)病率高。股骨頭壞死病因復(fù)雜且危害嚴(yán)重，目前尚無(wú)特效藥物。如果沒(méi)有完全治愈的方法，對(duì)于年輕患者，特別是青少年，手術(shù)干預(yù)保留髖關(guān)節(jié)更合適[9]。股骨頭壞死是一種進(jìn)行性發(fā)展的骨科疾病，因此，減緩或逆轉(zhuǎn)其病變進(jìn)展是至關(guān)重要的?！端貑?wèn)·宣明五氣》云：“血?dú)獠缓停瑒t變生百病。 ”中醫(yī)治療骨痹早期以活血化瘀為主[10]。 桃紅四物湯作為活血化瘀的經(jīng)典方劑，歷來(lái)被認(rèn)為是治療骨痹的代表方。在這一方面，桃紅四物湯治療骨傷科疾病的作用越來(lái)越受到重視。桃紅四物湯是治療血瘀疾病的千古名方，但治療股骨頭壞死的作用機(jī)制尚不明確。

我們嘗試運(yùn)用構(gòu)建“成分-疾病-靶點(diǎn)”中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)初步篩選得到62 個(gè)有效化合物，65個(gè)靶點(diǎn)，根據(jù)cytoscape 互作網(wǎng)絡(luò)圖得出桃紅四物湯防治股骨頭壞死的有效成分為槲皮素、木犀草素、黃芩素、山奈酚、β-胡蘿卜素。并且其中多數(shù)化合物歸屬于桃仁、紅花此兩味藥材，這與臨床上中醫(yī)藥治療股骨頭壞死的用藥頻率一致，體現(xiàn)了活血化瘀的特點(diǎn)。

此外，拓?fù)浞治霭l(fā)現(xiàn)PTGS2、PTGS1、TNFRSF1A、VEGFA 等是關(guān)鍵靶點(diǎn)。前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶（Prostaglandin-Endoperoxide Synthases ，PTGS），又稱(chēng)環(huán)加氧酶。 PTGS 有兩種同工酶：組成型PTGS1 和誘導(dǎo)型PTGS2。PTGS 與炎癥和有絲分裂發(fā)生相關(guān)的前列腺素生物合成有關(guān)[11]。是幾種炎性前列腺素合成過(guò)程中催化限速步驟的關(guān)鍵酶，是重要的炎癥相關(guān)靶點(diǎn)，羅銘然等研究證實(shí) PTGS2 、PTGS1 通過(guò)抑制下游炎癥通路從而對(duì) MC3T3-E1 細(xì)胞成骨分化起重要的調(diào)控作用[12]。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是哺乳動(dòng)物免疫反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)和調(diào)節(jié)器。TNF 控制免疫系統(tǒng)的發(fā)育、細(xì)胞存活信號(hào)通路、增殖和調(diào)節(jié)代謝過(guò)程[13]。TNF-α 通過(guò)作為三聚體結(jié)合到55 kDa 細(xì)胞膜受體TNFR-1 或75 kDa 的細(xì)胞膜受體TNFR-2 發(fā)揮許多作用。TNF 誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑通過(guò)參與所有TNF 依賴(lài)性膜相關(guān)和細(xì)胞內(nèi)蛋白信號(hào)復(fù)合物的分子泛素化和磷酸化受到嚴(yán)格調(diào)控[14]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）是一種與血管和淋巴管生成密切相關(guān)的相關(guān)因子[15]。特別是VEGFR2 具有較強(qiáng)的酪氨酸激酶活性；VEGFR1 可刺激各種組織中炎癥反應(yīng)，并通過(guò)促血管生成、腫瘤轉(zhuǎn)移、淋巴管生成、關(guān)節(jié)炎和動(dòng)脈粥樣硬化促進(jìn)多種疾病的發(fā)生發(fā)展[15]。VEGF 系統(tǒng)對(duì)于骨髓修復(fù)重建和傷口愈合等方面也扮演著至關(guān)重要的角色[16-17]。

GO 功能注釋及 KEGG 通路富集結(jié)果表明，篩選所得關(guān)鍵靶點(diǎn)主要涉及免疫反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等一系列生物學(xué)反應(yīng)過(guò)程。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，推測(cè)桃紅四物湯治療股骨頭壞死的信號(hào)通路為MAPK 信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路、NF-κB 信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路。

在嚴(yán)重缺氧時(shí)，缺氧誘導(dǎo)因子（HIF-1）被激活，作為轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)機(jī)體的代謝和功能，以適應(yīng)缺氧情況[18]。有研究表明，缺氧通過(guò)激活HIF-1-EPO 通路導(dǎo)致EPO 水平升高，EPO 會(huì)上調(diào)EPO 通過(guò)促進(jìn)有絲分裂來(lái)促進(jìn)EPC 和ST2 的增殖，而不影響細(xì)胞凋亡。血管生成和成骨相關(guān)因子的蛋白和mRNA 水平表達(dá)量升高。從而促進(jìn)骨缺損模型的新骨形成[19]。

NF-κB 是一種調(diào)節(jié)骨形成炎癥反應(yīng)和骨重塑過(guò)程的轉(zhuǎn)錄因子。NF-κB 家族可以選擇性的結(jié)合在B細(xì)胞κ-輕鏈增強(qiáng)子上調(diào)控[20]。NF-κB 信號(hào)通路的關(guān)鍵靶點(diǎn)是IL-1R、TNF-R1、TLR4、RANK，主要參與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等過(guò)程[21]。相關(guān)證據(jù)表明，NF-κB 通過(guò)同時(shí)調(diào)節(jié)炎癥和骨重塑過(guò)程，是炎癥相關(guān)骨疾病的重要潛在治療靶點(diǎn)[22]。近年來(lái)，具有不同方法調(diào)節(jié)NF-κB 活性的新型抑制劑，以及控制釋放或骨靶向藥物傳遞策略的發(fā)展，極大地增加了NF-κB 治療在骨疾病中的應(yīng)用[23]。

白細(xì)胞介素（IL-17）是觸發(fā)炎性骨丟失的重要促炎細(xì)胞因子。IL-17 細(xì)胞因子家族由6 個(gè)成員組成，IL-17A 到IL-17F，主要由T 輔助細(xì)胞17（Th17）細(xì)胞分泌[24]。IL-17A 誘導(dǎo)TNF、IL-1β、IL-6、CXCL1、CXCL8、CXCL10、MMPs 的表達(dá)。IL-17A 在調(diào)節(jié)骨重塑中發(fā)揮重要作用。病理性骨吸收是由破骨細(xì)胞分化和/或活性增加引起的。IL-17 通過(guò)協(xié)調(diào)破骨細(xì)胞的分化和激活，對(duì)維持骨量至關(guān)重要[25]。IL-17 通過(guò)激活核因子κ-B 的RANKL 受體激活因子-骨保護(hù)素系統(tǒng)來(lái)誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的形成[26]。IL-17 還通過(guò)誘導(dǎo)IL-1 和TNF-α 的表達(dá)間接促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成，并與TNF-α 協(xié)同參與破骨細(xì)胞分化和骨吸收[27]。

TNF-α 是骨重塑的調(diào)節(jié)因子，它是病理性骨丟失的核心作用，因?yàn)樗档统晒羌?xì)胞的活性和存活，增加破骨細(xì)胞的分化、招募和活性[28]。TNF-α 在骨中的所有功能都依賴(lài)于TNFR1。TNF-α 是一個(gè)大型細(xì)胞因子家族的原型，它作為三聚體與跨膜受體結(jié)合，激活各種細(xì)胞信號(hào)通路[29]。TNF-α 也是急性或慢性炎癥以及宿主對(duì)病原體的防御的主要調(diào)節(jié)因子。TNF-α 對(duì)體外成骨形成的明顯作用是通過(guò)抑制骨形成必不可少的兩種轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)： Runx2 及其下游靶點(diǎn)Osterix 的表達(dá)來(lái)阻斷成骨細(xì)胞分化[30]。在分子水平上，TNF-α 在多個(gè)水平上阻斷Runx2 的表達(dá)。它抑制runx2 的轉(zhuǎn)錄，使其信使不穩(wěn)定，并通過(guò)上調(diào)E3 泛素連接酶Smurf1 和Smurf2 來(lái)促進(jìn)runx2 蛋白的降解。此外，TNF-α 還可以刺激NF-κB 激活，抑制TGF-β/bmp 誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞Smad 信號(hào)通路，降低Runx2 的表達(dá)。

MAPK-細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）通路是細(xì)胞表面和細(xì)胞核之間調(diào)節(jié)增殖和分化遷移以及細(xì)胞死亡的重要環(huán)節(jié)。此外，MAPK 通路在骨形成中起著關(guān)鍵作用，因?yàn)樗梢耘c所有的分子通路進(jìn)行串聯(lián)[31]。在另一項(xiàng)研究中，系統(tǒng)分析使用基因微陣列分析和生物信息學(xué)分析表明，MAPK 信號(hào)通路激活氧化鐵納米顆粒治療人類(lèi)骨源性間充質(zhì)干細(xì)胞，促進(jìn)成骨分化[32]。

如 下 圖12 所 示，TGFB 為MAPK 信 號(hào) 通 路 中的重要組成部分，是關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)之一。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）/骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）信號(hào)傳導(dǎo)參與絕大多數(shù)細(xì)胞過(guò)程，在整個(gè)生命過(guò)程中至關(guān)重要[33]。TGF-β/BMP 在哺乳動(dòng)物發(fā)育過(guò)程中的骨形成中具有廣泛的作用，并在體內(nèi)發(fā)揮著多種調(diào)節(jié)功能。TGF-β/BMPs 的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)具體通過(guò)經(jīng)典Smad 依賴(lài)途徑和非經(jīng)典Smad 獨(dú)立信號(hào)途徑（p38 絲裂原活化蛋白 激 酶 途 徑，MAPK）[34]。Runx2 和TGF-β/BMP 激活的Smad 的協(xié)同活性對(duì)骨骼的形成至關(guān)重要。BMP（骨形態(tài)發(fā)生蛋白）為T(mén)GF-β 超家族中的重要成員。BMP 通過(guò)調(diào)節(jié)一系列下游基因的活性，參與調(diào)控中胚層形成、神經(jīng)系統(tǒng)分化、牙齒和骨骼發(fā)育以及癌癥發(fā)生等生物學(xué)過(guò)程。其中的BMP-2、4 均具有較強(qiáng)的成骨能力[35]。BMP 信號(hào)的傳遞主要通過(guò)配體BMP 與細(xì)胞膜上的絲氨酸/蘇氨酸激酶受體（BMP receptor，BMPR）特異性結(jié)合，形成配體受體二元復(fù)合物[36]。與此同時(shí)BMPR2 能夠活化BMPR1，并將信號(hào)傳送給細(xì)胞內(nèi)的Smad 分子[37]。骨骼的形成也依賴(lài)于Runx2和BMP/TGF-β 激活的Smads 的協(xié)同活性。TGF-β/BMP2 信號(hào)通路、MAPK 依賴(lài)的磷酸化和Runx2 亞核靶向匯聚起來(lái)可誘導(dǎo)成骨表型[38]。Osterix 是一種屬于特異性蛋白（Sp）家族在2002 年被發(fā)現(xiàn)的鋅指轉(zhuǎn)錄因子。迄今為止，大量研究確定了Osx 在骨形成中的重要作用。如果成骨細(xì)胞特異性標(biāo)記基因不能在Osx突變胚胎中表達(dá)，則不能形成骨[39-40]。綜上故選取相關(guān)蛋白，作為桃紅四物湯治療股骨頭壞死的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。并在相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，提示桃紅四物湯有抗炎、促成骨分化，骨形成的相關(guān)作用。進(jìn)一步為臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證證據(jù)。

圖12 MAPK KEGG PATHWAY

結(jié) 論

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，組建交互網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果表明，桃紅四物湯具有多靶點(diǎn)治療股骨頭壞死的特性。此外，桃紅四物湯對(duì)除股骨頭壞死以外的疾病，如血脂異常、肝炎、腫瘤等還具有潛在的治療潛力。這說(shuō)明不同的疾病可以用相同的中藥處方來(lái)治療，符合了中醫(yī)藥的特點(diǎn)“異病同治”。綜上，體現(xiàn)了中藥復(fù)方中含有多靶點(diǎn)、藥理作用廣泛的特點(diǎn)[41-43]。本研究通過(guò)系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步確定了桃紅四物湯的促進(jìn)血液循環(huán)、抗炎、促進(jìn)骨修復(fù)的作用。未來(lái)將補(bǔ)充分子對(duì)接，進(jìn)一步闡釋相關(guān)有效成分與相關(guān)靶點(diǎn)關(guān)系。本研究建立的藥物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，為臨床治療股骨頭壞死提供了臨床依據(jù)。