吳丹，胡建平，甘椿椿

1 衢州職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院 浙江衢州 324000

2 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 黑龍江哈爾濱 150006

3 教育部北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點(diǎn)實驗室 黑龍江哈爾濱 150006

4 黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實驗室 黑龍江哈爾濱 150006

高血壓是一種常見的慢性病，也是導(dǎo)致心腦血管疾病最主要的危險因素，多發(fā)于中老年人、肥胖者與長期飲酒人群[1-2]。高血壓是指以體循環(huán)動脈血壓（收縮壓和、或舒張壓）增高（收縮壓≥140 mmHg （18.6 kPa），舒張壓≥90mmHg （12 kPa））為主要特征，同時可伴有腦、心、腎等器官的功能或器質(zhì)性損害的臨床綜合征[3-4]。歐洲高血壓學(xué)會和心臟病學(xué)會指出，利尿劑、β 受體阻斷劑、鈣拮抗劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑和血管緊張素受體阻斷劑均可作為高血壓病治療的起始及維持用藥[5]。但也存在一定的安全隱患，例如氫氯噻嗪等利尿劑，可引起低鉀血癥，血脂、尿酸代謝異常[6]；β 受體阻滯劑如美托洛爾等，可引起竇性心動過緩、支氣管哮喘等禁忌[7]；鈣拮抗劑如硝苯地平等，可引起心率增快、下肢水腫等[8]。

中藥治療高血壓類疾病具有多成分、多靶點(diǎn)、多層次、療效穩(wěn)固和安全性高等特點(diǎn)，相對于單用西藥有著較明顯的優(yōu)勢，尤其是在癥狀改善方面效果更為突出[9-10]。川牛膝是國家衛(wèi)計委公布的可用于保健食品的一味中藥，具有逐瘀通經(jīng)，通利關(guān)節(jié)，利尿通淋之功，不僅在多味中藥配伍治療高血壓疾病方面使用頻率較高，單用川牛膝也同樣具有良好的降壓效果，而且在肝氣上逆型高血壓的治療中，也同樣取得了較為滿意療效，其降壓機(jī)制與活血化瘀、引血下行的功效密切相關(guān)[11-13]。川牛膝雖然降壓效果明顯，但是仍缺乏大量的隨機(jī)樣本實驗，其降壓作用機(jī)制仍有待闡釋，同時關(guān)于川牛膝降壓的具體有效成分還有待進(jìn)一步的確認(rèn)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、生物信息學(xué)等多學(xué)科基礎(chǔ)理論與研究手段的整合，能系統(tǒng)、科學(xué)、綜合地反映藥物對疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)機(jī)制。本文擬基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)探討川牛膝治療高血壓的物質(zhì)基礎(chǔ)與分子機(jī)制，借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)揭示川牛膝的主要有效成分以及治療高血壓疾病的潛在靶點(diǎn)和作用機(jī)制（見圖1），為川牛膝的臨床應(yīng)用和深度開發(fā)提供研究基礎(chǔ)，也為發(fā)現(xiàn)藥物靶標(biāo)、指導(dǎo)中藥研發(fā)和發(fā)展中醫(yī)藥理論提供一定的科學(xué)依據(jù)。

圖1 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)的川牛膝治療高血壓作用機(jī)制研究流程

資料與方法

1 川牛膝活性成分及相關(guān)靶點(diǎn)篩選

通過查閱Pubmed 上已發(fā)表相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)合中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺TCMSP 確定中藥川牛膝的組成成分，根據(jù)藥物代謝動力學(xué)屬性值口服利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥ 0.18 篩選活性成分[14]。根據(jù)每個活性成分可獲得的對應(yīng)靶點(diǎn)蛋白，通過UniProt 數(shù)據(jù)庫（https：// www.uniprot.org）統(tǒng)一將化合物作用的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)進(jìn)行信息規(guī)范轉(zhuǎn)換。

2 高血壓疾病相關(guān)靶點(diǎn)篩選

以“Hypertension”為關(guān)鍵詞，通過在線數(shù)據(jù)庫GeneCards（https：//www.genecards.org）、OMIM（http：//www.omim.org）挖掘與高血壓治療的潛在靶點(diǎn)，再進(jìn)入DurgBank 數(shù)據(jù)庫（https：//www.DurgBank.ca）尋找治療高血壓疾病的臨床西藥作用靶點(diǎn)進(jìn)行補(bǔ)充[15]。合并3 個疾病數(shù)據(jù)庫靶點(diǎn)后，刪除重復(fù)值得到整合后的高血壓疾病靶點(diǎn)蛋白。

3 川牛膝成分-高血壓疾病靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為分析中藥川牛膝相關(guān)靶點(diǎn)與高血壓疾病靶點(diǎn)間的相互作用，將二者靶點(diǎn)基因取交集并繪制韋恩圖。將交集共同靶點(diǎn)提交至String 數(shù)據(jù)庫 （version 11.0，https：//string-db.org） 構(gòu)建蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)[16]。生物種類為“Homo sapiens”，最小互相作用閾值“Highest confidence” 設(shè)置為（＞ 0.9）得到 PPI 網(wǎng)絡(luò)，通過 CytoScape 3.7.2 中插件MCODE 對蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)一步分析，獲得潛在的蛋白質(zhì)功能模塊，并通過分析其參與的生物學(xué)進(jìn)程對其功能進(jìn)行描述。運(yùn)用Cytohubba 插件通過MCC 算法提取出前十關(guān)鍵基因并構(gòu)建關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)。

4 川牛膝成分-高血壓疾病靶點(diǎn)功能與通路的富集分析

Metascape 數(shù) 據(jù) 庫（http：//metascape.org/gp/index.html）擁有全面的注釋功能并且每月更新基因注釋的數(shù)據(jù)資料[17]。將川牛膝治療高血壓相關(guān)靶點(diǎn)輸入Metascape 平臺，分析并富集其主要的生物學(xué)過程與代謝通路。

5 川牛膝成分-高血壓疾病靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

運(yùn)用CytoScape 3.7.2 構(gòu)建川牛膝成分-高血壓靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖。利用CytoScape 3.7.2 內(nèi)置工具分析有效成分及靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，包括連接度（Degree）、緊密度（Closenesss）及介度（Betweenness）等，并根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)判斷核心靶點(diǎn)及發(fā)揮藥效的主要活性成分。

6 分子對接驗證

分析得到川牛膝活性成分-高血壓靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖中度值排名前4 的核心靶點(diǎn)，查找其PDB ID，使用在線工具（CB-Dock Web Site）將4 個靶點(diǎn)與活性成分進(jìn)行分子對接[17]，根據(jù)Docking Score 值評價靶點(diǎn)與活性化合物的結(jié)合強(qiáng)度與活性。

結(jié) 果

1 川牛膝活性成分靶點(diǎn)的獲取

根據(jù)藥物代謝動力學(xué)屬性值屬性值口服利用度（%）和類藥性篩選到川牛膝主要活性成分4 個，分別是β 艾蒿素、紅莧甾酮、β-谷甾醇和槲皮素，見表1。上述所有成分作用靶點(diǎn)共103 個，合并后刪除重復(fù)值共得到靶點(diǎn)88 個。

表1 川牛膝主要的降血壓活性成分

2 高血壓疾病相關(guān)靶點(diǎn)的獲取

分別從GeneCards、OMIM、DurgBank 數(shù)據(jù)庫中挖掘治療高血壓潛在靶點(diǎn)8435 個、67 個和312 個，整合上述3 個疾病數(shù)據(jù)庫靶點(diǎn)并刪除重復(fù)值，共得到8476個高血壓相關(guān)靶點(diǎn)。取活性成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)基因交集并繪制韋恩圖（見圖2），對81 個交集靶點(diǎn)進(jìn)行Uniprot 規(guī)范（見表2）。

表2 川牛膝活性成分與高血壓疾病交集靶點(diǎn)基因

圖2 川牛膝活性成分與高血壓疾病靶點(diǎn)基因交集

3 川牛膝成分-高血壓疾病靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將交集靶點(diǎn)基因提交至 STRING 11.0 平臺分析，將得到的數(shù)據(jù)通過Cytoscape 可視化分析得到靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)（見圖3）。

圖3 川牛膝活性成分與高血壓疾病差異基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

PPI 網(wǎng)絡(luò)中蛋白的作用是相互的。PPI 復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中存在部分密度較高的區(qū)域稱為 Community 或 Module，Module 網(wǎng)絡(luò)是PPI 網(wǎng)絡(luò)的潛在子網(wǎng)，其在區(qū)域部分連線少，連線密度較高，因此 Module 被認(rèn)為是具有生物學(xué)意義的集合，該集合有2 種含義，一為蛋白質(zhì)復(fù)合體，即多個蛋白質(zhì)共同組成復(fù)合體而后發(fā)揮生物學(xué)作用；二為功能模塊，如位于同一通路的蛋白質(zhì)，其相互作用更加密切。為更精確地分析川牛膝治療血脂異常的作用機(jī)制，運(yùn)用 Cytoscape3.7.2 中的MCODE插件，通過分子復(fù)合物檢測算法對相互作用關(guān)系進(jìn)行分析，得到 Module（圖4）。根據(jù)P 值，分別保留Module 中最佳評分的生物學(xué)進(jìn)程對其進(jìn)行功能描述（見表3）。并且運(yùn)用Cytohubba 插件的MCC 算法提取出前十關(guān)鍵基因（見表4），構(gòu)建關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行觀察（見圖5）。

表3 川牛膝與高血壓疾病差異靶點(diǎn)PPI 提取模塊功能描述

表4 采用Cytohubba 插件MCC 算法提取的Hub 前十靶點(diǎn)基因

圖4 MCODE 提取川牛膝成分-高血壓疾病靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)中的MCODE 得分

圖5 使用Cytohubba 插件提取的Hub 前十靶點(diǎn)關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)

4 靶點(diǎn)功能與通路的富集分析

運(yùn)用Metascape 平臺對川牛膝治療高血壓進(jìn)行功能與通路分析，由結(jié)果可見多個靶點(diǎn)的功能與高血壓的調(diào)治關(guān)系密切，川牛膝治療高血壓主要參與的生物學(xué)過程見圖6 A，包括細(xì)胞對激素刺激的反應(yīng)（Cellular response to hormone stimulus）、細(xì)胞對有機(jī)環(huán)狀化合物的反應(yīng)（Cellular response to organic cyclic compound）、對類固醇激素的反應(yīng)（Response to steroid hormone）、對有毒物質(zhì)的反應(yīng)（Response to toxic substance）、對異源生物刺激的反應(yīng)（Response to xenobiotic stimulus）等，參與的通路見圖6D，主要有Pathways in cancer、Hepatitis B、Fluid shear stress and atherosclerosis 等，前十通路富集結(jié)果見表5，相關(guān)靶點(diǎn)調(diào)節(jié)高血壓的功能見圖6B，主要富集于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（Transcription factor binding）、近端啟動子序列特異性DNA 結(jié)合（Proximal promoter sequence-specific DNA binding）等。

表5 川牛膝治療高血壓靶點(diǎn)top10 通路富集結(jié)果

圖6 潛在靶點(diǎn)的GO 富集分析

5 川牛膝成分-高血壓疾病靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

運(yùn)用CytoScape 3.7.2 川牛膝成分-高血壓疾病靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖，見圖7。利用內(nèi)置工具分析有效成分及靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，分析結(jié)果表明槲皮素連接度為70，介度為 0.66097，緊密度為0.70833。其次為β-谷甾醇（連接度為16，介度為0.10679，緊密度為0.40157）、β 艾蒿素（連接度為7，介度為0.00807，緊密度為0.35172）以及紅莧甾酮（連接度為1，介度為0，緊密度為1.00000），見表6。預(yù)測槲皮素為川牛膝治療高血壓的核心活性成分。

表6 川牛膝主要活性成分網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)特征參數(shù)

表7 根據(jù)Degree 值排名前十的關(guān)鍵基因

圖7 川牛膝成分-高血壓疾病與成分差異基因- 通路互作網(wǎng)絡(luò)

6 分子對接驗證

CB-Dock 在線工具對接是一種蛋白質(zhì)-配體對接方法，可自動識別結(jié)合位點(diǎn)，計算中心和大小，根據(jù)查詢配體自定義對接盒大小，然后與AutoDock Vina進(jìn)行分子對接；CB-Dock 通過使用基于曲率的空腔檢測方法預(yù)測目標(biāo)蛋白的結(jié)合位點(diǎn)和使用AutoDock Vina 來查詢配體的結(jié)合姿勢，可以促進(jìn)對接過程并提高準(zhǔn)確性。Docking Score＞4.25 時表示活性成分與靶點(diǎn)間存在結(jié)合能力，＞5.0 時表示結(jié)合活性較佳，＞7.0 時表示結(jié)合活性極佳[17]。分子對接所得結(jié)果顯示活性成分與靶點(diǎn)蛋白對接全部Docking Score ≥ 7（100%），最低為7.2，最高為9，說明川牛膝治療高血壓的四種活性成分β 艾蒿素、紅莧甾酮、β-谷甾醇和槲皮素與 4 個靶點(diǎn)的結(jié)合活性較強(qiáng)。評分與分子對接結(jié)果分別見表8 和圖8。

表8 川牛膝降血壓活性成分與靶點(diǎn)蛋白的對接評分

討 論

高血壓是一種常見的、同時伴隨著心腦血管病等發(fā)生的危險慢性疾病。中醫(yī)辨證角度認(rèn)為，肝陽上亢、肝腎陰虛、陰虛陽亢是高血壓病的主要證候，在中醫(yī)臨床中多采用平肝潛陽、滋陰降火、祛痰化濕等治療方法[20-21]。目前關(guān)于中醫(yī)藥治療高壓病的研究較多，中藥降壓不僅不良反應(yīng)小，價格低廉，而且具有多成分、多靶點(diǎn)和多層次的作用特點(diǎn)。尋求有效的中醫(yī)藥治療途徑，對發(fā)揮中醫(yī)藥的整體調(diào)節(jié)優(yōu)勢有著十分重要的意義。川牛膝在多味用于治療高血壓疾病的中藥中，如通過與其他中藥進(jìn)行配伍用于治療高血壓的一些常見證，如氣虛、陰虛、肝風(fēng)癥以及陽亢癥等使用的頻率非常高且效果較好。故在中醫(yī)臨床上主要以川牛膝作為君藥，根據(jù)患者的癥狀進(jìn)行增減，用以改善患者的血流平衡、調(diào)整氣血，進(jìn)而對高血壓進(jìn)行治療[22]。

本研究通過分子對接和網(wǎng)絡(luò)分析構(gòu)建復(fù)合目標(biāo)網(wǎng)絡(luò)。預(yù)測了川牛膝作為治療高血壓疾病活性成分出化合物為β 艾蒿素、紅莧甾酮、β-谷甾醇和槲皮素，其中槲皮素為川牛膝降壓的核心活性成分，闡明了川牛膝通過調(diào)節(jié)EGFR、ESR1、FOS、CCND1 等核心靶點(diǎn)干預(yù)高血壓疾病的相互關(guān)系。有研究表明表皮生長因子受體（EGFR）參與原發(fā)性高血壓[23]、肺動脈高壓[24]的調(diào)節(jié)；雌激素受體（ESR1）與妊娠高血壓密切聯(lián)系[25]，在心血管疾病中起著重要的生理作用；核蛋白轉(zhuǎn)錄因子（FOS）參與高血壓的調(diào)節(jié)，持續(xù)性高血壓會誘導(dǎo)FOS 蛋白的表達(dá)增高[26]，而鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶可通過降低FOS 蛋白的表達(dá)來減弱高血壓；細(xì)胞周期蛋白（CCND1）被證明參與了肺動脈高壓的發(fā)病機(jī)制[27]，對抗CCND1 可以改善大鼠的肺血管重塑，說明其可能是治療肺血管重塑和肺動脈高壓的潛在靶點(diǎn)[28]，由以上可知篩選出的核心靶點(diǎn)基因與高血壓疾病均具有一定的關(guān)聯(lián)性。

KEGG 與GO 分析川牛膝治療高血壓的生物學(xué)通路主要集中于流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化通路和糖尿病并發(fā)癥晚期糖基化終末產(chǎn)物及其受體信號通路等，其功能主要為通過質(zhì)膜細(xì)胞粘附分子進(jìn)行的嗜異性細(xì)胞間粘附等[29，30]。分子對接結(jié)果顯示川牛膝的降血壓活性成分與靶點(diǎn)的結(jié)合能力很強(qiáng)，分子對接評分均不小于7?；谏镄畔W(xué)分析和計算機(jī)模擬技術(shù)，我們分析了川牛膝對高血壓的活性物質(zhì)和可能的分子機(jī)制，為后續(xù)實驗研究提供了重要的理論基礎(chǔ)。然而，本次網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中的分子對接結(jié)果僅提供了化學(xué)物質(zhì)與相應(yīng)靶基因之間的不確定聯(lián)系，與靶基因之間的精確作用模式如激活或抑制仍需要深入探討。后續(xù)，應(yīng)對篩選后的潛在有效化合物進(jìn)行實驗驗證，以深入闡明基于理論預(yù)測的藥物與蛋白質(zhì)之間的相互作用。