李春雨,屈建航,周 佳,趙 帥,羅 宇

河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院,河南 鄭州 450001

微生物胞外多糖(exopolysaccharides,EPS)是微生物在生長代謝過程中產(chǎn)生的對(duì)其本身有保護(hù)作用的生物高聚物,具有獲取成本較低、制備方法簡便、天然、無毒、可生物降解等優(yōu)點(diǎn)。近年來,大量研究表明微生物EPS具有乳化、絮凝、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗炎和降血糖等多種活性[1],在醫(yī)藥、食品、化工等領(lǐng)域具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。

微生物EPS具有較好的抗氧化能力,能減輕自由基等對(duì)機(jī)體造成的氧化損傷。臧文晶等[2]發(fā)現(xiàn)腸膜明串珠菌LeuconostocmesenteroidesHDE1的胞外多糖具有較高的抗氧化活性并與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。喬少婷等[3]報(bào)道嗜熱鏈球菌StreptococcusthermophilusMGB80-7胞外多糖質(zhì)量濃度為0～1 mg/mL時(shí),EPS對(duì)超氧陰離子的清除能力優(yōu)于陽性對(duì)照(Vc)。劉哲[4]發(fā)現(xiàn)兩種微藻胞外多糖分別與殼聚糖復(fù)配后用于圣女果保鮮,比單一使用殼聚糖分別增加了4、6 d的貨架期。Yuan等[5]在研究中發(fā)現(xiàn)強(qiáng)雄腐霉胞外多糖PEPS-2具有較好的體外抗氧化能力,可顯著提高草莓采后的生理品質(zhì),有效延緩草莓腐爛、延長貨架期。

抗氧化劑能有效防止或延緩氧化,但人工合成抗氧化劑往往毒副作用較大、應(yīng)用范圍窄,因此尋找新型抗氧化劑成為當(dāng)前的研究趨勢。微生物胞外多糖有望成為天然抗氧化劑開發(fā)的重要對(duì)象,在食品、醫(yī)藥等行業(yè)備受國內(nèi)外研究者的關(guān)注。作者對(duì)紅桿菌RufibacterhautaeNBS58-1的胞外多糖進(jìn)行提取純化,分析其單糖組成和分子量,并對(duì)抗氧化活性及應(yīng)用進(jìn)行探究,為微生物胞外多糖的菌物資源開發(fā)及其相關(guān)應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：RufibacterhautaeNBS58-1,為河南工業(yè)大學(xué)環(huán)境微生物技術(shù)團(tuán)隊(duì)自太湖淤泥中分離篩選和鑒定[6]。

R2A培養(yǎng)基[6]：葡萄糖0.5 g/L、酵母浸粉0.5 g/L、酸水解酪蛋白0.5 g/L、胰蛋白胨0.5 g/L、可溶性淀粉0.5 g/L、K2HPO4·3H2O 0.3 g/L、MgSO4·7H2O 0.05 g/L、丙酮酸鈉0.3 g/L,pH 7.0。固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉15 g/L,115 ℃滅菌30 min。

產(chǎn)糖培養(yǎng)基[7]：經(jīng)優(yōu)化后的產(chǎn)糖培養(yǎng)基成分為蔗糖14.13 g/L、酵母浸粉1 g/L、可溶性淀粉0.5 g/L、K2HPO4·3H2O 0.3 g/L、MgSO4·7H2O 0.05 g/L、丙酮酸鈉0.3 g/L、pH 7.5,115 ℃滅菌30 min。

草莓：從當(dāng)?shù)厮匈徺I大小、形狀和成熟度相似且無視覺缺陷的新鮮草莓。

1.2 試劑與儀器

蔗糖、酵母浸粉、可溶性淀粉、丙酮酸鈉、無水乙醇、瓊脂粉、正丁醇、三氯化鐵：分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;抗壞血酸：分析純,北京奧博星生物技術(shù)有限公司;三氟乙酸、磷酸、DPPH、ABTS、鐵氰化鉀：生工生物工程(上海)有限公司;硫代巴比妥酸、1,10-菲羅啉：北京索萊寶科技有限公司;氯仿：鄭州軒之成化工科技有限公司。

TGL-16G高速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鄭州長城科貿(mào)有限公司;UV-2450紫外可見分光光度計(jì)、LC-20AD高效液相色譜儀、LC20AT高效液相色譜泵、RID-20示差折光檢測器：日本Shimadzu(島津)公司;酶標(biāo)儀：美國Bio Tek公司;WYT手持式折射儀：成都豪創(chuàng)光電儀器有限公司;Sepharose CL-6B 柱：上海聯(lián)碩生物科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌株培養(yǎng)

將-80 ℃存放的菌種于R2A固體培養(yǎng)基上進(jìn)行活化。挑取NBS58-1新鮮菌落,接種至R2A液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)(28 ℃,150 r/min)58 h作為種子液,將種子液以5%(V/V)的接種量接至產(chǎn)糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)(23 ℃,150 r/min)2 d進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)糖。

1.3.2 胞外多糖的提取純化

胞外多糖的提取純化方法參照Wang等[8]的方法并稍加修改。發(fā)酵液10 000 r/min離心10 min,取上清液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(55 ℃,0.1 MPa)濃縮至原體積的1/5。加入Sevag試劑(V(氯仿)∶V(正丁醇)=4∶1)對(duì)濃縮液除蛋白,之后加入4倍體積無水乙醇,沉淀冷凍干燥得到粗多糖。蒸餾水溶解粗多糖,在蒸餾水中透析2 d,透析后的溶液使用0.22 μm濾膜過濾,經(jīng)Sepharose CL-6B 柱(2.5 cm×60 cm)純化,收集餾分再次醇沉,凍干得到該菌的胞外多糖,命名為EPS-1。

1.3.3 胞外多糖單糖組成測定

以甘露糖、核糖、鼠李糖等制作混合標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照溶液,衍生后經(jīng)檢測繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用三氟乙酸(2 mol/L)將樣品酸解(120 ℃,4 h),所得酸解產(chǎn)物經(jīng)NaOH、PMP-甲醇衍生后,利用高效液相色譜測定并結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間得到EPS-1單糖組成。

1.3.4 胞外多糖分子量測定

采用水相凝膠滲透色譜(Gel permeation chromatography,GPC)測定純化后EPS-1的分子量,流動(dòng)相為0.1 mol/L NaNO3和0.05% NaN3,流速為0.6 mL/min,進(jìn)樣量為20 μL。

1.3.5 胞外多糖體外抗氧化活性檢測

(1)參照Hu等[9]使用的方法測定EPS-1對(duì)羥基自由基的清除率,羥基自由基清除率=(D0-D1+D2)/D0×100%,其中,D1為加入EPS-1反應(yīng)的吸光度,D0為用蒸餾水替代EPS-1的反應(yīng)結(jié)果,D2為用蒸餾水替代H2O2的結(jié)果。同時(shí),以抗壞血酸(Vc)作為陽性對(duì)照。

(2)參照Wang等[10]使用的方法測定EPS-1對(duì)ABTS自由基的清除率,ABTS清除率=(D0-D1+D2)/D0×100%。

(3)參照Tang等[11]使用的方法測定EPS-1對(duì)DPPH自由基的清除率,DPPH清除率=(D0-D1+D2)/D0×100%。

(4)參照Chen等[12]的方法測定EPS-1的總還原力。

1.3.6 胞外多糖在草莓保鮮中的應(yīng)用

使用75%乙醇先對(duì)草莓表面進(jìn)行噴霧消毒處理,自然風(fēng)干后將所有草莓分為兩組：A組在8% EPS-1溶液中浸泡5 min,風(fēng)干,然后室溫放置7 d;B組作為對(duì)照組,將草莓浸泡在超純水中,并與A組以相同的方式操作。

(1)采用Martínez等[13]使用的方法檢測草莓果實(shí)的質(zhì)量損失率。每24 h測定1次草莓的質(zhì)量,計(jì)算草莓質(zhì)量損失率。質(zhì)量損失率=(m1-m2)/m1×100%,其中,m1為樣品初始質(zhì)量,g;m2為儲(chǔ)存后樣品質(zhì)量,g。

(2)采用手持式折射儀WYT測定草莓中可溶性固形物含量(SSC)并以百分比表示。

(3)參照J(rèn)iang等[14]使用的方法測定草莓中MDA(丙二醛)含量。將1 g草莓樣品和5 mL預(yù)冷的5%三氯乙酸放置冰上研磨,研磨液于4 ℃離心15 min(10 000 r/min)。將2 mL上清液與2 mL 0.67%的硫代巴比妥酸混合,100 ℃水浴20 min后迅速冰浴5 min,4 ℃離心15 min(10 000 r/min)后分別測定上清液在450、532、600 nm處的吸光度。MDA含量=6.45×(D(532)-D(600))-0.56×D(450)。

(4)采用袁志香[15]使用的方法繪制抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)曲線并測定草莓中抗壞血酸含量。同1.3.6中(3)的方法研磨草莓并離心后,向上清液中加入5% 三氯乙酸、無水乙醇、0.4%磷酸、0.5% 1,10-菲羅啉和0.03%三氯化鐵溶液各1 mL,混合均勻后在30 ℃反應(yīng)1 h并記錄在510 nm處的吸光度,對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算VC含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行,結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。使用Excel 2019分析數(shù)據(jù)、SPSS 26分析差異顯著性、Origin 2021b制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單糖組成與分子量分析

如圖1所示,該多糖由葡萄糖、甘露糖、核糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖醛酸、鼠李糖、巖藻糖和葡萄糖醛酸組成,摩爾比為80.33∶11∶2.84∶2.74∶1.79∶0.61∶0.26∶0.17∶0.15∶0.1。GPC檢測結(jié)果顯示EPS-1分子量為4 652。

圖1 胞外多糖EPS-1高效液相色譜圖Fig.1 HPLC spectrum of exopolysaccharide EPS-1

2.2 胞外多糖抗氧化活性分析

EPS-1對(duì)ABTS自由基的清除能力如圖2(a)所示,在0～5 mg/mL范圍內(nèi),其清除率隨著質(zhì)量濃度的增加顯著增大,但在同一質(zhì)量濃度下,EPS-1的清除率均顯著低于陽性對(duì)照Vc。EPS-1質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)對(duì)ABTS自由基的清除率達(dá)到(81.48±2.09)%,與發(fā)酵乳桿菌CECT 5716 EPS(8 mg/mL)的清除率(35.37±1.24)%相比,具有一定優(yōu)勢[16]。

DPPH是一種很穩(wěn)定的自由基,EPS可提供電子或氫將DPPH自由基還原為非自由基形式(DPPH-H),從而發(fā)揮抗氧化作用[17]。如圖2(b)所示,EPS-1、Vc對(duì)DPPH自由基的清除能力均與質(zhì)量濃度呈正相關(guān),在質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí),清除率分別為(41.47±0.37)%、100%,說明此濃度范圍內(nèi)EPS-1對(duì)DPPH的清除能力有限,在實(shí)際應(yīng)用中可考慮增加其使用濃度以提高清除率。

羥基自由基很容易穿過細(xì)胞膜,形成斷裂的DNA鏈,并具有引發(fā)癌癥、突變和細(xì)胞毒性的能力,是生物系統(tǒng)中最活躍的自由基[18]。如圖2(c)所示,EPS-1與Vc均表現(xiàn)出羥基自由基清除活性,且呈劑量依賴。EPS-1質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)對(duì)羥基自由基的清除率達(dá)到(91.59±0.73)%,此時(shí)的清除率仍顯著低于Vc,但高于丁濤等[19]報(bào)道的乳酸芽孢桿菌胞外多糖的清除率,表明EPS-1在羥自由基清除方面具有一定的優(yōu)勢。

總還原力是評(píng)價(jià)樣品抗氧化活性的重要指標(biāo),具有還原力的物質(zhì)可以提供氫原子來阻斷過氧化物的形成,進(jìn)而破壞自由基反應(yīng)鏈,展現(xiàn)抗氧化能力[2]。如圖2(d)所示,在0～5 mg/mL范圍內(nèi),EPS-1的總還原力隨著質(zhì)量濃度的增大而增大,5 mg/mL時(shí)的D(700)為0.29,表明EPS-1具有一定的還原能力。

方偉等[16]報(bào)道的發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentium)CECT 5716的EPS在質(zhì)量濃度為8 mg/mL時(shí),對(duì)DPPH和ABTS自由基的清除率分別為(84.17±1.30)%和(35.37±1.24)%。王琪[20]從羅漢果內(nèi)生菌篩選出產(chǎn)胞外多糖菌株,命名為Bacillussp.LHG-3,所產(chǎn)EPS-A(10 mg/mL)和EPS-B(10 mg/mL)對(duì)羥基自由基的清除率分別為(70.12±1.12)%和(68.51±0.58)%,對(duì)DPPH自由基的清除率分別為(60.57±0.43)%和(65.72±0.24)%,對(duì)ABTS自由基的清除率分別為(78.67±0.16)%和(80.51±0.15)%。鄺嘉華等[21]研究解淀粉芽孢桿菌DMBA-K4所產(chǎn)EPS的抗氧化活性,當(dāng)EPS質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí),對(duì)DPPH自由基清除率高達(dá)78.60%,對(duì)羥基自由基清除率為75.47%,表明該EPS具有較強(qiáng)的抗氧化活性。本研究中RufibacterhautaeNBS58-1的胞外多糖EPS-1在質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)對(duì)ABTS、DPPH和羥基自由基的清除率分別為(81.48±2.09)%、(41.47±0.37)%和(91.59±0.73)%。相比較之下,R.hautaeNBS58-1 EPS-1能更有效清除羥基、ABTS和DPPH自由基。

2.3 草莓質(zhì)量損失率分析

草莓的質(zhì)量損失率是反映草莓儲(chǔ)藏過程中呼吸速率和水分蒸發(fā)的重要參數(shù)。如圖3所示,EPS組和對(duì)照組草莓果實(shí)質(zhì)量損失率隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的增加均不斷增大,同一時(shí)期,二者質(zhì)量損失率差異均不顯著,但EPS組的質(zhì)量損失率均小于對(duì)照組。存放7 d時(shí),對(duì)照組的質(zhì)量損失率為(59.41±3.02)%,而EPS處理組的質(zhì)量損失率為(55.58±0.89)%,說明經(jīng)EPS-1處理后能在一定程度上減少草莓水分的蒸發(fā),降低草莓的質(zhì)量損失率。

圖3 草莓果實(shí)質(zhì)量損失率Fig.3 Mass loss rate of strawberry fruit

2.4 SSC含量分析

水果中的可溶性固形物主要是糖和有機(jī)酸,測定SSC含量可以反映果實(shí)中營養(yǎng)物質(zhì)的保留情況[22]?？扇苄怨绦挝锖康鸵馕吨麑?shí)甜度會(huì)隨之降低[23]。兩組草莓果實(shí)中SSC含量變化如圖4所示,0～7 d,二者SSC含量均呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢,可能是因?yàn)椴葺即x過程中碳水化合物轉(zhuǎn)化為糖和其他可溶性化合物,從而使SSC含量增加;之后呼吸過程中又快速消耗SSC,導(dǎo)致其含量下降[14]。在第2天時(shí),EPS組和對(duì)照組草莓中SSC含量達(dá)到最大且兩組間差異不顯著,分別為(9.17±0.12)%和(8.93±0.15)%,第2天后,SSC含量開始下降。儲(chǔ)藏7 d,EPS組SSC含量為(7.03±0.12)%,顯著高于對(duì)照組SSC含量(6.27±0.21)%。表明EPS-1的使用減少草莓呼吸過程中對(duì)SSC的消耗,更有利于保持可溶性固形物含量、維持草莓的品質(zhì)和風(fēng)味,從而提高草莓的儲(chǔ)藏保鮮效果。

圖4 草莓果實(shí)中SSC含量變化Fig.4 Change of SSC content in strawberry fruit

2.5 MDA含量分析

MDA是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一,它的產(chǎn)生會(huì)加劇膜的損傷,測定MDA的含量可了解草莓膜脂過氧化的程度[24]。如圖5所示,隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的增加,MDA的含量也隨之增加,2～7 d,對(duì)照組MDA含量均顯著高于EPS組,在第7天時(shí),EPS組和對(duì)照組的MDA含量分別達(dá)到4.07 μmol/L和4.39 μmol/L。可能是EPS-1涂層限制水果組織中的氧氣供應(yīng),從而減少脂質(zhì)過氧化,還可作為抗氧化劑,減少草莓組織中的氧化應(yīng)激[25]。結(jié)果表明,EPS-1可有效降低MDA含量,減緩草莓氧化損傷程度。

圖5 草莓果實(shí)中MDA含量變化Fig.5 Change of MDA content in strawberry fruit

2.6 Vc含量分析

抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：Y=0.021 3X+0.116(R2=0.997 2)?？箟难嵩谒w內(nèi)主要起清除自由基和延緩細(xì)胞衰老的作用[26],如圖6所示,不同處理后草莓果實(shí)中Vc含量先升后降,EPS組在第2天時(shí)Vc含量達(dá)到最大,為(35.6±0.43) μg/g,對(duì)照組在第1天時(shí)Vc含量達(dá)到最大,為(33.56±0.58) μg/g。第6天后,兩組草莓中的Vc含量開始顯著下降,在第7天時(shí),EPS組Vc含量下降到(23.63±0.67) μg/g,但仍顯著高于對(duì)照組(P<0.05),表明EPS-1可以減緩Vc氧化的速率,延長草莓果實(shí)的存放時(shí)間。

圖6 草莓果實(shí)中Vc含量變化Fig.6 Variation of Vc content in strawberry fruit

3 結(jié)論

本研究從RufibacterhautaeNBS58-1發(fā)酵液中分離純化得到胞外多糖EPS-1,為一種主要含葡萄糖和甘露糖的小分子量雜多糖,能有效清除羥基、ABTS和DPPH自由基,其中對(duì)羥基自由基清除效果最好,并具有良好的還原能力。草莓經(jīng)EPS-1涂膜后,能顯著降低果實(shí)的MDA含量,延緩可溶性固形物的降解和Vc的氧化,有利于提升采摘后草莓的質(zhì)量,延長草莓貨架期。EPS-1展現(xiàn)出較好的抗氧化活性,后續(xù)需進(jìn)一步對(duì)EPS-1的結(jié)構(gòu)進(jìn)行深度的解析,并探究抗氧化活性與結(jié)構(gòu)的構(gòu)效關(guān)系,以進(jìn)一步明確其應(yīng)用潛力。