黃柳娟 樊彥莉 鐘 海 蔣 靜 邵 毅

(1. 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所,上海 201403;2. 上海海關(guān)動植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心,上海 200135;3. 上海海關(guān),上海 200135)

養(yǎng)殖業(yè)抗生素的濫用導(dǎo)致農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成為抗生素耐藥菌(Antimicrobial risistant bacteria, ART)的一大來源[1],農(nóng)業(yè)源ART菌可能通過食物鏈傳播至人類[2]。水平基因遷移(Horizontal gene transfer, HGT)是耐藥基因在各類細(xì)菌中擴(kuò)散的重要方式[3],但相較于致病菌,數(shù)量龐大、遺傳背景豐富、可能更頻繁地參與HGT的非致病菌的耐藥性尚未受到系統(tǒng)監(jiān)測和研究[4]。其中標(biāo)準(zhǔn)化、批量化培養(yǎng)、分離ART菌技術(shù)的缺乏,是制約非致病菌耐藥性研究的瓶頸問題之一。

活細(xì)菌的分離檢測對于細(xì)菌種類的進(jìn)一步表征至關(guān)重要[5]。培養(yǎng)基類型和成分濃度[6]會影響可培養(yǎng)細(xì)菌群落構(gòu)成[7]和單類細(xì)菌的生長速率[8],以及對抗生素的耐受性[9-10]。針對未知耐藥細(xì)菌群落的初步篩查或耐藥基因的遷移研究,科研人員使用腦心浸液肉湯(BHI)[11-12]、麥康凱瓊脂[13]、胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)[14]、LB[15]、平板計(jì)數(shù)瓊脂(PCA)[16]等培養(yǎng)基,但這些培養(yǎng)基對不同基質(zhì)中的不同ART菌的培養(yǎng)效果并未得到評估。

培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)的豐富度對可培養(yǎng)細(xì)菌的種類和數(shù)量的影響尚無定論[17],鑒于BHI、TSA和PCA培養(yǎng)基對細(xì)菌培養(yǎng)的普適性或在標(biāo)準(zhǔn)化操作中的廣泛應(yīng)用[18-19],研究擬以這3種培養(yǎng)基為例,基于高通量測序技術(shù),分析在不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)獲得的冷鮮雞和雞肉熟食表面四環(huán)素耐藥(Tetracycline resistant,Tr)菌和磺胺耐藥(Sulfamethoxazole resistant,Sr)菌的菌群結(jié)構(gòu)和菌屬豐度,為評估培養(yǎng)基對不同基質(zhì)上不同ART菌的培養(yǎng)效果提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

4份冷鮮雞產(chǎn)品(整雞、雞胸肉、雞腿肉和雞翅,編號分別為F1、F2、F3和F4)和 3份散裝雞肉熟食制品(白斬雞、鹽水雞和烤雞,編號分別為R1、R2和R3):無菌袋包裝后置于冰袋中,3 h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室,市售;

PCA培養(yǎng)基、BHI培養(yǎng)基及TSA培養(yǎng)基:英國OXOID公司;

真菌抑制劑放線菌酮(Cyc):分析純,美國AMRESCO公司;

四環(huán)素(Tet)、磺胺甲惡唑(Sul)、甲氧芐啶(Tri):分析純,美國 SIGMA公司;

生理鹽水:廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;

醫(yī)用酒精:國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;

細(xì)菌基因組提取試劑盒:德國QIAGEN公司;

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)試劑盒、瓊脂糖電泳試劑盒:北京全式金生物技術(shù)有限公司;

PCR產(chǎn)物電泳凝膠回收試劑盒:美國 Thermo Scientific公司;

PCR引物:生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

均質(zhì)機(jī):BAGMIXER400型,法國Interscience公司;

水平核酸電泳系統(tǒng):Mini-Sub cell GT型,美國Bio-Rad公司;

凝膠成像系統(tǒng):Criterion Stain Free型,美國Bio-Rad公司;

超微量分光光度計(jì):NanoDrop 2000c型,美國Thermo公司;

高壓滅菌鍋:SX-500型,日本TOMY公司。

1.2 方法

1.2.1 Tr菌和Sr菌的培養(yǎng) 根據(jù)GB 4789.2—2016和Huang等[11]的方法從雞肉樣品表面初步培養(yǎng)出對四環(huán)素或磺胺甲惡唑耐藥的細(xì)菌。無菌條件下將樣品表面(深度不超過5 mm)的組織剪碎,混勻,準(zhǔn)確稱量25 g于無菌袋中,加入225 mL 0.9%無菌生理鹽水,用均質(zhì)機(jī)拍打2 min制成均質(zhì)液。吸取200 μL均質(zhì)液分別均勻涂布于3種培養(yǎng)基(BHI、TSA、PCA)平皿上,每種培養(yǎng)基平皿中含有16 μg/mL Tet和100 μg/mL Cyc(分別記為BHItet組、TSAtet組和PCAtet組),或152 μg/mL Sul、8 μg/mL Tri和100 μg/mL Cyc(分別記為BHIsul組、TSAsul組和PCAsul組),或僅含有100 μg/mL Cyc(分別記為BHIcyc組、TSAcyc組和PCAcyc組),分別對樣品中的可培養(yǎng)Tr菌、可培養(yǎng)Sr菌和可培養(yǎng)總菌進(jìn)行培養(yǎng)。每個(gè)處理重復(fù)3次。所有平皿于(30±1) ℃下倒置培養(yǎng)48 h,將同組的3個(gè)平皿中的菌體全部刮取并混合,提取細(xì)菌總脫氧核糖核酸(DNA)后進(jìn)行菌群多樣性分析。

1.2.2 細(xì)菌總DNA的提取 用2 mL生理鹽水重懸刮取培養(yǎng)皿上的菌體,充分混勻,取100 μL菌懸液,用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取細(xì)菌總DNA。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳和超微量分光光度計(jì)測定后,對16S rRNA基因的V3～V4區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增,上游引物為341F:5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′,下游引物為 806R:5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′。用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物質(zhì)量后,委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行高通量測序。

1.2.3 高通量測序 基于IonS5TMXL測序平臺進(jìn)行測序,使用Cutadapt(V1.9.1)[20]對reads進(jìn)行低質(zhì)量部分剪切,得到最終的有效數(shù)據(jù)(Clean Reads)。利用Uparse軟件(Uparse v7.0.1001)[21]對所有樣品的全部Clean Reads 進(jìn)行聚類,默認(rèn)以97%的一致(Identity)將序列聚類成為OTUs,對OTUs序列進(jìn)行物種注釋。對各樣品的數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理,以樣品中數(shù)據(jù)量最少的為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行均一化處理,最終確定各物種的相對豐度?；诰换幚砗蟮臄?shù)據(jù),利用β多樣性分析中的主坐標(biāo)分析(PcoA)比較樣本之間的差異,并用MetaStat方法對組間的物種豐度數(shù)據(jù)進(jìn)行假設(shè)檢驗(yàn)得到P值,根據(jù)P值篩選具有顯著性差異的物種。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩類可培養(yǎng)ART菌的菌群結(jié)構(gòu)及可培養(yǎng)總菌的差異

由圖1、圖2可知,不論使用哪種培養(yǎng)基,每個(gè)樣品中的兩類ART菌與總菌相比,排名前十的優(yōu)勢菌屬在種類和豐度上均有差異,甚至在冷鮮雞和雞肉熟食樣品中分別有5(樣品F2,用PCA培養(yǎng))～30(樣品F1,用BHI培養(yǎng))、8(樣品R2,用PCA培養(yǎng))～20(樣品R2,用BHI培養(yǎng))個(gè)屬的耐藥細(xì)菌在對應(yīng)的可培養(yǎng)總菌(從不含抗生素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)獲得)中并未得到鑒定,說明冷鮮雞和雞肉熟食表面各類耐藥細(xì)菌菌群的組成各不相同。因此,有必要研究不同培養(yǎng)基對某類ART菌菌群培養(yǎng)效果的影響。

圖2 3種培養(yǎng)基上的可培養(yǎng)總菌(C)、Tr菌和Sr菌的種屬數(shù)維恩圖

2.2 3種培養(yǎng)基對兩類可培養(yǎng)ART菌組分的影響

由表1、表2可知,冷鮮雞表面共鑒定出78個(gè)屬的Tr菌和77個(gè)屬的Sr菌,多于前期研究[22]及單一BHI培養(yǎng)基中的。其中34個(gè)種屬的Tr菌和33個(gè)種屬的Sr菌在3種培養(yǎng)基上被鑒定出,而僅在BHI、TSA和PCA培養(yǎng)基上鑒定出的特有Tr菌屬各有30,5,3個(gè),Sr菌屬為9,8,14個(gè)。

表1 3種培養(yǎng)基特異性培養(yǎng)的Tr菌

在雞肉熟食樣品表面共鑒定出28個(gè)屬的Tr菌和43個(gè)屬的Sr菌,其中3種培養(yǎng)基的共有菌屬分別為19,28個(gè),特有Tr菌屬分別為3,2,1個(gè),Sr菌屬分別為1,6,0個(gè)。微生物菌群中某個(gè)菌株或某類菌屬是否能獲得培養(yǎng),除受培養(yǎng)基質(zhì)能提供的營養(yǎng)支持及抗生素抑制外,還受到周邊菌群的協(xié)同促進(jìn)或競爭抑制。雞肉熟食表面只在PCA培養(yǎng)基上得到培養(yǎng)的Tr菌為環(huán)絲菌屬(Brochothrixspp.),只在BHI培養(yǎng)基上得到培養(yǎng)的Sr菌為乳桿菌屬(Lactobacillusspp.),只在TSA培養(yǎng)基上得到培養(yǎng)的Sr菌為擬桿菌屬(Bacteroidesspp.)和肉桿菌屬(Carnobacteriumspp.),但這些菌屬在冷鮮雞樣品中的3種培養(yǎng)基上均能得到培養(yǎng);而冷鮮雞表面只在PCA培養(yǎng)基上得到培養(yǎng)的Sr菌Cetobacteriumspp.在雞肉熟食樣品中的3種培養(yǎng)基上均能得到培養(yǎng),慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobiumspp.)在雞肉熟食樣品中用TSA培養(yǎng)基也能得到培養(yǎng)。因此,培養(yǎng)基對表1、表2中涉及的菌屬的培養(yǎng)偏好性還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.3 3種培養(yǎng)基對兩類可培養(yǎng)ART菌豐度的影響

主坐標(biāo)分析結(jié)果表明,經(jīng)3種培養(yǎng)基培養(yǎng)后,冷鮮雞和雞肉熟食樣品表面兩類可培養(yǎng)ART菌的主要群落結(jié)構(gòu)差異不大。進(jìn)而用Metastat法分析經(jīng)3種培養(yǎng)基培養(yǎng)后豐度產(chǎn)生差異的ART菌菌屬,即在BHItet組、TSAtet組和PCAtet組之間分別進(jìn)行兩兩比較。組間聚類結(jié)果表明,BHI和TSA對所培養(yǎng)細(xì)菌的豐度具有較高的相似性。由圖3、圖4可知,冷鮮雞表面有5個(gè)屬的Tr菌和3個(gè)屬的Sr菌在不同培養(yǎng)基上產(chǎn)生了顯著差異。其中,4種Tr菌(氣單胞菌屬Aeromonasspp.、水棲菌屬Enhydrobacterspp.、乳桿菌屬Lactobacillusspp.和泛菌屬Pantoeaspp.)和2種Sr菌(腸球菌屬Enterococcusspp.和乳桿菌屬Lactobacillusspp.)在PCA培養(yǎng)基上能獲得培養(yǎng)的穩(wěn)定性及豐度均較高,而1種Tr菌(漫游菌屬Vagococcusspp.)和1種Sr菌(類香味菌屬M(fèi)yroidesspp.)在BHI培養(yǎng)基上獲得培養(yǎng)的穩(wěn)定性及豐度均顯著較高。上述菌屬中,腸球菌屬、乳桿菌屬、漫游菌屬和類香味菌屬曾被報(bào)道是冷鮮雞肉產(chǎn)品表面的優(yōu)勢菌屬[23],腸球菌屬和乳桿菌屬的細(xì)菌還被證實(shí)較多地參與了耐藥基因的水平遷移[24]。因此,當(dāng)研究對象包含上述菌屬時(shí),可針對性地選擇更適合的培養(yǎng)基以獲得更多的目標(biāo)菌株。

圖4 冷鮮雞表面差異耐藥菌菌屬的豐度

由圖5、圖6可知,雞肉熟食樣品表面有1個(gè)屬的Tr菌和5個(gè)屬的Sr菌在3種培養(yǎng)基上產(chǎn)生了顯著差異。其中,對四環(huán)素耐藥的庫特氏菌屬Kurthiaspp.在BHI培養(yǎng)基上的豐度顯著高于PCA培養(yǎng)基上的;而2種Sr菌(依格納季氏菌屬Ignatzschineriaspp.和未知的毛螺菌科Lachnospiraceae屬)在BHI培養(yǎng)基上的豐度顯著較高,3種Sr菌(經(jīng)黏液真桿菌屬Blautiaspp.、巨球菌屬M(fèi)acrocuccusspp.和未知的瘤胃球菌科Ruminococcaceae屬)在TSA培養(yǎng)基上的豐度較高。

圖5 雞肉熟食表面耐藥菌經(jīng)不同培養(yǎng)基培養(yǎng)后的差異菌屬

圖6 雞肉熟食表面差異耐藥菌菌屬的豐度

營養(yǎng)物質(zhì)可用性的差異會影響菌落形成的程度[25],可能是造成3種培養(yǎng)基對雞肉產(chǎn)品中兩類耐藥菌培養(yǎng)效果差異的原因。由于可能高達(dá)99.999%的微生物物種無法通過常規(guī)的培養(yǎng)方法獲得[26],因此,突破現(xiàn)有常用培養(yǎng)基的局限、優(yōu)化培養(yǎng)基成分是微生物菌種分離領(lǐng)域的重要研究方向。其中,稀釋傳統(tǒng)培養(yǎng)基[27]或添加細(xì)菌來源環(huán)境成分作為培養(yǎng)基補(bǔ)充物[28]是提高可培養(yǎng)細(xì)菌的物種數(shù)量乃至發(fā)現(xiàn)新物種的有效途徑。這些方法在雞肉可培養(yǎng)耐藥菌多樣性的提高方面的可用性,以及適宜的稀釋倍數(shù)或添加物濃度還需更加深入的研究。

3 結(jié)論

研究基于高通量測序技術(shù),以腦心浸液肉湯培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基和平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基3種培養(yǎng)基為例,分析比較了不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)獲得的冷鮮雞和雞肉熟食表面四環(huán)素耐藥(Tr)菌和磺胺耐藥(Sr)菌的菌群結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明,3種培養(yǎng)基上均能獲得培養(yǎng)的菌屬數(shù)僅為總可培養(yǎng)的抗生素耐藥菌屬數(shù)的43.59%(34/78,冷鮮雞Tr菌),42.86%(33/77,冷鮮雞Sr菌),67.86%(19/28,雞肉熟食Tr菌)和65.12%(19/28,雞肉熟食Sr菌)。3種培養(yǎng)基對冷鮮雞和雞肉熟食樣品表面兩類可培養(yǎng)抗生素耐藥菌的主要菌落結(jié)構(gòu)的影響不大,但對部分菌屬的豐度產(chǎn)生了顯著影響,這些菌屬可能在數(shù)量或特性上是耐藥研究需要重點(diǎn)關(guān)注的菌群。因此,匯總多種培養(yǎng)基上獲得的菌群信息可以更完善地描述雞肉樣品表面抗生素耐藥菌的組成。