侯惠靜，吳子健

（1.天津市職業(yè)大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院，天津 300410；2.天津商業(yè)大學(xué) 生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134）

酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）是慢性肝損傷的主要病因之一，該病的發(fā)展經(jīng)歷了多個(gè)進(jìn)行性階段，包括酒精性脂肪肝、酒精性脂肪性肝炎、酒精性肝炎、肝纖維化、肝硬化。近期關(guān)于全球疾病負(fù)擔(dān)的研究指出，酒精相關(guān)肝病是前30 個(gè)死亡原因之一，ALD 已成為廣受關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。目前，ALD 缺乏有效治療手段，藥物治療和手術(shù)治療均存在較大的副作用[2]。

金絲桃苷（hyperin，Hyp），又名槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷，是一種天然黃酮醇苷類化合物，廣泛存在于金絲桃科、葵科、桔?？啤⒍霹N花科、唇形科、小檗科、薔薇科等植物的果實(shí)及全草中[3]，具有抗腫瘤[4]、免疫調(diào)節(jié)[5]、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)[6]、減輕肝臟損傷[7-8]等藥理作用。近期研究表明，金絲桃苷抑制人乳腺癌細(xì)胞系（nuclear factor-kappa B，NF-κB）信號(hào)通路活化，增強(qiáng)Bax-caspase-3 通路活化，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤活性[4]。金絲桃苷能夠降低單胺氧化酶水平，增強(qiáng)重組與合成蛋白（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）表達(dá)，減輕四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)的肝臟纖維化及氧化損傷[9]。此外，金絲桃苷通過(guò)增強(qiáng)葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶和磺基轉(zhuǎn)移酶活性，降低肝毒性，減輕對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)的急性肝衰竭[7]。盡管這些研究揭示了金絲桃苷功能的多樣性，但目前金絲桃苷在酒精性脂肪肝病中作用的研究尚少見(jiàn)。

短期酒精性肝炎模型（Gao-Binge 模型）是目前普遍使用的ALD 動(dòng)物模型，建模后小鼠肝組織出現(xiàn)脂質(zhì)沉積和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞表現(xiàn)出腫脹、胞漿內(nèi)脂肪性小泡等病理現(xiàn)象，該模型能較好地模擬人類酒精性脂肪肝病[10]。實(shí)驗(yàn)擬采用Gao-Binge 模型誘導(dǎo)小鼠酒精性脂肪肝炎，通過(guò)檢測(cè)血清轉(zhuǎn)氨酶水平、肝臟脂肪積累、氧化損傷以及炎癥水平，探究不同劑量的金絲桃苷對(duì)小鼠酒精性脂肪肝炎的改善作用，以期為金絲桃苷在功能性食品與藥品中的應(yīng)用提供理論依據(jù)，為酒精相關(guān)肝病防治保健品的開(kāi)發(fā)提供新策略。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

C57BL/6J 小鼠[體質(zhì)量18～24 g，雄性，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2016-0006]：北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；金絲桃苷（純度95%）：美國(guó)Sigma 公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine transaminase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、甘油三酯（triglyceride，TG）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒：南京建成生物工程研究所；RNA 提取試劑（生物試劑）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒：美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；動(dòng)物飼料（Lieber-DeCarli液體飼料）：美國(guó)Dyets 公司；麥芽糖糊精、乙醇（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Legend Micro17 離心機(jī)：美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；SCIENTZ-48 組織破碎儀：寧波新芝生物科技有限公司；Digital Sight DS-U3 光學(xué)顯微鏡：日本尼康公司；

MyCycler 基因擴(kuò)增（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國(guó)Bio-Rad 公司；LightCycler 480 實(shí)時(shí)定量PCR儀：瑞士羅氏公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物飼養(yǎng)及模型建立

實(shí)驗(yàn)小鼠給予恒溫恒濕的無(wú)特定病原體動(dòng)物（specific pathogen free，SPF） 級(jí)飼養(yǎng)環(huán)境，12 h 光/暗循環(huán)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（IRM-DWLL-2022016）。將50 只實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為5 組，分別為空白組、模型組、金絲桃苷低、中、高劑量（12.5、25.0、50.0 mg/kg）組，每組10 只小鼠。小鼠使用麥芽糖糊精液體飼料喂養(yǎng)5 d，使小鼠適應(yīng)液體飲食，第6 天模型組及金絲桃苷處理組的小鼠飼料更換為5%酒精液體飼料，空白組給予同等熱量的麥芽糖糊精液體飼料，繼續(xù)喂養(yǎng)10 d 后，在早上7:00～9:00 以5 g/kg 劑量進(jìn)行酒精（30%，體積分?jǐn)?shù)） 或麥芽糖糊精灌胃，9 h 后收集血清和肝組織樣本。5%酒精液體飼料喂養(yǎng)期間，金絲桃苷處理組的小鼠每日8:00～9:00 灌胃，并給予相應(yīng)的金絲桃苷，空白組和模型組給予同等體積生理鹽水。

1.3.2 血清指標(biāo)的測(cè)定

自小鼠眼眶后靜脈叢取血，靜置30 min，4 ℃、1 500 r/min 離心15 min 收集血清，參照檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行血清ALT、AST、LDH 活力和TG 含量測(cè)定。

1.3.3 肝臟指標(biāo)的測(cè)定

取0.2 g 肝組織置于冰上，按照SOD、MDA、TG 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定肝組織TG 和MDA 含量，以及SOD 活性。

1.3.4 肝臟病理學(xué)及免疫組化觀察

取新鮮肝臟切成小塊，用10%福爾馬林固定肝組織，經(jīng)石蠟包埋、切片后，進(jìn)行常規(guī)蘇木精-伊紅染色（hematoxylin and eosin staining，H&E）和淋巴細(xì)胞抗原6 復(fù)合體（lymphocyte antigen 6G，Ly6G）免疫組織化學(xué)染色，并在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3.5 肝臟油紅染色

取新鮮肝臟組織塊放入液氮冷凍，用冰凍切片包埋劑（optimal cutting temperature comp，OCT）包埋，組織冰凍切片后，進(jìn)行油紅染色，并在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3.6 目的基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量

按照RNA 提取試劑使用說(shuō)明書(shū)提取肝組織總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用實(shí)時(shí)定量PCR 儀檢測(cè)系統(tǒng)擴(kuò)增肝組織cDNA。將Gapdh 作為內(nèi)參基因，評(píng)估目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

使用GraphPad Prism 7 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。兩組之間差異顯著性使用標(biāo)準(zhǔn)雙尾非配對(duì)t 檢驗(yàn)，認(rèn)為P<0.05 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 金絲桃苷對(duì)小鼠肝臟指數(shù)的影響

金絲桃苷對(duì)小鼠肝臟指數(shù)的影響見(jiàn)圖1。

圖1 金絲桃苷對(duì)小鼠肝臟指數(shù)的影響Fig.1 Effect of hyperin on liver index in mice

由圖1 可知，模型組小鼠肝臟指數(shù)極顯著高于空白組（P<0.01），說(shuō)明酒精液體飼料會(huì)導(dǎo)致小鼠肝臟出現(xiàn)脂質(zhì)沉積、腫脹現(xiàn)象，建模成功；與模型組相比，金絲桃苷低、中、高劑量組均能顯著降低小鼠肝臟指數(shù)（低、中劑量組P<0.01，高劑量組P<0.001），說(shuō)明金絲桃苷能夠有效改善酒精飲食導(dǎo)致的小鼠肝臟腫大。

2.2 金絲桃苷對(duì)酒精飲食誘導(dǎo)的肝臟損傷小鼠血清生化指標(biāo)的影響

ALT、AST 和LDH 是評(píng)價(jià)肝臟受損情況的重要生化指標(biāo)，正常生理狀態(tài)下，血清中ALT、AST 和LDH 活力較低，當(dāng)肝臟受損時(shí)，血清中ALT、AST 和LDH 活力升高[11]。金絲桃苷對(duì)小鼠血清生化指標(biāo)的影響見(jiàn)圖2。

圖2 金絲桃苷對(duì)小鼠血清生化指標(biāo)的影響Fig.2 Effect of hyperin on serum biochemical indexes in mice

如圖2 所示，與空白組相比，模型組小鼠血清中ALT、AST 和LDH 活力高度顯著升高（P<0.001），說(shuō)明酒精飲食導(dǎo)致小鼠肝臟受損。而金絲桃苷中、高劑量組能夠顯著降低小鼠血清ALT 和LDH 活力（高劑量組P<0.001），說(shuō)明一定劑量的金絲桃苷對(duì)酒精飲食誘導(dǎo)的肝臟損傷具有改善作用。

對(duì)小鼠肝組織進(jìn)行H&E 染色，結(jié)果如圖3 所示。

圖3 小鼠肝組織的病理切（標(biāo)尺：50 μm）Fig.3 Histological examination of liver tissue sections of mice（scale bar: 50 μm）

由圖3 可知，模型組小鼠肝組織出現(xiàn)脂質(zhì)沉積，肝細(xì)胞表現(xiàn)出腫脹、胞漿內(nèi)脂肪性小泡等病理現(xiàn)象，匯管區(qū)出現(xiàn)水樣性病變。與模型組相比，金絲桃苷處理組能夠減輕肝組織脂肪沉積，減少胞漿內(nèi)脂肪性小泡，保持肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整。由此可見(jiàn)，在酒精飲食誘導(dǎo)的脂肪肝病模型中，金絲桃苷具有一定的保肝護(hù)肝效用。

2.3 金絲桃苷對(duì)酒精飲食誘導(dǎo)小鼠的肝臟脂肪變性的影響

為進(jìn)一步探究金絲桃苷對(duì)酒精飲食誘導(dǎo)小鼠的肝臟脂肪變性的影響，實(shí)驗(yàn)檢測(cè)血清及肝組織甘油三酯含量，結(jié)果如圖4 所示。

圖4 金絲桃苷對(duì)小鼠血清及肝組織甘油三酯含量的影響Fig.4 Effect of hyperin on content of TG in serum and liver tissue in mice

由圖4 可知，與空白組相比，模型組小鼠血清及肝組織甘油三酯含量高度顯著升高（P<0.001），這主要是由于酒精飲食喂養(yǎng)導(dǎo)致小鼠肝細(xì)胞脂肪代謝紊亂，脂質(zhì)在肝細(xì)胞中堆積產(chǎn)生[12]。金絲桃苷處理組能夠顯著降低小鼠肝組織的甘油三酯含量（低劑量組P<0.05，中、高劑量組P<0.001），血清甘油三酯含量也明顯降低（中劑量組P<0.05，高劑量組P<0.001）。

進(jìn)一步對(duì)小鼠肝組織進(jìn)行油紅染色，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 小鼠肝組織的油紅染色（標(biāo)尺：50 μm）Fig.5 Oil red staining of liver tissue sections（scale bar: 50 μm）

由圖5 可知，小鼠經(jīng)過(guò)酒精液體飼料喂養(yǎng)后，肝組織油紅染色著色區(qū)域明顯大于對(duì)照飲食組，而金絲桃苷低、中、高劑量組小鼠肝組織的油紅染色著色區(qū)域明顯減少。以上結(jié)果說(shuō)明，金絲桃苷能夠減輕酒精飲食導(dǎo)致的肝臟脂肪變性。

2.4 金絲桃苷對(duì)酒精飲食誘導(dǎo)小鼠的肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化的影響

肝臟是酒精代謝的主要場(chǎng)所，乙醇中間代謝產(chǎn)物的肝毒性是ALD 發(fā)病的重要推動(dòng)因素[13]。金絲桃苷對(duì)肝臟SOD 活性和MDA 含量的影響見(jiàn)圖6。

圖6 金絲桃苷對(duì)肝臟SOD 活性和MDA 含量的影響Fig.6 Effect of hyperin on hepatic SOD activity and MDA livel in mice

由圖6 所示，模型組小鼠肝臟SOD 活性極顯著低于空白組（P<0.01），MDA 含量高度顯著高于空白組（P<0.001），這是由于酒精代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量活性氧，抑制肝細(xì)胞的抗氧化能力，降低SOD 水平，脂質(zhì)過(guò)氧化損傷造成MDA 含量升高[14]。與模型組相比，金絲桃苷干預(yù)組能夠明顯提升SOD 活性（高劑量組P<0.001），高度顯著降低酒精中間代謝產(chǎn)物MDA 的含量（低、中、高劑量組P<0.001），這說(shuō)明金絲桃苷能夠有效減輕酒精飲食誘發(fā)的肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化損傷。

2.5 金絲桃苷對(duì)酒精飲食誘導(dǎo)小鼠的肝臟炎癥反應(yīng)的影響

ALD 的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，多種因素可能參與ALD 的發(fā)生發(fā)展，除了酒精代謝產(chǎn)物的肝毒性以外，免疫細(xì)胞介導(dǎo)的炎性損傷也是主要促進(jìn)因素之一[15]。為了明確金絲桃苷對(duì)酒精飲食誘導(dǎo)小鼠的肝臟炎癥反應(yīng)的影響，實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了肝組織炎性細(xì)胞因子mRNA相對(duì)表達(dá)量的變化，結(jié)果如圖7 所示。

圖7 金絲桃苷對(duì)TNF-α 和IL-6 mRNA 相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.7 Effect of hyperin on relative mRNA expression of TNF-α and IL-6 in mice

由圖7 可知，小鼠經(jīng)過(guò)酒精液體飼料喂養(yǎng)后，模型組小鼠與空白組相比，肝組織IL-6 和TNF-α 的mRNA水平高度顯著升高（P<0.001），金絲桃苷處理組能夠顯著抑制酒精誘導(dǎo)的肝臟IL-6 表達(dá)（中劑量組P<0.01，高劑量組P<0.001），顯著降低TNF-α 的mRNA 水平（低劑量組P<0.05，中、高劑量組P<0.001）。

在酒精性脂肪肝病中，肝臟中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和中性粒細(xì)胞趨化因子表達(dá)上調(diào)是酒精性肝炎的重要特征之一[16]。因此，對(duì)小鼠肝組織進(jìn)行Ly6G（中性粒細(xì)胞特異性標(biāo)志物）免疫組化染色，結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖8 小鼠肝組織的Ly6G 免疫組化染色（標(biāo)尺：50 μm）Fig.8 Ly6G immunohistochemistry staining of liver tissue sections of mice（scale bar: 50 μm）

由圖8 可知，模型組小鼠肝臟切片Ly6G 陽(yáng)性染色細(xì)胞明顯增加，說(shuō)明酒精飲食小鼠的肝組織中出現(xiàn)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)增多的現(xiàn)象。小鼠經(jīng)過(guò)金絲桃苷干預(yù)后，肝臟切片中Ly6G 陽(yáng)性染色細(xì)胞減少，意味著中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少。進(jìn)一步，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR 技術(shù)檢測(cè)中性粒細(xì)胞趨化因子mRNA 相對(duì)表達(dá)量的變化，結(jié)果如圖9 所示。

圖9 金絲桃苷對(duì)CXCL1 和CXCL2 mRNA 相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.9 Effect of hyperin on relative mRNA expression of CXCL1 and CXCL2 in mice

由圖9 可知，與空白組相比，模型組小鼠肝組織中CXCL1、CXCL2 的mRNA 相對(duì)表達(dá)量高度顯著升高，而金絲桃苷能夠降低酒精飲食小鼠肝臟中性粒細(xì)胞趨化因子的表達(dá)水平（中劑量組P<0.01，高劑量組P<0.001）。以上結(jié)果說(shuō)明金絲桃苷能夠有效減輕小鼠酒精飲食誘發(fā)的肝臟炎癥反應(yīng)和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。

在ALD 病程中，肝臟氧化損傷觸發(fā)的獲得性免疫反應(yīng)和酒精誘導(dǎo)的固有免疫細(xì)胞活化會(huì)引起肝臟炎癥反應(yīng)發(fā)生，巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞參與其中。乙醇的中間代謝產(chǎn)物如乙醛和丙二醛被抗原呈遞細(xì)胞識(shí)別，激活T 細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)，產(chǎn)生TNF-α 促炎細(xì)胞因子[17]。酒精損傷腸道屏障，使小腸通透性增強(qiáng)，LPS 通過(guò)門(mén)靜脈系統(tǒng)入肝激活巨噬細(xì)胞，產(chǎn)生TNF-α、IL-6 等促炎因子，進(jìn)而募集中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞入肝臟[18-19]。中性粒細(xì)胞通過(guò)釋放組織溶解酶、產(chǎn)生活性氧（robot operating system，ROS）損傷肝細(xì)胞，利用Ly6G 中和抗體清除中性粒細(xì)胞可以顯著降低血清轉(zhuǎn)氨酶水平[20]，阻斷CXCL1 明顯抑制小鼠肝臟中性細(xì)胞浸潤(rùn)，減輕脂肪肝炎[21]。由此可見(jiàn)，抑制肝組織促炎細(xì)胞因子及中性粒細(xì)胞趨化因子表達(dá)，減少肝臟中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)能夠有效減輕酒精飲食導(dǎo)致的脂肪肝炎。一些研究表明，金絲桃苷能夠抑制AKT/GSK3β 信號(hào)通路活化，降低TNF-α 和IL-6 等炎性因子分泌，減輕博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化[22]。此外，金絲桃苷誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞Nr4A1 表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞從促炎M1 表型向抑炎M2 表型極化，從而降低高脂飲食誘發(fā)的肝臟脂積累及炎癥反應(yīng)[23]。這與本文研究結(jié)果一致，即金絲桃苷能夠減輕肝臟炎性因子和趨化因子表達(dá)，減少中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，改善酒精飲食誘導(dǎo)的脂肪肝炎。

3 結(jié)論

本文研究了金絲桃苷對(duì)酒精飲食誘發(fā)的小鼠脂肪性肝炎的改善作用。結(jié)果表明，一定劑量的金絲桃苷能夠減輕Gao-Binge 模型誘導(dǎo)的小鼠酒精性肝損傷，降低血清轉(zhuǎn)氨酶水平，減輕肝臟脂積累和脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，抑制炎性細(xì)胞因子及趨化因子表達(dá)，減少肝臟中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，改善小鼠酒精性脂肪肝炎，但其具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步探究。本研究豐富了金絲桃苷功能的多樣性，為金絲桃苷在保肝護(hù)肝保健品的開(kāi)發(fā)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。