丁新玲,孫會(huì)艷,李 強(qiáng),王洪權(quán)

(赤峰學(xué)院1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院、2.醫(yī)學(xué)部,內(nèi)蒙古 赤峰 024000;3.內(nèi)蒙古人類遺傳病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,內(nèi)蒙古 赤峰 024000;4.赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,內(nèi)蒙古 赤峰 024005;5.天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院、天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所、國家癌癥臨床醫(yī)學(xué)研究中心、天津市腫瘤防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心,天津 300060)

帕金森病(Parkinson′s disease,PD)是一種常見的神經(jīng)退行性疾病,其主要病理特征是中腦黑質(zhì)致密部(compact part of substantia nigra,SNpc)多巴胺能(DA)神經(jīng)元的選擇性死亡和缺失,黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能系統(tǒng)功能退化,最終導(dǎo)致患者運(yùn)動(dòng)和非運(yùn)動(dòng)功能障礙。氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥、凋亡、興奮性毒性、線粒體功能障礙、蛋白質(zhì)清除機(jī)制缺陷、神經(jīng)營養(yǎng)因子耗竭等機(jī)制參與了PD中多巴胺能神經(jīng)元的丟失,參與PD的發(fā)病機(jī)制。傳統(tǒng)中藥(traditional Chinese medicine,TCM)因?yàn)槎喟悬c(diǎn)、多途徑和多層次藥效作用,引起致力于防治以PD為主的神經(jīng)退行性疾病的學(xué)者關(guān)注[1]。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin 3-gallate,EGCG)是一種來源于綠茶提取物的豐富多酚成分,近年研究顯示在帕金森病(PD)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭惺怯行У?使其成為PD治療的潛在藥物。本文對(duì)EGCG在PD中的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制進(jìn)行了綜述,重點(diǎn)總結(jié)歸納了EGCG通過抗凋亡、抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)多巴胺生成和α-突觸核蛋白聚集等機(jī)制在PD中的神經(jīng)保護(hù)作用的最新進(jìn)展。

Fig 1 Chemical structure of EGCG

1 EGCG的化學(xué)特性和生物利用度

EGCG(分子式為C22H18O11),是綠茶茶多酚的主要組成成分,是從茶葉中分離得到的兒茶素類單體,一杯250 mL的1.25%(W/V)綠茶中含有約177 mg EGCG。 EGCG由四個(gè)標(biāo)記為A、B、C和D的環(huán)組成(分子式見Fig 1)。A和C為苯并吡喃環(huán),它在C2處有一個(gè)苯基,在C3處有一個(gè)沒食子酸基團(tuán)。B環(huán)具有位置3,4,5-三羥基,D環(huán)沒食子酸部分在C3處配置為酯。EGCG及其代謝產(chǎn)物主要經(jīng)肝臟代謝,進(jìn)入膽汁或腸細(xì)胞,進(jìn)入腸腔以糞便形式排出,少量通過尿液排出體外。茶葉的生物利用度取決于其本身的分子尺寸和極性。表兒茶素(epicatechin,EC)(分子量290)的生物利用度顯著高于EGCG (分子量458 u)。當(dāng)人類口服相當(dāng)于兩杯無咖啡因茶后,EGCG的血漿峰值水平通常在0.2 μmol·L-1左右。通過口服具有顯著藥理劑量的EGCG后,在小鼠和人類中分別檢測(cè)到2～9 μmol·L-1和7.5 μmol·L-1的峰值血漿濃度。人喝兩杯綠茶后,EGCG的血漿濃度最高為0.15 μmol·L-1。同時(shí),EGCG在血漿中以大量游離形式存在。EGCG的消除半衰期為3.4±0.3小時(shí)。正常人志愿者口服1.6 g劑量的EGCG,血漿EGCG濃度達(dá)到生理濃度?？诜﨓GCG通過腸道吸收,口服消化1～ 2 h后血漿中檢測(cè)到EGCG;禁食大鼠和人血漿中EGCG的峰值濃度分別為0.156 kg·L-1和1.047 kg·L-1。EGCG的另一個(gè)重要特性是其具有較高的BBB通透性,這可能是因?yàn)槠涫杷约捶肿拥臉O性越低,腦組織的吸收越好[2]。

2 在PD中的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制

近年來,EGCG在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用引起藥理學(xué)家們的關(guān)注。首次證實(shí)EGCG在PD中具有神經(jīng)保護(hù)作用以來,EGCG在PD中的應(yīng)用研究越來越多[12]。EGCG可以在PD的多種體內(nèi)外模型中具有神經(jīng)保護(hù)作用,而且可通過多種機(jī)制發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用,我們歸納如下。

2.1 抗凋亡作用帕金森病神經(jīng)元死亡的主要機(jī)制之一是細(xì)胞凋亡。帕金森病患者和實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭写罅孔C據(jù)支持內(nèi)在凋亡在多巴胺能神經(jīng)元退變中的作用,而抑制凋亡成為治療PD的重要靶點(diǎn)之一。200 μmol·L-1EGCG能在PC12細(xì)胞中通過抗凋亡作用抑制6-羥基多巴胺( 6-hydroxydopamine,6-OHDA)誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷,這是首次證實(shí)EGCG在PD中具有神經(jīng)保護(hù)作用的研究[3]。后續(xù)的系列深入研究也證實(shí)了EGCG的抗凋亡作用[4-5]。 6-OHDA處理的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y中,EGCG(0.1～10 μmol·L-1)預(yù)處理SH-SY5Y細(xì)胞可顯著減輕6-OHDA誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。1 μmol·L-1EGCG可完全阻止6-OHDA誘導(dǎo)的STAT3活性下降,并且可刺激有道神經(jīng)細(xì)胞的增殖。這表明,EGCG對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用可能是通過重新刺激STAT3信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的[6]。在過表達(dá)A53T-α-syn的SH-SY5Y細(xì)胞中,EGCG能抑制6-OHDA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[7]。

EGCG預(yù)處理N27細(xì)胞,能夠抑制6-OHDA導(dǎo)致的二價(jià)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)體-1(divalent metal transporter-1,DMT1)表達(dá)增加、鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(ferroportin 1,Fpn1)水平的降低,進(jìn)而降低細(xì)胞內(nèi)鐵含量,這也同時(shí)表明EGCG具有調(diào)控鐵代謝的功能,提示EGCG可能具有調(diào)控鐵死亡的作用[8]。鐵死亡是一種由細(xì)胞膜中含有磷脂的多不飽和脂肪酸的過氧化損傷驅(qū)動(dòng)的、鐵依賴性的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡[9]。于此同時(shí)EGCG可抑制6-OHDA誘導(dǎo)的caspase-3活性增加,在原代中腦神經(jīng)元中,EGCG能夠抑制6-OHDA誘導(dǎo)的TH+細(xì)胞計(jì)數(shù)減少和增加軸突長度[8]。在6-OHDA誘導(dǎo)的SK-N-AS細(xì)胞中,EGCG抑制 6-OHDA引起的α-synuclein蛋白表達(dá)增加,免疫組化結(jié)果顯示EGCG可減弱模型細(xì)胞中6-OHDA引起的caspase-3免疫反應(yīng)性[10]。經(jīng)瘦素(leptin,Lep)修飾的包裹白藜蘆醇(resveratrol,Res)和EGCG組成的脂質(zhì)體(Lep/RES-EGCG-PA)具有通過血腦屏障的功能,Lep/RES-EGCG-PA能夠抑制MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞中凋亡促進(jìn)蛋白Bax蛋白的表達(dá),增加Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生[11]。EGCG也能抑制由百草枯(paraquat)誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡,其機(jī)制可能與維持線粒體膜電位、抑制caspase-3活性和下調(diào)胞質(zhì)中促凋亡蛋白Smac的表達(dá)有關(guān)[12]。同時(shí)EGCG也能夠在動(dòng)物模型中通過抗凋亡機(jī)制在PD中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。在魚藤酮誘導(dǎo)的大鼠PD模型中,EGCG可顯著減弱魚藤酮誘導(dǎo)的紋狀體caspase-3激活[13]。綜上所述,EGCG能夠在PD體內(nèi)外模型中通過抑制神經(jīng)毒素誘導(dǎo)的凋亡而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。但是其抑制凋亡的分子機(jī)制仍有待于深入研究。

2.2 抗氧化損傷作用氧化應(yīng)激損傷是PD的重要特征之一,抑制氧化應(yīng)激成為治療PD的重要靶點(diǎn)之一。在細(xì)胞水平上,100 μmol·L-1EGCG能夠抑制L-DOPA誘導(dǎo)的ROS生成,降低組織硫代巴比妥酸反應(yīng)物(thiobarbituric acid reactive substances,TBARS)生成,同時(shí)上調(diào)細(xì)胞內(nèi)GSH水平,這些結(jié)果表明,EGCG對(duì)左旋多巴誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化凋亡具有保護(hù)作用[14]。EGCG能夠增加PC12細(xì)胞中SIRT1和PGC-1α蛋白表達(dá),10 μmol·L-1EGCG抑制MPP+誘導(dǎo)ROS生成增加,細(xì)胞活力增加,而EGCG上調(diào)PGC-1α mRNA、SOD1和GPX1 mRNA,這表明,SIRT1/PGC-1α通路是EGCG抑制MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化損傷的機(jī)制之一[15]。

同時(shí)在動(dòng)物模型水平上EGCG也能夠通過抗氧化機(jī)制在PD中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。在MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠模型中,MPTP治療使小鼠從旋轉(zhuǎn)體下降的潛伏期縮短16%,而紋狀體多巴胺濃度降低58%,二羥苯乙酸(dihydroxyphenylacetic acid )濃度降低35%,血清蛋白羰基(serum protein carbonyls)含量增加71%,EGCG抑制MPTP誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性。EGCG可上調(diào)小鼠的黑質(zhì)Fpn1表達(dá),但沒有發(fā)現(xiàn)對(duì)鐵調(diào)節(jié)蛋白(hepcidin)和DMT1的表達(dá)的影響,這表明EGCG調(diào)節(jié)黑質(zhì)鐵輸出蛋白和降低氧化應(yīng)激[16]。在魚藤酮誘導(dǎo)的SD大鼠PD模型中,EGCG腹腔注射(100或300 mg·kg-1)21 d可預(yù)防魚藤酮誘導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)損傷,降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生,該研究是關(guān)于EGCG對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)損傷的神經(jīng)保護(hù)作用的首次報(bào)道[13]。EGCG能夠改善6-OHDA誘導(dǎo)的Wistar大鼠行為變化,表現(xiàn)為旋轉(zhuǎn)行為減少、運(yùn)動(dòng)活動(dòng)增強(qiáng)、抗抑郁作用增強(qiáng)和認(rèn)知功能障礙改善,而EGCG可逆轉(zhuǎn)紋狀體氧化應(yīng)激和免疫組織化學(xué)改變[17]。另外,在PD轉(zhuǎn)基因黑腹果蠅模型中也而觀察到了EGCG具有抗氧化作用[18-19]。綜上所述,EGCG能夠在PD體內(nèi)外模型中抑制神經(jīng)毒素誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷。但目前抗氧化防御體系,如Nrf2/ARE通路在EGCG抑制PD相關(guān)神經(jīng)毒素介的神經(jīng)導(dǎo)損傷中作用不清楚,值得深入研究。

2.3 抗炎作用PD患者腦內(nèi)受累區(qū)內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活,小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞激活產(chǎn)生的促炎性因子導(dǎo)致突觸丟失和功能障礙,而慢性炎癥也可以促進(jìn)路易體形成進(jìn)而參與PD發(fā)病機(jī)制,在PD患者腦內(nèi)、腦脊液和血液中存在高濃度的促炎性因子(如IL-1β、IL-6和TNF-α)的水平升高,表明慢性神經(jīng)炎癥在PD的進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用,因此抑制慢性炎癥成為PD潛在的治療靶點(diǎn)。在6-OHDA誘導(dǎo)的SK-N-AS細(xì)胞中,EGCG能夠減弱6-OHDA誘導(dǎo)的IL-1β染色增強(qiáng),表明EGCG具有抗炎作用[10]。在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞中,裝載EGCG的脂質(zhì)體可被BV-2細(xì)胞吞噬,EGCG脂質(zhì)體改善了LPS誘導(dǎo)的BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞一氧化氮(nitrogen oxide,NO)和TNF-α的產(chǎn)生,表明EGCG具有抑制LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥發(fā)生,同時(shí)黑質(zhì)內(nèi)注射EGCG脂質(zhì)體可減輕LPS誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子并恢復(fù)運(yùn)動(dòng)損傷,這表明EGCG脂質(zhì)體通過調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[20]。而EGCG抑制魚藤酮引起的黑質(zhì)內(nèi)炎性因子標(biāo)志物NO、IL-1β和TNF-α的升高[13],同樣證實(shí)了在魚藤酮誘導(dǎo)的大鼠PD模型中EGCG具有抗炎作用。綜上所述,EGCG能夠在PD體內(nèi)外模型中通過抑制神經(jīng)炎癥從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

2.4 調(diào)控DA神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)帕金森病最主要的病理改變是中腦黑質(zhì)多巴胺(dopamine,DA)能神經(jīng)元的變性死亡,由此而引起紋狀體DA含量顯著性減少而致病。因此恢復(fù)紋狀體DA含量成為治療PD的重要靶點(diǎn)。在服用左旋多巴/卡比多巴后2 h,口服400 mg·kg-1EGCG略微增加了紋狀體多巴胺水平[16]。LPS腹腔注射誘導(dǎo)的雄性SD大鼠PD模型中,4、24 h、3和7 d中腦TNF-α、NO含量增加,DA水平降低,而EGCG(10 mg·kg-1)預(yù)處理7 d可降低TNF-α和NO,并提高了腦內(nèi)DA水平[21]。在MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠模型中,EGCG能提高紋狀體多巴胺及其代謝產(chǎn)物3,4-二羥基苯乙酸(3,4-dihydroxyphenylacetic acid)和高香草酸(homovanillic acid,HVA)的水平[22]。另一項(xiàng)在MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠模型中同樣證實(shí)了EGCG具有提高紋狀體多巴胺濃度的能力[16]。綜上所述,EGCG具有升高腦內(nèi)DA的性能,但其具體機(jī)制是否與抑制DA降解仍不清楚,有待進(jìn)一步深入研究。

2.5 調(diào)控α-突觸核蛋白錯(cuò)誤折疊的α突觸核蛋白(α-synuclein,α-syn)異常聚集,是PD病人腦內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)路易小體的主要成分,編碼α-syn的SNCA基因突變突變參與家族性早發(fā)PD的發(fā)病機(jī)制。EGCG已被證明是一種有效的抗淀粉樣蛋白制劑[23-24]。系列研究顯示EGCG可以抑制α-syn淀粉樣變性[25-26],并保護(hù)大鼠PC12和神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞免受聚集誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性[25]。EGCG使淀粉樣蛋白聚集途徑被重新定向?yàn)樾纬煞€(wěn)定的球形低聚物(spherical oligomers),這些低聚物被鑒定為無毒的無定形物種,在變性條件下不能促進(jìn)播種和分解[27]。EGCG與α-syn蛋白質(zhì)特異性結(jié)合,阻止無規(guī)線圈結(jié)構(gòu)(random-coil structures)轉(zhuǎn)化為β-折疊。EGCG與天然結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)α-syn蛋白中的柔性區(qū)域相互作用,結(jié)合在整個(gè)蛋白質(zhì)序列中均勻發(fā),也有數(shù)據(jù)顯示EGCG可以通過氧化α-syn來減少其聚集過程[28]。

新發(fā)現(xiàn)表明,EGCG直接與原纖維的β片層結(jié)構(gòu)(β-sheets of fibrils)結(jié)合,改變?chǔ)?syn淀粉樣蛋白的構(gòu)象,而不會(huì)將其分解為有毒的低聚物中間體[29]。EGCG重塑原纖維,減少α-syn淀粉樣蛋白的沉積,并將其轉(zhuǎn)化為無定形的非細(xì)胞毒性聚集體(amorphous non-cytotoxic aggregates)[29]。EGCG與β-環(huán)糊精協(xié)同作用增加了對(duì)α-syn淀粉樣變性的抑制作用和預(yù)形成纖維(pre-formed fibrils )的解聚[30]。因此,我們可以得出結(jié)論EGCG能夠在PD中阻止α-syn的聚集的作用,同時(shí)也能夠重塑α-syn原纖維改的作用,減少α-syn淀粉樣蛋白的沉積。

Fig 2 Schematic illustration of neuroprotective effects of EGCG in PD

3 結(jié)語

綜上所述,EGCG通過多種機(jī)制在PD中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。其可以在PD的細(xì)胞模型和動(dòng)物模型中具有神經(jīng)保護(hù)作用,其機(jī)制總結(jié)見Fig 2。EGCG具有抗凋亡、抗氧化、抗炎,同時(shí)它們通過促進(jìn)腦內(nèi)多巴胺升高,調(diào)節(jié)腦內(nèi)病變區(qū)的神經(jīng)遞質(zhì)平衡,以及具有調(diào)控α-突觸核蛋白的功能。雖然EGCG在PD中的藥理作用多樣,但是是否存在其它機(jī)制來參與其對(duì)PD損傷的抑制作用尚不清楚。有數(shù)據(jù)顯示EGCG能夠通過下調(diào)二價(jià)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)體-1和上調(diào)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(Fpn1)水平,而調(diào)控鐵代謝,而鐵是參與一種由細(xì)胞膜中含有磷脂的多不飽和脂肪酸的過氧化損傷驅(qū)動(dòng)的、鐵依賴性的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡即鐵死亡機(jī)制,提示EGCG可能通過抑制鐵死亡發(fā)揮對(duì)PD的治療作用,但目前尚缺乏詳細(xì)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,涵待進(jìn)一步深入探索。