婁淵根, 李 闖,李晶晶, 邢國珍, 路亞南, 鄭文明,*

(1. 河南護(hù)理職業(yè)學(xué)院,河南 安陽 455000;2. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/小麥玉米作物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 鄭州 450002)

細(xì)胞分裂素是一類重要的植物激素,通過一系列的信號傳導(dǎo)途徑參與調(diào)控植物生長發(fā)育以及對非生物脅迫的響應(yīng)等生物學(xué)過程[1-3]。組氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(histidine phosphotransfer proteins, HP)是細(xì)胞分裂素信號通路中的關(guān)鍵因子,屬于通路中的正向調(diào)控蛋白[4]。受體組氨酸蛋白激酶(histidine kinases, HK)與細(xì)胞分裂素在細(xì)胞質(zhì)中結(jié)合并完成磷酸化,HP蛋白的保守組氨酸位點(diǎn)能識別HK蛋白的磷酸基團(tuán),將磷酸基團(tuán)從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核,最終激活下游相關(guān)基因,從而調(diào)控植物的生長發(fā)育過程[5]。近年來越來越多的證據(jù)表明,HP蛋白是植物應(yīng)答非生物脅迫途徑中的重要功能因子。

擬南芥AHP2、AHP3 和AHP5參與對干旱脅迫和冷脅迫的抗性調(diào)控[4,6]。水稻OsAHP1 和OsAHP2 的RNAi 轉(zhuǎn)基因株對鹽敏感且對干旱耐性增強(qiáng)[7]。小麥TaHP1 基因被發(fā)現(xiàn)參與調(diào)控小麥葉片衰老[8]。此外,HP基因具有復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制,不同HP基因的表達(dá)模式在不同環(huán)境條件下差異很大,同時(shí)具有很強(qiáng)的組織特異性表達(dá)特征。擬南芥HP基因在調(diào)控主根、側(cè)根生長發(fā)育及花藥壁發(fā)育等生物過程中展示了較強(qiáng)的組織特異性[9-11]。OsAHP1和OsAHP2基因在受到鹽和干旱的誘導(dǎo)表達(dá)中顯著不同[7]。小麥TaHP4基因在多種逆境脅迫條件下,包括鹽、干旱、脫落酸和細(xì)胞分裂素,受到顯著抑制表達(dá);TaHP4基因并具有明顯的組織特異性,在根組織表達(dá)量很低,然而在葉、穗、莖等地上部高表達(dá)[12]。因此,深入解析HP基因特征及參與逆境脅迫的調(diào)控過程,對挖掘種質(zhì)資源從而推動抗逆性育種非常重要。

植物基因組測序技術(shù)的快速發(fā)展為抗逆相關(guān)的重要基因家族的鑒定分析提供了重要資源。白菜[13]、茭白[14]、黃瓜[15]、蘿卜[16]、莖瘤芥[17]等全基因組水平的HP基因家族鑒定有助于物種抗逆基因資源的開發(fā)。目前小麥HP基因家族全基因組水平的鑒定和比較分析尚未見報(bào)道。本研究利用中國春小麥基因組數(shù)據(jù),對HP基因家族進(jìn)行系統(tǒng)注釋,并分析了其理化性質(zhì)、基因復(fù)制、基因結(jié)構(gòu)、保守序列、順式作用元件以及在非生物脅迫條件下的表達(dá)模式,為進(jìn)一步探究小麥HP家族基因的進(jìn)化特征和在非生物脅迫下的應(yīng)答機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)材料為小麥品種鄭麥9023。用10%過氧化氫溶液對小麥種子消毒10 min,再將種子于滅菌蒸餾水中清洗4～5次,之后放置于25 ℃培養(yǎng)箱進(jìn)行萌發(fā)。待小麥到二葉期進(jìn)行低磷(10 μmol·L-1KH2PO4)水培處理,分別在0 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d和14 d取根部樣品,每個(gè)時(shí)期的樣品為3個(gè)生物學(xué)重復(fù),材料于-80 ℃ 冰箱中保存?zhèn)溆?。采用Trizol法對樣品進(jìn)行RNA提取,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA使用HiScript?ⅡQ RT SuperMix for qPCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒(南京)。

1.2 方法

1.2.1 小麥HP家族基因注釋和序列特征

以HPt結(jié)構(gòu)域PF01627(http://pfam.xfam.org/)為種子文件,利用HMMER 3.2.1軟件[18]的hmmscan程序搜索小麥基因組數(shù)據(jù)庫的蛋白組(RefSeq v2.1,https://www.wheatgenome.org/)[19]。將注釋的HP蛋白與擬南芥HP蛋白(https://www.arabidopsis.org/)通過BLASTP[20]比對,依據(jù)每個(gè)基因的最佳比對結(jié)果命名小麥HP家族基因。通過ExPASy(https://www.expasy.org/)分析HP家族基因的理化性質(zhì),并通過CELLO(http://cello.life.nctu.edu.tw/)[21]預(yù)測亞細(xì)胞定位。利用GSDS 2.0(http://gsds.gao-lab.org/)[22]分析HP家族的基因結(jié)構(gòu)。使用PROSITE軟件(https://prosite.expasy.org/)[23]預(yù)測分析蛋白結(jié)構(gòu)。利用MEME軟件(http://meme-suite.org/)[24]預(yù)測保守基序,基序設(shè)置為5。

1.2.2 氨基酸序列比對與進(jìn)化樹構(gòu)建

擬南芥HP蛋白包括AHP1(AT3G21510.1)、AHP2(AT3G29350.1)、AHP3(AT5G39340.2)、AHP4(AT3G16360.2)、AHP5(AT1G03430.2)、AHP6(AT1G80100.3)。其他植物的HP蛋白從NCBI數(shù)據(jù)庫下載,包括水稻Os_HP2(NP_001390867.1)、玉米Zm_HP2(NP_001104850.1)、大麥Hv_HP2(XP_044979355.1)、二穗短柄草Bd_HP2(XP_003578675.1)、節(jié)節(jié)麥Aet_HP2(XP_020168581.1)、烏拉爾圖小麥Tu_HP2(XP_048569068.1)。使用DNAMAN軟件執(zhí)行HP蛋白的多序列比對。通過MEGAX軟件[25]的最大似然法(maximum likelihood)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,bootstrap值設(shè)置為1 000。

1.2.3 順式作用元件預(yù)測

選取HP基因上游的 2 000 bp序列,利用PlantCare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)[26]進(jìn)行啟動子的順式作用元件預(yù)測,并通過TBtools 軟件[27]進(jìn)行歸類和可視化。

1.2.4 基因表達(dá)模式分析

利用小麥表達(dá)數(shù)據(jù)庫expVIP網(wǎng)站(http://www.wheat-expression.com/)[28],通過分析所有HP基因的tpm(transcripts per million)值計(jì)算表達(dá)量并繪制基因表達(dá)熱圖。利用Applied Biosystems熒光定量PCR儀進(jìn)行 qRT-PCR 反應(yīng),程序設(shè)置為95 ℃ 10 min,95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)。利用 2-ΔΔCT方法對基因表達(dá)水平進(jìn)行相對定量分析。以小麥26S基因Ta26S為內(nèi)參基因[29]。 qRT-PCR 引物序列如表1中所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥HP基因家族鑒定

以中國春小麥的全基因組蛋白序列為依據(jù),基于HPt結(jié)構(gòu)域(PF01627)的隱馬模型共鑒定到31個(gè)HP家族基因。通過小麥HP家族編碼蛋白和擬南芥HP蛋白序列的比對,依據(jù)最佳比對結(jié)果所對應(yīng)的擬南芥同源基因命名小麥HP基因家族成員(表2)。根據(jù)基因注釋信息,發(fā)現(xiàn)HP家族的27個(gè)基因位于11條染色體上,呈現(xiàn)不均勻分布,其中A組染色體丟失同源基因數(shù)量最多。在每條染色體上,共發(fā)現(xiàn)1對同源基因(TaHP1-4D;3-TaHP1-4D;4)經(jīng)歷串聯(lián)復(fù)制,6對同源基因(TaHP1-4D;1-TaHP1-4D;2、TaHP1-4A;1-TaHP1-4A;2、TaHP1-1B;1-TaHP1-1B;2、TaHP1-4A;2-TaHP1-4A;3、TaHP5-6D;1-TaHP5-6D;2 和TaHP5-4B-TaHP1-4B;2)經(jīng)歷片段復(fù)制。

表2 小麥HP基因家族成員的基本特征

小麥HP家族蛋白的氨基酸個(gè)數(shù)為116～200,蛋白相對分子量大小范圍為13.4～21.71 ku。31個(gè)HP蛋白的等電點(diǎn)范圍為4.98～8.99,26個(gè)基因的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)小于7,說明HP家族大部分成員是偏酸性。亞細(xì)胞定位預(yù)測表明,20個(gè)基因蛋白質(zhì)定位在細(xì)胞外,14個(gè)蛋白定位在細(xì)胞核。這些結(jié)果說明HP蛋白成員的基因組組成存在保守性,又存在很大差異。

2.2 小麥HP家族蛋白的保守性

HPt 結(jié)構(gòu)域(histidine-containing phosphotransfer domain profile),即組氨酸磷酸轉(zhuǎn)移域,是傳遞磷酸基團(tuán)的核心結(jié)構(gòu)域。使用PROSIT軟件分析小麥HP家族的蛋白結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)8個(gè)蛋白(TaHP1-4A;2、TaHP1-4A;3、TaHP1-4B;2、TaHP1-6B、TaHP2-6D;2、TaHP2-6D;1、TaHP5-6D;1和TaHP5-6D;2)缺失完整的HPt結(jié)構(gòu)域,其他23個(gè)蛋白都包括一個(gè)HPt結(jié)構(gòu)域,無其他結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)果表明,盡管HPt 結(jié)構(gòu)域具有保守性,但在進(jìn)化過程中受到環(huán)境等因素的影響導(dǎo)致氨基酸序列變異,蛋白功能可能具有多樣性。

對小麥HP家族的31個(gè)蛋白和擬南芥、水稻、玉米、大麥、二穗短柄草、節(jié)節(jié)麥以及烏拉爾圖小麥的12個(gè)HP蛋白,通過DNAMAN軟件進(jìn)行多序列比對。8種植物的多序列比對結(jié)果(圖1)發(fā)現(xiàn),HP蛋白結(jié)構(gòu)域的序列相似度高于其他區(qū)域 ,說明HPt結(jié)構(gòu)域序列是保守的。9個(gè)HP蛋白結(jié)構(gòu)域的磷酸化位點(diǎn)缺失,包括TaHP1-6B、TaHP2-6D;2、TaHP2-6D;1、TaHP4-3A、TaHP4-3B、TaHP4-3D、TaHP5-6D;1、TaHP5-6D;2和TaHP5-4B,暗示這些蛋白受到了強(qiáng)烈的環(huán)境進(jìn)化壓力。TaHP1-1B;1和TaHP1-6B蛋白相對于其他蛋白缺失部分保守序列,可能與它們快速變異適應(yīng)環(huán)境有關(guān)?？傊?和其他植物相比,小麥HP蛋白具有更多的變異位點(diǎn),可能與HP蛋白參與更復(fù)雜的生物學(xué)過程調(diào)控有關(guān)。

藍(lán)色箭頭代表磷酸化位點(diǎn)。Bule arrow represents phosphorylation site.圖1 小麥和其他植物的HP蛋白序列的比對結(jié)果Fig.1 Multiple alignment of HP proteins in wheat and other plants

2.3 小麥HP家族基因的結(jié)構(gòu)特征

對小麥HP家族蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,并分析其基因結(jié)構(gòu)和保守基序(圖2)。進(jìn)化樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)表明,HP家族蛋白在進(jìn)化分支上較為分散,存在多個(gè)分支。HP1～HP6各個(gè)蛋白亞家族未能聚類在同一分支,可能與每個(gè)基因的變異以承受的環(huán)境進(jìn)化壓力不同有關(guān)。

A,進(jìn)化關(guān)系;B,基因結(jié)構(gòu);C,保守基序。A, Evolutionary relationship; B, Gene structure; C, Conserved motif.圖2 小麥HP家族的系統(tǒng)進(jìn)化和基因結(jié)構(gòu)Fig.2 Phylogenetic evolution and gene structure of HP family in wheat

基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn),31個(gè)HP基因的外顯子數(shù)目范圍為4～8個(gè),24個(gè)基因包含 6個(gè)外顯子。內(nèi)含子序列擴(kuò)張是部分HP基因長度延伸的主要因素。在相同的進(jìn)化分支上,受到內(nèi)含子結(jié)構(gòu)影響,HP家族基因并未具有相似的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。然而在相同的進(jìn)化分支上,大多數(shù)基因成員的編碼序列(外顯子)卻分布相似?；蚪Y(jié)構(gòu)的相對保守性說明HP基因功能可能具有保守性。

進(jìn)一步分析小麥HP家族蛋白的保守結(jié)構(gòu),結(jié)果發(fā)現(xiàn),5個(gè)保守基序分布于此家族。21個(gè)基因包含4個(gè)相同的保守基序。TaHP5-6D;2、TaHP5-6D;1、TaHP1-6B和TaHP5-6B具有特異性基序,使它們在同一進(jìn)化分支上。HP家族的大部分成員的基序數(shù)量和類型分布說明基序結(jié)構(gòu)的保守性,這可能與HPt結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)功能有關(guān)。

2.4 小麥HP家族基因的順式作用元件分析

為探究小麥HP家族基因可能參與的生物過程,對其家族成員的啟動子的順式作用元件進(jìn)行注釋分析。圖3結(jié)果表明,HP家族基因的啟動子區(qū)域的注釋功能主要涉及多種逆境,包括光、激素、低溫、干旱等。激素響應(yīng)元件包括脫落酸、木質(zhì)素、赤霉素相關(guān)元件。此外,厭氧誘導(dǎo)、分生組織表達(dá)、晝夜節(jié)律調(diào)控等應(yīng)答元件也被發(fā)現(xiàn)。每個(gè)基因都包含光響應(yīng)元件。大部分基因包含植物激素響應(yīng)元件。26個(gè)基因包含茉莉酸甲酯響應(yīng)元件,28個(gè)基因包含脫落酸響應(yīng)元件,26個(gè)基因包含厭氧響應(yīng)元件,26個(gè)基因包含木質(zhì)素響應(yīng)元件,23個(gè)基因包含低溫響應(yīng)元件,20個(gè)基因包含干旱響應(yīng)元件,19個(gè)基因包含赤霉素響應(yīng)元件。以上結(jié)果表明,小麥HP家族基因在應(yīng)答非生物逆境脅迫的生物過程中可能發(fā)揮多方面功能,說明此基因家族在小麥生物學(xué)過程中可能具有復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制。

圖3 小麥HP家族基因的順式作用元件分析Fig.3 Analysis of cis-acting elements of HP family genes in wheat

2.5 小麥HP家族基因的表達(dá)模式分析

為了解小麥HP家族基因在不同環(huán)境條件下的表達(dá)變化,利用expVIP數(shù)據(jù)庫[28]的36個(gè)條件(包括非生物脅迫和生物脅迫)下的表達(dá)數(shù)據(jù)分析HP家族基因的表達(dá)模式。圖4結(jié)果顯示,在不同生長發(fā)育時(shí)期和調(diào)控條件下,HP家族的各個(gè)基因的表達(dá)情況存在很大差異,呈現(xiàn)多樣化。TaHP1-4B;1、TaHP1-4A;1、TaHP1-4D;2基因在各個(gè)條件下均具有較高表達(dá)水平。15個(gè)基因表達(dá)量很低或者未檢測到表達(dá)。TaHP2-6D;2、TaHP4-3A、TaHP4-3B、TaHP4-3D、TaHP4-1B、TaHP4-4D和TaHP5-6B基因在不同的環(huán)境條件表達(dá)量較高,但存在很大差異。以上結(jié)果說明,小麥HP家族基因在應(yīng)答環(huán)境脅迫中表達(dá)模式存在顯著的多樣性。

log2(tpm) 顏色從左到右表示基因表達(dá)量從低到高。log2(tpm) color from left to right represents the gene expression level from low to high.圖4 熱圖分析展示小麥HP家族基因的表達(dá)模式Fig.4 Heatmap analysis showing the expression patterns of HP family genes in wheat

磷在植物生長發(fā)育中具有關(guān)鍵作用,磷脅迫是植物非生物脅迫的重要因素之一。為解析HP基因在小麥磷脅迫中的調(diào)控機(jī)制,進(jìn)一步分析HP家族基因在低磷脅迫條件下的表達(dá)情況。研究通過qRT-PCR試驗(yàn)評價(jià)了在表達(dá)譜分析中表達(dá)量顯著的TaHP1-4B;1等6個(gè)基因的表達(dá)趨勢。圖5結(jié)果顯示,各個(gè)時(shí)間展示的基因表達(dá)量存在很大差異說明這些基因在應(yīng)答低磷脅迫中可能具有復(fù)雜的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制。TaHP1-4B;1在24 h內(nèi)受到誘導(dǎo)表達(dá),在24 h后受到抑制表達(dá)。TaHP1-4A;1、TaHP1-4D;2、TaHP2-6D;2、TaHP4-4D和TaHP5-6B在12 h表達(dá)量下降,說明這些基因受到抑制表達(dá)。TaHP5-6B在低磷脅迫12～72 h表達(dá)水平明顯上調(diào),說明受到強(qiáng)烈的誘導(dǎo)表達(dá),暗示其在應(yīng)答低磷脅迫過程中可能發(fā)揮更重要的作用。

圖5 小麥HP家族的6個(gè)基因在低磷條件下的表達(dá)水平Fig.5 Relative expression levels of six HP genes under low phosphorus supply

3 討論與結(jié)論

高通量測序技術(shù)的發(fā)展促使植物基因組信息不斷完善,為挖掘重要性狀的基因資源以及其進(jìn)化特征提供了數(shù)據(jù)支撐[15-17,19,30-33]。本研究利用生物信息方法從更新的普通小麥基因組中共鑒定出31個(gè)HP家族基因。每個(gè)基因均包含了保守的HPt結(jié)構(gòu)域,但在進(jìn)化過程中存在很多氨基酸序列變異,說明此家族基因可能受到逆境脅迫的進(jìn)化壓力影響。每個(gè)基因的編碼氨基酸數(shù)量為116～200個(gè),大部分在140個(gè)左右。小麥和其他7種植物的HP蛋白序列比較分析表明,HP蛋白的結(jié)構(gòu)域序列在植物中是高度保守的;基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析同樣支持了HP家族基因的保守性,這符合其他相關(guān)研究的植物HP家族基因在進(jìn)化上保守性的結(jié)果[12,15-17]。

植物HP基因的不同成員在應(yīng)答非生物脅迫的生物學(xué)過程中可能扮演著不同的重要角色[12-13,15,17]。順式作用元件分析表明,小麥HP家族基因的調(diào)控區(qū)域包含大量的與光反應(yīng)、激素、干旱、低溫等非生物脅迫響應(yīng)相關(guān)的調(diào)控元件,說明小麥HP基因的進(jìn)化及參與的生物過程可能受到非生物脅迫的顯著影響。利用多種脅迫條件下的基因表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn),HP家族基因在應(yīng)答非生物脅迫過程中的基因表達(dá)模式存在多樣性,說明HP基因可能具有復(fù)雜的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。因此,小麥HP家族基因與非生物脅迫響應(yīng)存在相關(guān)性。

磷脅迫響應(yīng)是植物抵御非生物脅迫的重要環(huán)節(jié),低磷應(yīng)答基因的鑒定有助于培育磷營養(yǎng)高效的作物。研究發(fā)現(xiàn),MYB-CC[34]、SPX[35]、MADS-box[36]、SAP[33]等基因家族成員是小麥磷脅迫響應(yīng)的重要基因資源。本研究從表達(dá)譜數(shù)據(jù)中篩選到在非生物脅迫下的6個(gè)高表達(dá)基因,通過qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)它們在低磷脅迫條件下不同時(shí)期的表達(dá)水平同樣存在差異。TaHP5-6B在非生物脅迫的多種條件和不同組織中表達(dá)量較高,qRT-PCR分析顯示在低磷脅迫下受到強(qiáng)烈的誘導(dǎo)表達(dá)。因此,這些HP家族成員可能與低磷脅迫響應(yīng)密切相關(guān)。

綜上,本研究鑒定到普通小麥的31個(gè)HP家族基因,HP家族序列具有保守性;基因啟動子涉及多種與逆境脅迫相關(guān)的順式作用元件;在非生物脅迫條件下的基因表達(dá)模式存在多樣性。HP家族基因的解析為探究HP基因在小麥逆境響應(yīng)中的生物學(xué)功能提供重要信息,有助于為分子育種提供抗逆基因資源。