盧洪梅，李耿，葉欣桐，羅藝佳，魏澤蔚，鐘月圓，羅怡鈺，賴艷妮，阮永隊 （. 廣東醫(yī)科大學附屬東莞第一醫(yī)院，廣東 東莞 5700；. 廣州中醫(yī)藥大學，廣東 廣州 50006；. 廣東醫(yī)科大學，廣東 東莞 5808）

2022年2 月至4月，東莞市第九人民醫(yī)院收治了大量新型冠狀病毒感染（COVID-19）患者，主要臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、乏力、咳嗽，伴有鼻塞、流涕、咽痛、肌肉酸痛、納差、惡心、腹瀉、腹脹等癥狀，舌象以舌質(zhì)淡較多，厚膩苔，甚至腐苔，苔色黃或白，舌體偏胖大，有齒痕。其臨床表現(xiàn)符合中醫(yī)寒濕疫的辨證特點，病機可概括為寒濕疫毒內(nèi)盛，肺脾陽氣虛弱，寒飲阻肺，寒濕困脾。寒濕疫毒乘肺脾陽氣之虛，從口、鼻、眼結(jié)膜而入，傷及肺衛(wèi)或直中太陰。寒濕疫毒與衛(wèi)氣相搏，表現(xiàn)出發(fā)熱；寒濕直中太陰，出現(xiàn)腹瀉等癥；寒濕困脾，出現(xiàn)不欲飲食、乏力、腹脹、惡心；寒毒損傷肺衛(wèi)，肺中津液受寒，化為水飲，瘀阻肺絡，出現(xiàn)咳嗽。廣東醫(yī)科大學附屬東莞第一醫(yī)院中醫(yī)研究團隊結(jié)合前期臨床成果[1-2]，基于該病發(fā)病的病因病機，擬定加味小青龍湯合達原飲用于治療COVID-19。加味小青龍湯合達原飲由熟附子、干姜、麻黃、苦杏仁、姜半夏、黃芩、厚樸等組成，功效溫陽扶正、散寒化飲、祛痰解毒。臨床觀察到該方對于控制COVID-19癥狀具有明顯的臨床療效，且優(yōu)于常規(guī)綜合治療。故對其治療COVID-19 的臨床療效進行回顧性總結(jié)，并用網(wǎng)絡藥理學方法探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 臨床總結(jié)

1.1.1 一般資料 病例來源于東莞市第九人民醫(yī)院（為東莞市衛(wèi)生健康局指派廣東醫(yī)科大學附屬東莞第一醫(yī)院中醫(yī)醫(yī)療組駐點支援單位）2022 年2 月至4 月間確診為COVID-19患者，回顧性收集病例的臨床資料、治療方案及臨床療效。將患者按照治療方案分為加味小青龍湯合達原飲組（治療組）和常規(guī)治療組（對照組）。治療組121 例，女性71 例，男性50 例，平均年齡（46±14）歲；對照組115例，女性63例，男性52例，平均年齡（45±13）歲。兩組病例性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.1.2 納入標準 年齡18周歲以上；符合新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第八版修訂版）的診斷標準[3]，臨床分型為輕型和普通型，中醫(yī)辨證為寒濕阻肺證型。

1.1.3 排除標準 嚴重肝腎功能不全的患者、懷孕或者哺乳期婦女、精神病患者、同一指標治療前后數(shù)據(jù)不全的患者；體溫≥38.5 ℃；對藥物成分過敏者；依從性較差者。

1.1.4 干預措施 對照組患者給予物理降溫，解熱、祛痰止咳、抗感染藥物等常規(guī)綜合治療。治療組患者在常規(guī)綜合治療的基礎上，給予加味小青龍湯合達原飲（熟附子10 g，干姜5 g，炙甘草15 g，麻黃5 g，苦杏仁5 g，桂枝10 g，白芍10 g，細辛5 g，五味子5 g，姜半夏10 g，檳榔10 g，草果10 g，黃芩5 g，厚樸10 g 組成），每日一劑，水煎至300 mL，分3次溫服，兩組療程均為7 d。

1.1.5 臨床療效評價 治療1 周后，以病毒檢測轉(zhuǎn)陰率[3]為臨床療效評價指標，新型冠狀病毒核酸檢測N基因和ORF 基因循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct 值）均≥35判定為陰性（熒光定量PCR方法）。

1.1.6 中醫(yī)證候療效評價 中醫(yī)證候包括發(fā)熱、惡寒、乏力、咳嗽、咳痰、鼻塞、流涕、咽痛、肌肉酸痛、納差、惡心、腹瀉、腹脹，厚膩苔。每個癥狀按無、輕、中、重分別評0～3分，分值越高，癥狀越嚴重。顯效：患者臨床癥狀明顯緩解，療效指數(shù)≥70%。有效：臨床癥狀有所緩解，30%≤療效指數(shù)＜70%。無效：臨床癥狀改善未達到以上標準者?？傆行?（顯效例數(shù)＋有效例數(shù)）/總病例數(shù)×100%。

1.1.7 觀察指標 ①炎癥指標：C 反應蛋白（CRP）、白細胞介素6（IL-6）、白細胞計數(shù)（WBC）等。②退熱指標：體溫（腋溫），治療后每30 min 測量1 次并記錄，體溫降至正常后每2 h 測量1 次并記錄。退熱時間：從治療開始至體溫降至正常（≤37.2 ℃），不再反彈超過24 h。

1.1.8 不良反應觀察 記錄治療期間不良事件和血常規(guī)、凝血功能、心肌酶、肝腎功能。

1.1.9 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料用率或構(gòu)成比表示，組間比較用χ2檢驗；計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較用獨立樣本t檢驗，治療前后比較用配對t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.2 網(wǎng)絡藥理學研究

1.2.1 加味小青龍湯合達原飲活性成分及其靶點的預測 從TCMSP 數(shù)據(jù)庫（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）中檢索加味小青龍湯合達原飲組方中藥熟附子、干姜、炙甘草、麻黃、苦杏仁、桂枝、白芍、細辛、五味子、姜半夏、檳榔、草果、黃芩、厚樸的化學成分。同時以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18為篩選條件，篩選其活性成分。通過PubChem 數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）獲取各活性成分的SMILES號，利用SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫（http://www.swisstargetprediction.ch/）預測活性成分的潛在靶點，以Probability≥0.20 為篩選條件，獲得活性成分對應的靶點。利用Uniprot數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）規(guī)范所得靶點的基因名稱并去重。

1.2.2 COVID-19 疾病靶點的獲取 以COVID-19 和SARS-CoV-2 為關鍵詞，分別在PubChem 數(shù)據(jù)庫、TTD數(shù)據(jù)庫（http://db.idrblab.net/ttd/）、GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org）、 DisGeNEt 數(shù)據(jù)庫（https://www.disgenet.org/）、DrugBank 數(shù)據(jù)庫（https://go.drugbank.com/）、PharmGKB 數(shù)據(jù)庫（https://www.pharmgkb.org/）等6 個數(shù)據(jù)庫進行檢索，獲取COVID-19 的相關疾病靶點。其中，GeneCards 數(shù)據(jù)庫以score≥2為篩選條件，DisGeNEt數(shù)據(jù)庫以N.PMIDs＞1為篩選條件，其余4 個數(shù)據(jù)庫所得疾病靶點直接采用，最后利用Uniprot 數(shù)據(jù)庫規(guī)范疾病靶點的基因名稱并去重。通過Immport 數(shù)據(jù)庫（https://www.immport.org/shared/home）獲得免疫相關基因集，即免疫相關靶點。將活性成分靶點、疾病靶點、免疫相關靶點取交集，繪制藥物-疾病-免疫相關交集靶點韋恩（Venn）圖。

1.2.3 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡構(gòu)建及核心靶點的篩選 將交集靶點上傳至String 11.5 數(shù)據(jù)庫（https://string- db.org）， 將物種選擇為“Homo sapiens”“Highest confiden＞0.4”，其余參數(shù)為默認設置。獲得靶點間的相互作用關系并導出TSV 文件，并導入Cytoscape 3.7.0 軟件中進行可視化，獲得PPI 網(wǎng)絡圖；并使用其插件Network Analyze 分析PPI 拓撲參數(shù)，以度值（Degree）排前10位的靶點為核心靶點。

1.2.4 GO功能與KEGG通路富集分析 將交集靶點導入Metascape 生物學信息注釋數(shù)據(jù)庫（http://metascape.org），對交集靶點進行GO 功能及KEGG 通路富集分析，選定物種為“Homo sapiens”。GO 功能分析包括生物過程（Biological Process， BP）、 細胞組分（Cellular Component，CC）和分子功能（Molecular Function，MF）。選取GO功能及KEGG通路富集分析結(jié)果中l(wèi)og10（P值）排前10 位的條目，通過R 4.1.1 分別繪制柱狀圖。

1.2.5 構(gòu)建“活性成分-交集靶點”網(wǎng)絡 使用Cytoscape 3.7.0 軟件構(gòu)建加味小青龍湯合達原飲“活性成分-靶點”網(wǎng)絡。通過Cytoscape軟件中的CytoNCA插件，分析其網(wǎng)絡特征參數(shù)，包括度值（Degree）、介數(shù)中心性（Betweenness Centrality）、接近中心性（Closeness Centrality）、聚類系數(shù)（Clustering Coefficient）、平均最短路徑長度（Average Shortest Path Length）等，并選取Degree 值排前5 位的活性成分作為主要活性成分。

1.2.6 關鍵靶點與主要活性成分的分子對接分析 應用PDB數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org/）檢索并下載關鍵靶點的3D結(jié)構(gòu)PDB 格式文件，并使用全自動蛋白質(zhì)結(jié)果同源建模服務器（Swiss-model）進行同源建模以補全丟失的環(huán)區(qū)（Loop）。同時，從PubChem 數(shù)據(jù)庫中檢索并下載“活性成分-交集靶點”網(wǎng)絡中Degree值前10 位的活性成分的3D 結(jié)構(gòu)PDB 文件。使用Autodock Tools 1.5.6 和Autodock Vina 1.1.2 軟件進行分子對接，對接盒子中心坐標為受體中原配體的中心坐標。

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床療效比較治療1周后，對照組患者病毒檢測轉(zhuǎn)陰29 例，轉(zhuǎn)陰率為25.2%，治療組患者病毒檢測轉(zhuǎn)陰38 例，轉(zhuǎn)陰率為31.4%，兩組患者轉(zhuǎn)陰率比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 兩組新型冠狀病毒感染患者治療1 周后轉(zhuǎn)陰率比較Table 1 Comparison of negative conversion rates between two groups of patients infected with COVID-19 after one week of treatment

2.2 兩組中醫(yī)證候療效比較治療組患者中醫(yī)證候療效顯效率為24.0%（29/121），總有效率為87.6%（106/121），均顯著高于對照組的12.2%（14/115）和66.1%（76/115）（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組新型冠狀病毒感染患者中醫(yī)證候療效比較[例（%）]Table 2 Comparison on curative effect of traditional Chinese medicine syndrome between two groups of patients infected with COVID-19[case（%）]

2.3 兩組炎癥指標比較治療前組患者外周白細胞數(shù)及CRP 和IL-6水平均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與治療前比較，兩組患者治療后外周血白細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；兩組患者CRP 和IL-6 水平均顯著降低（P＜0.05），且治療組患者CRP和IL-6水平顯著低于對照組（P＜0.05）。見表3。

表3 兩組新型冠狀病毒感染患者炎癥指標結(jié)果比較（ ±s）Table 3 Comparison of inflammatory indexes between two groups of patients infected with COVID-19（ ±s）

表3 兩組新型冠狀病毒感染患者炎癥指標結(jié)果比較（ ±s）Table 3 Comparison of inflammatory indexes between two groups of patients infected with COVID-19（ ±s）

注：與治療前比較，△P＜0.05；與對照組比較，*P＜0.05

組別對照組治療組例數(shù)/例115 121 WBC/（×109·L-1）治療前6.55±1.68 6.28±1.46治療后17.72±1.62△12.16±2.27*△治療后6.38±1.64 6.21±1.42 IL-6/（pg·mL-1）治療前9.01±1.42 9.02±1.28治療后5.97±0.71△4.64±1.00*△CRP/（mg·L-1）治療前34.35±4.67 33.72±5.09

2.4 退熱時間比較治療后，治療組體溫降至正?；颊叩陌俜致蕿?7.6%（106/121），明顯高于對照組的66.1%（76/115）（P＜0.05）。治療組患者完全退熱時間明顯短于對照組（P＜0.05）。見表4。

表4 兩組新型冠狀病毒感染患者完全退熱時間比較（ ±s）Table 4 Comparison of the time to complete relief of fever between two groups of patients infected with COVID-19（ ±s）

表4 兩組新型冠狀病毒感染患者完全退熱時間比較（ ±s）Table 4 Comparison of the time to complete relief of fever between two groups of patients infected with COVID-19（ ±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05

退熱時間/h 57.13±9.42 33.99±8.87*組別對照組治療組例數(shù)/例115 121體溫/[例（%）]≤37.2 ℃76（66.1）106（87.6）*＞37.2 ℃39（33.9）15（12.4）*

2.5 兩組不良反應比較治療期間，對照組出現(xiàn)惡心4 例，輕度腹瀉2 例，納差2 例，不良事件發(fā)生率為6.96%；治療組出現(xiàn)頭暈1 例，惡心3 例，輕度腹瀉3 例，納差2 例，不良事件總發(fā)生率為5.79%，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。所有患者未經(jīng)特殊治療，不適癥狀均自行緩解。兩組治療前后血常規(guī)、凝血功能、心肌酶、肝腎功能均無異常變化，提示加味小青龍湯合達原飲治療COVID-19的安全性較好。

2.6 加味小青龍湯合達原飲的活性成分及其靶點的獲取共獲得加味小青龍湯合達原飲組方中藥的活性成分101 個，其中炙甘草18 個、麻黃13 個、熟附子5 個、苦杏仁9 個、草果7 個、黃芩15 個、檳榔4 個、干姜2個、白芍5個、桂枝6個、細辛2個、姜半夏10個、五味子1個、厚樸4個；對應的活性成分靶點共220 個。 從GeneCards、 TTD、 Disgenet、DrugBank、PharmGKB、PubChem 數(shù)據(jù)庫分別獲得疾病靶點1 346、65、765、21、4 和215 個。將所得靶點通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫進行驗證，去重后得到COVID-19相關疾病靶點2 004個。通過Immport數(shù)據(jù)庫收集免疫相關基因靶點，去重后得到1 793個免疫相關靶點。將加味小青龍湯合達原飲的預測成分靶點、COVID-19 的疾病靶點和免疫相關靶點取交集，獲得交集靶點34 個，作為加味小青龍湯合達原飲治療COVID-19的相關靶點。見圖1。

圖1 加味小青龍湯合達原飲治療新型冠狀病毒感染的藥物成分-疾病-免疫相關靶點交集的韋恩（Venn）圖Figure 1 Venn diagram for intersection of related targets of drug components-diseases-immune

2.7 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡的構(gòu)建及核心靶點的獲得將34 個交集靶點上傳至String 11.5 數(shù)據(jù)庫，獲得蛋白相互作用網(wǎng)絡，并利用Cytoscape 3.7.0優(yōu)化加味小青龍湯合達原飲治療COVID-19 靶蛋白的PPI網(wǎng)絡。以Degree值為指標，繪制Degree值-節(jié)點相關的網(wǎng)絡圖，即節(jié)點的大小由degree值決定。degree值越大說明該蛋白重要性越大。見圖2。將Degree值排前10 位的靶點作為網(wǎng)絡核心靶點，包括AKT1、VEGFA、 EGFR、 MMP9、 PTGS2、 PPARG、 IL2、ICAM1、RELA、PIK3R1。見表5。

圖2 加味小青龍湯合達原飲治療新型冠狀病毒感染交集靶點的PPI 網(wǎng)絡圖Figure 2 PPI network of intersection targets of Modified Xiaoqinglong Decoction and Dayuan Decoction in treating COVID-19

表5 加味小青龍湯合達原飲治療新型冠狀病毒感染核心靶點的網(wǎng)絡拓撲學參數(shù)Table 5 Network topological parameters of the key targets of modified Xiaoqinglong Decoction and Dayuan Decoction in treating COVID-19

2.8 GO 功能和KEGG 通路富集分析將交集靶點導入Metascape 生物學信息注釋數(shù)據(jù)庫，進行GO 功能和KEGG 通路富集分析。分子功能（Molecular Function，MF）富集結(jié)果FDR 值前3 位包括核受體活性（nuclear receptor activity）、配體活化轉(zhuǎn)錄因子活性（ligand-activated transcription factor activity）、蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性（protein serine/threonine/tyrosine kinase activity）。 生物過程（Biological Process，BP）富集結(jié)果FDR 值前3位包括正向調(diào)節(jié)蛋白磷酸化（positive regulation of protein phosphorylation）、激素反應（response to hormone）、細胞對激素刺激的反應（cellular response to hormone stimulus）。細胞組分（Cellular Component，CC）富集結(jié)果FDR 值前3 個包括膜筏（membrane raft）、 膜微域（membrane microdomain）、 受體復合物（receptor complex）。KEGG 通路富集結(jié)果中FDR 值前5 位包括癌癥通路（Pathways in cancer）、PI3K-Akt 信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、 Ras 信號通路（Ras signaling pathway）、前列腺癌（Prostate cancer）、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥（EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance）。見圖3。結(jié)果提示加味小青龍湯合達原飲可通過多靶點、多途徑發(fā)揮治療COVID-19 的作用。

圖3 加味小青龍湯合達原飲治療新型冠狀病毒感染的交集靶點的富集分析Figure 3 Enrichment analysis of intersection targets of Modified Xiaoqinglong Decoction and Dayuan Decoction in treating COVID-19

2.9 構(gòu)建“中藥-活性成分-交集靶點”網(wǎng)絡分析網(wǎng)絡的拓撲結(jié)構(gòu)性質(zhì)能為藥物-靶點相互作用機制提供重要信息。將加味小青龍湯合達原飲的活性成分及其作用靶點信息導入Cytoscape 3.7.0 軟件繪制和分析“中藥-活性成分-交集靶點”網(wǎng)絡（見圖4），結(jié)果顯示該網(wǎng)絡中共有114個節(jié)點和223條相互關系。網(wǎng)絡中某些節(jié)點比其他節(jié)點更為集中，即藥物-靶點相互作用網(wǎng)絡偏向某些化合物和蛋白質(zhì)。從表6可知，參與高度連接的分子或靶點在加味小青龍湯合達原飲治療COVID-19的作用機制中起到關鍵作用。

圖4 加味小青龍湯合達原飲中藥-活性成分-靶點可視化網(wǎng)絡Figute 4 Visual network of herbs in Modified Xiaoqinglong Decoction and Dayuan Decoction-active ingredients-targets

表6 加味小青龍湯合達原飲主要活性成分基本信息Table 6 Basic information of main active ingredients in Modified Xiaoqinglong Decoction and Dayuan Decoction

2.10 分子對接結(jié)果將獲得的10個關鍵靶點與“活性成分-交集靶點”網(wǎng)絡中度值前5 位的主要活性成分進行分子對接。最低結(jié)合效能小于-5 kcal·mol-1的共有40 對。見表7。結(jié)果顯示，其核心活性成分與AKT1、EGFR、 PPARG、PTGS2親和力均較好。

表7 加味小青龍湯合達原飲核心活性成分與關鍵靶點的分子對接結(jié)果Table 7 Molecular docking results of the core active ingredients and key targets of Modified Xiaoqinglong Decoction and Dayuan Decoction

3 討論

中醫(yī)藥在治療COVID-19的過程中發(fā)揮了重要的作用。2022 年2 月至4 月期間在東莞地區(qū)爆發(fā)的COVID-19 的疫情，符合中醫(yī)寒濕疫的臨床辨證特點。本研究團隊結(jié)合李可老中醫(yī)重用制附子等溫陽思路[4]，基于寒濕疫論治COVID-19 的機理，選用小青龍湯、四逆湯、達原飲加減，擬定加味小青龍湯合達原飲治療COVID-19。小青龍湯、四逆湯均源自東漢張仲景所撰《傷寒論》。小青龍湯具有解表散寒、溫肺化飲的功效，能顯著減少炎性細胞的數(shù)量、抑制炎性細胞的浸潤，通過抑制Th2細胞亞群而抑制炎癥反應，具有良好的抗過敏、抗炎、止咳平喘的作用[5]。四逆湯具有回陽救逆、溫中祛寒之功，能有效改善患者陽虛體質(zhì)，以扶正抗邪。達原飲出自于明代疫病學家吳又可的《溫疫論》，為溫疫穢濁毒邪伏于膜原而設，具有抗病毒、解熱、抗炎作用，已應用于COVID-19 濕邪郁肺證的治療[6]。三方合用形成的加味小青龍湯合達原飲，共奏溫陽扶正、散寒化飲、祛痰解毒之功，對COVID-19患者發(fā)熱、咳嗽有十分顯著的療效，能有效防止患者進展為重癥肺炎[7-8]。

本研究納入236 例寒濕阻肺證型COVID-19 患者，治療組加用加味小青龍湯合達原飲后，完全退熱療效明顯優(yōu)于對照組，退熱更快，不易復升；治療組中醫(yī)證候顯效率和總有效率均優(yōu)于對照組，顯示該方可明顯改善COVID-19患者臨床癥狀，能促進疾病恢復，且安全性較好。

CRP、IL-6是血清學炎癥指標，當機體發(fā)生感染時可迅速升高。CRP在感染后4～6 h迅速升高，40～50 h 到達峰值，最高可達正常生理狀態(tài)的1 000 倍。IL-6 為單核細胞活化后釋放，用于提示炎癥感染的輕重程度及預后。IL-6 比CRP 升高更早、下降更快、幅度更大，可以更加迅速地反映患者病情變化[9]。阮永隊等[10]以脂多糖誘導的小鼠肺組織炎癥模型觀察加味小青龍湯的抗炎作用，結(jié)果顯示其可顯著抑制IL-6 mRNA 表達。本研究發(fā)現(xiàn)，治療后治療組CRP、IL-6 均明顯下降，且優(yōu)于對照組，說明加味小青龍湯合達原飲有抗炎或輔助抗炎的作用。

網(wǎng)絡藥理學研究表明，加味小青龍湯合達原飲治療COVID-19 的主要活性成分為木犀草素、異鼠李素、山柰酚、檞皮素和草質(zhì)素，均為黃酮類成分。研究[11]證實，木犀草素可以特異性結(jié)合新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）表面刺突蛋白，抑制病毒進入宿主細胞，并抑制SARS-CoV-2 3CL蛋白酶的表達。異鼠李素可直接與SARS-CoV-2 的受體ACE2 結(jié)合，防止SARS-CoV-2 病毒進入和感染，抑制表達ACE2 的細胞，起到直接的抗病毒作用[12]。木犀草素可抑制TNF-α 激活的內(nèi)皮細胞中IL-6的生成，有抗氧化的作用，調(diào)節(jié)病毒刺激的肥大細胞產(chǎn)生IL-1β和組胺引起的細胞因子風暴，還可抑制PI3K/Akt介導的NF-κB和MAPK 的信號通路，下調(diào)促炎細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS 和COX-2 的基因表達，來緩解炎癥反應[13]。檞皮素和草質(zhì)素可以阻斷SARS-CoV-2 3CL 蛋白酶的水解活性，干擾病毒感染[14-15]。另外，檞皮素和異鼠李素也能抑制NF-κB 信號通路，有效降低炎癥因子水平[16-17]。因此黃酮類化合物可通過調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)、抑制內(nèi)皮細胞活化來平衡機體的免疫系統(tǒng)和調(diào)節(jié)SARS-CoV-2感染期間的細胞因子風暴來治療COVID-19，進一步驗證了該方劑治療COVID-19有潛在作用。

PPI 網(wǎng)絡拓撲分析顯示，加味小青龍湯合達原飲能夠通過作用于EGFR、RELA、ICAM-1、MMP9 等核心靶點發(fā)揮治療作用。SARS-CoV-2 感染可活化EGFR 介導病毒進入宿主細胞并抑制干擾素信號傳導，因此靶向抑制EGFR，可發(fā)揮其抗病毒作用[18]。RELA 是NF-κB/Ral 蛋白家族中的重要成員，而SARS-CoV-2 中的非結(jié)構(gòu)蛋白能夠激活NF-κB 信號通路誘導炎癥因子表達促發(fā)炎性因子風暴，靶向RELA 阻斷炎性因子風暴的產(chǎn)生是防治COVID-19 的有效途徑[19]。ICAM-1 是炎癥細胞聚集在炎癥部位最重要的黏附分子，可增加白細胞和肺血管內(nèi)皮細胞之間的黏附，引起炎癥細胞的浸潤。肺組織間的炎癥細胞分泌大量的炎性介質(zhì)，誘導肺部炎癥致內(nèi)皮-上皮屏障的破壞，增加了肺泡毛細血管膜的通透性，肺部浸潤和水腫[20]。同時，MMP9由中性粒細胞和巨噬細胞分泌，其可促進炎癥和肺泡毛細血管屏障的降解[21]。因此，降低ICAM-1 和MMP9 的表達和分泌，可有效保護肺泡上皮-內(nèi)皮屏障，緩解肺部炎癥。分子對接結(jié)果顯示，加味小青龍湯合達原飲活性成分與核心靶點間具有較好的結(jié)合活性，提示加味小青龍湯合達原飲可通過靶向這些核心靶點發(fā)揮抗病毒、抗炎和保護肺泡上皮-內(nèi)皮屏障的作用，從而達到防治COVID-19的目的。

KEGG信號通路富集分析顯示，加味小青龍湯合達原飲治療COVID-19 的主要作用與PI3K-Akt 信號通路、Ras 信號通路、MAPK 信號通路等相關。PI3K-Akt 信號通路能調(diào)節(jié)炎癥反應細胞的活化和炎癥介質(zhì)的釋放，在肺和氣道的慢性炎癥反應中發(fā)揮作用。同時，血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）激活PI3K-Akt通路，觸發(fā)TGF-β1 活化和R-Smad 蛋白（Smad 2/3）磷酸化，導致成纖維細胞過度增殖和分化[22-23]。ACE2表達下調(diào)，可拮抗RAS 系統(tǒng)的激活，降低危重癥COVID-19 患者的心血管死亡率[24]。MAPK 過度激活可介導炎癥細胞因子L-1β、IL6、IL10、TNF-α、L4和INF-γ的大量生成，引發(fā)細胞因子風暴，導致肺泡組織受傷、肺通氣減少、急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征[25]。這些信號通路可調(diào)節(jié)細胞因子和炎癥因子的表達，通過調(diào)節(jié)上述信號通路可減輕炎癥反應和氧化應激反應。

綜上所述，加味小青龍湯合達原飲治療COVID-19療效確切，能顯著改善患者炎性指標，緩解患者癥狀。網(wǎng)絡藥理學和分子對接研究結(jié)果表明，加味小青龍湯合達原飲可通過多活性成分、多靶點、多通路抑制病毒感染，調(diào)節(jié)氧化應激反應、炎癥反應和免疫反應，從而發(fā)揮抗COVID-19的藥理作用。但本研究僅從數(shù)據(jù)分析角度進行預測，需要進一步實驗驗證。