張志超, 王 珺, 霍忠明, 聶鴻濤, 閆喜武, 丁鑒鋒

(1.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,遼寧大連 116023; 2.遼寧省貝類良種繁育工程技術(shù)研究中心,遼寧大連 116023)

牛磺酸別稱2-氨基乙烷磺酸鹽,是一種廣泛分布在人類和動(dòng)物體內(nèi)的小分子含硫氨基酸,在哺乳動(dòng)物的神經(jīng)發(fā)育、生殖系統(tǒng)發(fā)育、糖類代謝、脂類代謝和免疫和調(diào)節(jié)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[1]。?；撬嵋彩秦愵愔饕挠坞x氨基酸之一,在抗逆、生長(zhǎng)、發(fā)育和免疫等過(guò)程發(fā)揮重要的作用。貝類,尤其是在潮間帶和灘涂環(huán)境中生存的貝類,由于潮汐、降雨和河流匯集等因素,會(huì)導(dǎo)致其環(huán)境鹽發(fā)生劇烈的變化,在應(yīng)對(duì)鹽度變化的過(guò)程中,細(xì)胞內(nèi)高濃度的牛磺酸發(fā)揮重要作用[2-4]。在高鹽度環(huán)境中,細(xì)胞外?；撬徂D(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)[5-6];而在低滲環(huán)境下,牛磺酸則會(huì)擴(kuò)散至細(xì)胞外,以維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡[7]。此外,研究發(fā)現(xiàn),貽貝(Mytilusgalloprovincialis)鰓組織的表面積和牛磺酸含量呈顯著負(fù)相關(guān)[8]。對(duì)不同生長(zhǎng)速度的貽貝稚貝的研究表明,生長(zhǎng)速度快的稚貝具有更大的鰓表面積而使其具有更高的濾食效率[9]。Babarro等對(duì)相同養(yǎng)殖條件下珍珠貝(Pinctadafucata)的轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn),不同規(guī)格的珍珠貝?；撬岷铣上匏倜赴腚讈喕撬崦擊让傅谋磉_(dá)量存在顯著差異[10]。因此,貝類體內(nèi)的?；撬峥赏ㄟ^(guò)影響其攝食能力而對(duì)其生長(zhǎng)過(guò)程產(chǎn)生影響。此外,動(dòng)物體內(nèi)的?；撬峥赏ㄟ^(guò)其滲透壓調(diào)節(jié)、抗氧化和類胰島素樣作用及促細(xì)胞增殖效應(yīng)等途徑促進(jìn)體外培養(yǎng)胚胎的發(fā)育[11-13]。在貝類的發(fā)育過(guò)程中,?；撬嵋餐瑯泳哂兄匾饔?紅鮑(Haliotisrufescens)需要通過(guò)其卵細(xì)胞中的牛磺酸,維持其胚胎到幼蟲(chóng)發(fā)育到變態(tài)前體內(nèi)恒定的?；撬岷?保證胚胎的正常發(fā)育,長(zhǎng)牡蠣(Crassostreagigas)在浮游幼蟲(chóng)期體內(nèi)?；撬岷垦杆偕?能夠使其適應(yīng)環(huán)境滲透壓的劇烈變化[14]。此外,在貽貝(Mytilusedulis)血淋巴中的?；撬峥勺鳛槔鋬霰Ｗo(hù)劑在低溫環(huán)境中保持血淋巴正常的生理功能[15]。因此,對(duì)貝類?；撬岽x過(guò)程地深入了解將有助于闡明貝類生長(zhǎng)、發(fā)育和抗逆的機(jī)制。牛磺酸轉(zhuǎn)運(yùn)體是分布在細(xì)胞膜上的一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,在?；撬岽x過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[5,16]。

菲律賓蛤仔是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖貝類,其主要廣泛分布于潮間帶,環(huán)境變化劇烈,極易受高溫、低鹽和病原微生物等影響,從而導(dǎo)致生長(zhǎng)變緩、免疫力降低等問(wèn)題,嚴(yán)重時(shí)暴發(fā)大規(guī)模死亡,造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。牛磺酸對(duì)貝類的生長(zhǎng)、發(fā)育和抗逆過(guò)程,均具有重要的功能[14,16]。目前,關(guān)于貝類?；撬岽x關(guān)鍵基因?；撬徂D(zhuǎn)運(yùn)體的研究相對(duì)較少,僅在牡蠣和貽貝等幾個(gè)物種中進(jìn)行[17-19],而在菲律賓蛤仔中鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究對(duì)菲律賓蛤仔RpTauT基因進(jìn)行全基因組鑒定,對(duì)其保守基序、保守結(jié)構(gòu)域、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行分析,并對(duì)RpTauT基因的組織表達(dá)及3種殼色蛤仔低鹽脅迫過(guò)程中RpTauT基因的表達(dá)特征進(jìn)行分析,旨在闡明蛤仔RpTauT基因在抗逆過(guò)程中的作用,并初步探明其在不同殼色蛤仔抗逆性差異形成中的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)在大連海洋大學(xué)遼寧省貝類良種繁育工程技術(shù)研究中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,2021年4月,選取殼長(zhǎng)為(3.0±0.5) cm,外殼完整且活力較強(qiáng)的蛤仔個(gè)體共300枚,在50 L水體的平底塑料槽中暫養(yǎng)1周后進(jìn)行試驗(yàn),試驗(yàn)水溫為(18.0±0.5) ℃,鹽度為30。每天換水1次,早晚各投喂螺旋藻粉1次。

1.2 菲律賓蛤仔RpTauT基因鑒定、基因結(jié)構(gòu)及進(jìn)化分析

蛤仔RpTauT基因鑒定主要基于菲律賓蛤仔基因組數(shù)據(jù)(NCBI項(xiàng)目登錄號(hào)為PRJNA479743)[20]。將基因組注釋結(jié)果中與目的基因高度匹配的序列通過(guò)NCBI網(wǎng)站的在線保守區(qū)分析工具CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)、序列比對(duì)工具BlastX等在線工具結(jié)合預(yù)測(cè)候選序列的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行確認(rèn)。推測(cè)蛋白的氨基酸比對(duì)使用 BioEdit 7.09軟件的 Clustal W程序,使用Expasy的ProtScale工具(https://web.expasy.org/protscale/)預(yù)測(cè)氨基酸序列的疏水性,使用在線軟件TMHMM(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)進(jìn)行蛋白跨膜區(qū)域預(yù)測(cè),使用MEME Suite在線工具預(yù)測(cè)蛋白保守基序(motif)(https://meme-suite.org/meme/tools/meme),motif數(shù)目參數(shù)設(shè)置為 10,長(zhǎng)度設(shè)置為21～50 aa,使用Tbtools軟件進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域和motifs的可視化[21]。進(jìn)化分析使用Maga 6.0軟件,基于鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),使用iTOL(https://itol.embl.de/)在線工具進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)美化。

1.5 菲律賓蛤仔RpTauT基因組織表達(dá)分析

取3種殼色菲律賓蛤仔各2枚,冰盤(pán)上解剖,提取足、外套膜、鰓、水管、內(nèi)臟團(tuán)、性腺和唇瓣組織,液氮速凍后于-80 ℃冰箱保存,用于組織表達(dá)分析。

1.6 菲律賓蛤仔RpTauT基因低鹽脅迫表達(dá)分析

選3種殼色蛤仔橙蛤、白蛤、斑馬蛤各60枚,每組30枚,設(shè)2個(gè)平行。試驗(yàn)對(duì)照組鹽度為30‰,低鹽處理組鹽度14‰,在低鹽脅迫處理的0、8、16、24、48、72、96 h,每處理隨機(jī)選4個(gè)個(gè)體,取其水管組織,液氮速凍后于-80 ℃保存,用于基因表達(dá)分析。

1.7 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

總RNA提取采用天根生化科技(北京)有限公司的試劑盒,使用1.5%瓊脂糖電泳檢測(cè)RNA完整性,采用核酸分析儀(Thermo Nanodrop 2000C)檢測(cè)D260 nm/D280 nm值。使用寶生物工程(大連)有限公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.8 熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)

基因表達(dá)量檢測(cè)采用RT-qPCR法,以菲律賓蛤仔Tublin基因作為內(nèi)參基因,對(duì)蛤仔RpTauT基因表達(dá)量進(jìn)行分析。引物設(shè)計(jì)采用Primer Primer 5.0軟件,使用引物見(jiàn)表1。基因相對(duì)表達(dá)量計(jì)算采用2-ΔΔCT法[22]。

表1 熒光定量引物

1.9 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 菲律賓蛤仔RpTauT基因結(jié)構(gòu)及進(jìn)化分析

將推測(cè)的蛤仔RpTauT蛋白的氨基酸序列與牡蠣Crassostreagigas(NP_001292278.1)、貽貝Mytilusgalloprovincialis(BAD91313.1)、蛤蜊Phreagenaokutanii(BBK07881.1)和蝦夷扇貝Mizuhopectenyessoensis(XP_021352796.1)的序列Motifs和保守區(qū)進(jìn)行比對(duì)分析,Motif分析結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知,共鑒定出10個(gè)保守Motif。除蛤仔RpTauT5、RpTauT6和蝦夷扇貝的TauT外,均含有10個(gè)保守的motif,其中,蛤仔RpTauT5和蝦夷扇貝的TauT蛋白缺失motif 4,RpTauT6缺失mitif 2、motif 4、motif 5、motif7和motif10。保守區(qū)結(jié)構(gòu)域分析表明,蛤仔RpTauT1、RpTauT2、 RpTauT3和RpTauT4與牡蠣、貽貝和蛤蜊的TauT蛋白具有溶質(zhì)載體-6(SLC6)家族的保守結(jié)構(gòu)域,而RpTauT5和RpTauT6與蝦夷扇貝的TauT蛋白具有溶質(zhì)載體-5-6(SLC5-6)家族的保守結(jié)構(gòu)域,均為Na依賴轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白[23]。

氨基酸比對(duì)結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知,蛤仔推測(cè)的RpTauT蛋白均具有典型的溶質(zhì)載體蛋白6(SLC6)超家族的疏水結(jié)構(gòu)域,由12個(gè)跨膜片段構(gòu)成,Na+結(jié)合位點(diǎn)也高度保守。此外,用以形成二硫鍵穩(wěn)定SLC6家族轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白胞外環(huán)的半胱氨酸殘基在蛤仔RpTauT1、RpTauT2、RpTauT3和RpTauT4中也高度保守。

2.2 菲律賓蛤仔RpTauT基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

使用包括人類在內(nèi)的脊椎動(dòng)物和貝類等無(wú)脊椎動(dòng)物共34個(gè)物種的55條TauT基因序列與菲律賓蛤仔RpTauT基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),由圖3可知,脊椎動(dòng)物的TauT聚為一支,蛤仔的RpTauT與雙殼貝類的遺傳距離較近,其中,RpTauT1、RpTauT2、RpTauT3和RpTauT5與蝦夷扇貝的TauT聚為一支,RpTauT4與蛤蜊聚為一支,RpTauT6與蚌蠣(Mercenariamercenaria)的TauT聚為一支。

2.3 菲律賓蛤仔RpTauT基因的組織表達(dá)分析

由圖4可知,組織表達(dá)分析中,蛤仔RpTauT基因在檢測(cè)的組織中均有表達(dá)。RpTauT1在各組織中的表達(dá)量依次為外套膜>足、水管>性腺、唇瓣>鰓、消化腺,其中,在外套膜組織中表達(dá)量最高(P<0.05),在鰓和消化腺中表達(dá)量最低(P<0.05);RpTauT2在各組織中的表達(dá)量依次為水管>鰓、消化腺>足、外套膜>性腺、唇瓣,表達(dá)量最高在水管組織(P<0.05),性腺和唇瓣組織表達(dá)量最低(P<0.05);RpTauT3在各組織中的表達(dá)量依次為外套膜>水管、足>性腺、唇瓣>鰓、消化腺,其中,在外套膜組織中表達(dá)量最高(P<0.05),在鰓和消化腺中表達(dá)量最低(P<0.05);RpTauT4在各組織中的表達(dá)量依次為外套膜>水管>足>性腺>唇瓣>鰓、消化腺,其中,在外套膜組織中表達(dá)量最高(P<0.05),在鰓和消化腺中表達(dá)量最低(P<0.05);RpTauT5在各組織中的表達(dá)量依次為外套膜、水管>足>性腺、唇瓣>鰓、消化腺,其中,在外套膜和水管組織中表達(dá)量最高(P<0.05),在鰓和消化腺中表達(dá)量最低(P<0.05);RpTauT6在各組織中的表達(dá)量依次為水管>性腺、消化腺、足、鰓>外套膜、唇瓣,其中,在水管組織中表達(dá)量最高(P<0.05),在外套膜和唇瓣中表達(dá)量最低(P<0.05)。

2.4 3種殼色菲律賓低鹽脅迫后牛磺酸含量變化

低鹽脅迫后蛤仔體內(nèi)?；撬岷孔兓闆r見(jiàn)圖5。由圖5可知,橙蛤24 h?；撬岷匡@著升高(P<0.05),48 h含量較0 h略有升高,但不顯著(P>0.05);斑馬蛤?；撬岷恳脖憩F(xiàn)為先升高后降低的過(guò)程;而白蛤牛磺酸含量表現(xiàn)為逐漸升高的過(guò)程。

2.5 3種殼色菲律賓蛤仔RpTauT基因在低鹽脅迫下的表達(dá)

低鹽脅迫條件下,由圖6可知,3種殼色蛤仔的RpTauT基因表達(dá)量均表現(xiàn)出一個(gè)升高而后恢復(fù)繼而再升高的過(guò)程。其中,橙蛤、白蛤、斑馬蛤RpTauT1基因分別在24、72、16 h時(shí)達(dá)最高值(P<0.05),且在8、16、48、96 h,斑馬蛤RpTauT1基因表達(dá)量顯著高于其他2種殼色(P<0.05);橙蛤RpTauT2基因表達(dá)最高值出現(xiàn)在48 h(P<0.05),白蛤在8、24、 72 hRpTauT2表達(dá)量均達(dá)最高值(P<0.05),斑馬蛤在16 h達(dá)最高值(P<0.05),在0、8、24、72、96 h白蛤RpTauT2基因表達(dá)量顯著高于其他2個(gè)殼色(P<0.05),而在16、48 h,斑馬蛤RpTauT2基因表達(dá)量顯著高于其他2個(gè)殼色(P<0.05);橙蛤、白蛤、斑馬蛤RpTauT3基因最高表達(dá)量分別在24、72、16 h(P<0.05),在8、72、96 h,白蛤RpTauT3基因表達(dá)量顯著高于其他2個(gè)殼色(P<0.05);橙蛤、斑馬蛤RpTauT4基因分別在24、16 h時(shí)達(dá)最高值(P<0.05),白蛤RpTauT4基因在24、72 h達(dá)最高值(P<0.05),斑馬蛤RpTauT4基因在16 h達(dá)最高值, 并顯著高于其他2種殼色(P<0.05),而橙蛤RpTauT4基因在24 h表達(dá)量顯著高于其他2種殼色(P<0.05);橙蛤、白蛤、斑馬蛤RpTauT5基因表達(dá)量分別在24、72、16 h達(dá)最高值(P<0.05),白蛤RpTauT5基因在8、72、96 h表達(dá)量顯著高于其他2種殼色(P<0.05),斑馬蛤RpTauT5基因表達(dá)量在16 h顯著高于其他2種殼色(P<0.05);橙蛤、白蛤、斑馬蛤RpTauT6基因表達(dá)量分別在 24、24、16 h達(dá)最高值(P<0.05),白蛤RpTauT6基因表達(dá)量在8、24、72 h顯著高于其他2種殼色(P<0.05),斑馬蛤RpTauT6基因表達(dá)量在16、48、96 h均顯著高于其他兩種殼色(P<0.05)。

3 討論

3.1 蛤仔RpTauT基因結(jié)構(gòu)特征和進(jìn)化分析

?；撬?2-氨基乙磺酸)是哺乳動(dòng)物體內(nèi)主要的游離β-氨基酸之一,具有廣泛的生理功能,包括滲透調(diào)節(jié)、抗氧化、神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育和維持細(xì)胞膜穩(wěn)定性等[24-25]。牛磺酸的許多細(xì)胞保護(hù)特性基于其在細(xì)胞內(nèi)的含量,而細(xì)胞內(nèi)的?；撬嶂饕獊?lái)源于胞內(nèi)合成或者胞外轉(zhuǎn)運(yùn),合成主要由?；撬嵘锖铣擅赴腚装彼犭p加氧酶和半胱氨酸亞砜脫羧酶完成,而轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程主要由?；撬徂D(zhuǎn)運(yùn)體來(lái)完成[26]。?；撬徂D(zhuǎn)運(yùn)體是分布在細(xì)胞膜上的一類通道蛋白,通常有12個(gè)疏水性跨膜結(jié)構(gòu)域,N-和C-端位于胞內(nèi)側(cè),轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程需要Na+和Cl-結(jié)合至其胞外環(huán)狀結(jié)構(gòu)啟動(dòng),是一種鈉離子依賴性蛋白[5]。本研究通過(guò)全基因組分析在蛤仔基因組中鑒定出6個(gè)RpTauT基因,通過(guò)對(duì)貽貝、太平洋牡蠣、蛤蜊等物種TauT的結(jié)構(gòu)域、保守基序及氨基酸結(jié)構(gòu)等比較發(fā)現(xiàn),蛤仔RpTauT與不同物種尤其是雙殼貝類中的TauT蛋白具有類似的高度保守結(jié)構(gòu)域,因而推測(cè)RpTauT與其他雙殼貝類同源基因具有相似的功能,進(jìn)化分析也證實(shí)蛤仔的RpTauT與雙殼貝類具有更近的遺傳距離。

3.2 菲律賓蛤仔RpTauT基因的組織表達(dá)

研究發(fā)現(xiàn),太平洋牡蠣的TauT在鰓、性腺、血淋巴中表達(dá)量較高,而在外套膜、肝胰腺和消化道中表達(dá)量較低[18]。Hosoi等采用免疫組化方法在紫貽貝的鰓、外套膜和閉殼肌中均檢測(cè)出TauT蛋白[16]。在文蛤(M.lusoria)的鰓、外套膜、肌肉、心臟、胃和腸道組織中均檢測(cè)到TauT基因表達(dá),其在鰓和外套膜中的表達(dá)水平高于其他組織[27]。本研究中,蛤仔的RpTauT基因主要在外套膜和水管組織具有高表達(dá),這2個(gè)組織是蛤仔與外界環(huán)境的主要接觸界面,其滲透壓波動(dòng)較大,表明蛤仔RpTauT基因在滲透壓調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮重要功能,該結(jié)果與在牡蠣和文蛤中的研究結(jié)果一致。但在鰓組織中,僅RpTauT2和RpTauT6表現(xiàn)出較高的表達(dá)量,可能與蛤仔不同RpTauT基因的組織表達(dá)特異性有關(guān)。研究認(rèn)為貝類的生殖細(xì)胞內(nèi)含有大量的牛磺酸用于配子在進(jìn)入海水過(guò)程中滲透壓的調(diào)節(jié)[18],在哺乳動(dòng)物生殖組織內(nèi)的大量?；撬峋哂卸喾N生理作用[28-29]。在本研究中,蛤仔性腺組織中RpTauT表達(dá)量并未達(dá)到很高水平,可能與研究未在蛤仔繁殖期進(jìn)行有關(guān)。

3.3 3種殼色蛤仔低鹽脅迫后?；撬岷勘容^

牛磺酸是雙殼貝類應(yīng)對(duì)鹽度變化過(guò)程維持細(xì)胞內(nèi)滲透壓穩(wěn)定的最重要的游離氨基酸之一[30]。研究表明,蚶蜊(Glycymerisglycymeris)、貽貝肌肉組織中的?；撬岷吭谶m應(yīng)低鹽度環(huán)境后會(huì)降低[31]。將文蛤轉(zhuǎn)移至稀釋1倍的海水中,其鰓組織中的?；撬岷吭谵D(zhuǎn)移3 h顯著增加,其外套膜中的?；撬岷吭?4 h后才顯著增加[19]。但將文蛤轉(zhuǎn)移至鹽度為10的海水中1個(gè)月后,其鰓組織中?；撬岷匡@著增加,而外套膜中的?；撬岷课窗l(fā)生顯著變化[27]。Hosoi等發(fā)現(xiàn),從海水轉(zhuǎn)移至50%稀釋海水后8 h時(shí),太平洋牡蠣外套膜中的?；撬岷匡@著降低[32]。在本研究中,檢測(cè)蛤仔軟體部的?；撬峥偤砍诔雀?24 h 顯著升高外,其余時(shí)間點(diǎn)3種殼色蛤仔軟體部?；撬岷吭诿{迫過(guò)程中均未發(fā)生顯著變化,表明在應(yīng)對(duì)鹽度脅迫過(guò)程中,?；撬岬淖兓饕l(fā)生在組織細(xì)胞內(nèi)外,而對(duì)個(gè)體?；撬岷坑绊懴鄬?duì)較小。

3.4 菲律賓蛤仔RpTauT低鹽脅迫表達(dá)

?；撬徂D(zhuǎn)運(yùn)體蛋白通過(guò)對(duì)細(xì)胞內(nèi)外?；撬岬闹匦路峙鋪?lái)協(xié)助貝類應(yīng)對(duì)環(huán)境滲透壓的變化[33]。在低鹽脅迫過(guò)程中,雙殼貝類的牛磺酸成分會(huì)流失到細(xì)胞外液中[30]。紫貽貝的免疫組化結(jié)果顯示,其外套膜中TauT低滲脅迫24 h后表達(dá)上調(diào)[34]。將貽貝轉(zhuǎn)移至低鹽環(huán)境24、48 h后,其鰓組織中的TAUT mRNA表達(dá)量也表現(xiàn)出一定增加[17]。Hosoi等研究發(fā)現(xiàn),低鹽脅迫48 h的紫貽貝和低鹽脅迫 24 h 的牡蠣的外套膜組織中TauT表達(dá)量顯著增加[16,18]。Silva等將貽貝離體鰓組織急性暴露于60%人工海水中,雖然?；撬嵛盏囊种谱饔?85%,但牛磺酸的表觀積累僅減少了約10%[35]。Wright等觀察到暴露于外部環(huán)境的紫貽貝和加州貽貝鰓組織中的TAUT 活性增加有助于恢復(fù)從鰓表面流失的?；撬醄36]。因此,低鹽度環(huán)境中,雙殼貝類中的外套膜中TAUT誘導(dǎo)表達(dá)可能是由于滲透壓下降導(dǎo)致組織中牛磺酸含量減少的結(jié)果。在本研究中,蛤仔在低鹽脅迫過(guò)程中水管中的 TAUT mRNA表達(dá)也顯著上調(diào),可能是由于水管組織中的牛磺酸在低鹽環(huán)境中大量流失誘導(dǎo)的補(bǔ)償機(jī)制。但牡蠣在低鹽環(huán)境中處理7 d,其鰓組織中的?；撬岷亢蚑auT的表達(dá)量均顯著降低[37]。TauT在不同物種中對(duì)低鹽脅迫的不同反應(yīng)可能是物種差異及處理過(guò)程的不同所致。此外,研究發(fā)現(xiàn)?；撬峋哂锌寡趸钚?能夠通過(guò)減少電子傳輸鏈產(chǎn)生的超氧化物及提高抗氧化酶的活性等途徑發(fā)揮其抗氧化功能[38]。貝類在應(yīng)對(duì)鹽度突變的初期,通常采用關(guān)閉貝殼與低鹽環(huán)境隔離的方式進(jìn)行應(yīng)對(duì),結(jié)果會(huì)導(dǎo)致其短期內(nèi)攝取氧氣含量不足,低氧可導(dǎo)致體內(nèi)電子的蓄積,為活性氧的形成提供便利,結(jié)果導(dǎo)致體內(nèi)產(chǎn)生較高水平的活性氧[39]。相關(guān)研究已初步證實(shí)這一過(guò)程,在鹽度由19.6‰降低至8.8‰時(shí),毛蚶血淋巴細(xì)胞中活性氧的含量增加了3.5倍[40];低鹽脅迫也能夠?qū)е迈U魚(yú)活性氧產(chǎn)量增加[41-42];低氧脅迫后菲律賓蛤仔體內(nèi)抗氧化酶基因表現(xiàn)出先升高而后恢復(fù)的過(guò)程,表明蛤仔在低氧脅迫條件下能夠?qū)е麦w內(nèi)活性氧的增加[43]。因此,本研究中蛤仔RpTauT在低鹽脅迫后短時(shí)間內(nèi)表現(xiàn)出升高過(guò)程可能是由于缺氧導(dǎo)致的活性氧數(shù)量增加而大量消耗的?；撬崴a(chǎn)生的補(bǔ)償效應(yīng)。?；撬岷恳彩怯绊懪；撬徂D(zhuǎn)運(yùn)體蛋白表達(dá)量的重要原因之一,當(dāng)?；撬岷拷档蜁r(shí)可通過(guò)提高轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白的表達(dá)來(lái)增加細(xì)胞對(duì)牛磺酸的轉(zhuǎn)運(yùn)能力進(jìn)行補(bǔ)償,反之當(dāng)?；撬釢舛壬邥r(shí)可抑制轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白的表達(dá)[44]。將文蛤從鹽度20‰的海水轉(zhuǎn)移至鹽度為10‰的低鹽海水中,在本研究的低鹽脅迫過(guò)程中,3種殼色蛤仔牛磺酸含量的變化是導(dǎo)致蛤仔RpTauT表達(dá)量變化的原因之一。前期研究發(fā)現(xiàn),不同殼色菲律賓蛤仔在低鹽脅迫條件下表現(xiàn)出不同的抗逆性[45-46],而3種殼色蛤仔RpTauT基因表達(dá)量變化在低鹽脅迫過(guò)程中表現(xiàn)出的差異性可能是不同殼色菲律賓蛤仔抗逆性差異的原因之一。

4 結(jié)論

(1)鑒定出6條菲律賓蛤仔RpTauT基因,推測(cè)其蛋白具有保守的12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和鈉離子結(jié)合位點(diǎn),進(jìn)化分析表明蛤仔RpTauT與其他雙殼貝類的遺傳距離較近。(2)組織表達(dá)分析表明,蛤仔的RpTauT基因主要在外套膜和水管這2個(gè)與外界環(huán)境之間有較大接觸界面,且滲透壓波動(dòng)較大的組織中高表達(dá)。(3)低鹽脅迫條件下,蛤仔水管組織中的RpTauT表現(xiàn)出升高過(guò)程,原因可能主要是對(duì)低鹽脅迫導(dǎo)致的水管組織細(xì)胞內(nèi)牛磺酸的流失和抗氧化過(guò)程中消耗?；撬岬囊环N補(bǔ)償機(jī)制。