陳家玉 ，桂和榮，郭 艷，李 俊

(1.安徽理工大學 地球與環(huán)境學院,安徽 淮南 232001；2.國家煤礦水害防治工程技術研究中心(宿州學院),安徽 宿州 234000)

由于煤礦資源長期無限制的開采，導致資源枯竭，災害頻發(fā)[1]。而水資源和水環(huán)境問題反過來制約煤化工產業(yè)發(fā)展[2]。煤礦區(qū)地下水由于溫度、氧化還原電位以及復雜的水文地質條件形成獨特的微生物種群結構[1,3]。此外，煤炭開采的過程中，必然伴隨著地下水生境的改變，進而引發(fā)微生物的繁殖與變異[4]。因此，探索煤礦區(qū)地下水微生物群落結構成為了解礦區(qū)污染、治理污染,從而實現水資源保護與工業(yè)穩(wěn)步發(fā)展的必要手段。

在開采擾動影響下，煤礦區(qū)的水文地質結構由原來相對穩(wěn)態(tài)的系統(tǒng)轉變?yōu)榉欠€(wěn)態(tài)且復雜水力聯(lián)系的系統(tǒng)，包括含水層、導水通道和采空區(qū)等多個方面，使煤礦區(qū)地下水動力條件、生化環(huán)境發(fā)生重大變化[3]。研究利用16SrRNA 基因高通量測序技術，旨在從遺傳的水平上分析采煤區(qū)地下水微生物群落組成及特征，克服了絕大多數微生物不可培養(yǎng)的缺陷，從而更反映出地下水微生物的真實情況[5-6]。已有對于地下水微生物多樣性的研究多集中于淺層水體[7-8]，而實際深層地下水微生物所處的環(huán)境更加復雜。筆者選取淮北煤田許疃礦、任樓礦、桃園礦、恒源礦和界溝礦煤系砂巖水和太原組灰?guī)r水深層含水層利用礦井水文孔進行取樣。本研究利用高通量測序技術調查深層地下水的微生物群落結構特征及其與環(huán)境變量的關系，以期了解煤礦區(qū)深層地下水微生物群落，從而為礦區(qū)地下水管理、水害防治等提供基礎數據。

煤礦五大災害(突水、瓦斯突出、自燃、冒頂、煤塵)，水害位居其首，水害所造成的人員傷亡僅次于瓦斯災害，但所造成的經濟損失遠大于瓦斯災害。煤礦水害防治中，礦井涌水或突水水源的精準識別是煤礦的一項常規(guī)性且十分重要的工作，目前所用的手段是水位、水量、水化學等物理化學識別方法[9]。在淮北煤田，二疊系煤系砂巖裂隙水(簡稱“煤系水”)、石炭系太原組灰?guī)r水(簡稱“太灰水”)都是煤礦開采的主要充水水源，研究兩含水層地下水微生物群落特征及其空間分布規(guī)律，可以為煤礦涌(突)水水源識別提供一種新的方法。

1 材料與方法

1.1 水文地質背景

淮北煤田位于安徽省淮北平原的西北部，為新生界松散層覆蓋的全隱蔽煤田。在東經114.92°～118.17°，北緯32.42°～34.58°，面積約11 350 km2(圖1)。在地貌單元上屬華北大平原的一部分，除濉溪、肖縣和宿州市北部符離集—徐州一帶為震旦、寒武、奧陶系等基巖裸露的剝蝕低山、殘丘和山間谷地外，其余地區(qū)皆為黃、淮河沖積平原。其低山、殘丘海拔高程一般為+80～+408 m，平原區(qū)海拔高程一般為+20～+50 m，地勢總體上呈現西北高而東南略低的微傾斜，坡降萬分之一左右。淮北煤田地下水自上而下分為4 個含水層，分別為松散第四含水層(簡稱“四含”)、二疊系煤系砂巖含水層(簡稱“煤系”)、石炭系太原群灰?guī)r含水層(簡稱“太灰”)和奧陶系灰?guī)r含水層(簡稱“奧灰”)[10-11]。

圖1 采樣點分布Fig.1 Distribution map of sampling points

這4 個含水層地層主要由黏土、砂巖、石灰?guī)r和白云巖組成(圖2)。煤系水與太灰水之間通過導水斷層、巖溶陷落柱等溝通形成水力聯(lián)系[12]。

圖2 含水層剖面示意Fig.2 Aquifer profile of Huaibei coalfield

1.2 樣本采集

地下水樣品于2021 年11 月、2022 年1 月和2022 年3 月于許疃礦、任樓礦、桃園礦、恒源礦和界溝礦5 個礦區(qū)采集深度分別為600 m 和750 m 的煤系和太灰水樣。水樣被儲存在4 L 無菌塑料瓶中，用干冰保存24 h 之內運輸至實驗室并過濾。電導率(EC)、溶解氧(DO)、pH、總溶解固體(TDS)、氧化還原電位(ORP)等理化指標在現場使用校準的HACH HQd 和ST300D(Ohaus Shanghai,China)便攜式分析儀測試。陽離子Na+、K+、Ca2+、Mg2+和陰離子Cl-、F-、使用離子色譜儀(Thermo Fisher ICS-600-900)測試。總有機碳(TOC)質量分數通過總有機碳分析儀(TOC-VWP,Shimadzu,Tokyo,Japan)測試。采用酸堿滴定法測定。TDS 通過主要離子質量濃度總和減去一半的質量濃度計算得出。所有樣品陰陽離子平衡在5%以內。

1.3 DNA 提取、PCR 擴增及測序

地下水(4 L)通過預先滅菌的0.22 μm 濾膜過濾以收集生物量，然后濾膜使用干冰保存送至廣東美格生物工程有限公司完成地下水16SrRNA 測序工作。使用 PowerWater DNA 分離試劑盒提取基因組DNA。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的完整度和純度，同時利用NanoDropOne 檢測DNA 的濃度和純度。使用通用細菌引物515F(5'-GTGCCAGCMGCCGCGG TAA-3')和806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')[13-15]對微生物 16S rRNA 基因的 V4 區(qū)域進行擴增，擴增條件為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火 30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃修復延伸10 min。PCR 擴增及產物電泳檢測則以基因組 DNA 為模板，根據測序區(qū)域的選擇，使用帶barcode 的引物及 PremixTaq(TaKaRa)進行。并在 Illumina Miseq 平臺上進行測序。

1.4 數據分析

為了研究樣品物種組成及多樣性信息，對所有樣品拼接過濾后的clean tags 進行聚類，選取97%的相似性生成微生物分類單元(operational taxonomic units，OTUs)，同時去除嵌合體，并按最小樣本序列數抽平。使用 RDP 16S 分類器獲得了單個 OTU 的分類注釋[15]。選取OTU 的代表性序列，與數據庫進行比對獲得物種注釋信息。

2 結果與分析

2.1 含水層理化性質

表1 列出了含水層各參數的理化性質統(tǒng)計。煤系水中主要陰陽離子分別為Na+和平均質量濃度分別為658.64 mg/L 和910.25 mg/L。太灰水中主要陰陽離子分別為Na+和平均質量濃度分別為283.96 mg/L 和644.29 mg/L。煤系水主要水化學類型為Na-Cl 型，太灰水主要水化學類型為Ca-Na-SO4型。煤系水中主要的污染物包括TDS、Na+、F-、Cl-，其平均值分別是我國地下水質量標準(GB/T 14848—2017)Ⅲ類標準限值(1 000、200、1.0、250 mg/L)[16]的1.78、3.29、2.18、1.57 倍。太灰水中主要的污染物包括TDS、Na+、F-、Cl-、超標倍數分別為1.77、1.42、1.77、1.38、2.58 倍。從超標倍數上看，煤系水各因子污染更嚴重，太灰水比煤系水受到更為嚴重的污染。

表1 地下水理化性質Table 1 Physical and chemical properties of groundwater

2.2 微生物群落多樣性

由表2 知，Coverage 值介于0.978 4～0.993 6，均在98%水平以上，說明本次測序數據可靠。ACE 和Chao 值反映菌群豐富度，Shannon 和Simpson 指數反映菌群多樣性程度[5]。從平均值來看，Shannon、ACE和Chao 值均呈煤系水＞太灰水規(guī)律，Simpson 指數呈煤系水＜太灰水的規(guī)律，說明煤系含水層微生物群落多樣性較高。煤系水和太灰水的Observed Species 指數平均值分別為1 981.64 和1 848.57。結果表明在煤系水中的微生物群落豐富度更高。煤系水Shannon 指數、Simpson 指數和Observed Species 指數等和太灰水中較為接近，這是由于煤系水和太灰水之間采動裂隙等溝通，相互存在水力聯(lián)系[12]，使微生物群落結構較相近。

表2 樣品OTU 及多樣性指數Table 2 Microorganism OTU and diversity index of samples

由韋恩圖知，煤系水和太灰水共有OTU 數為6 221 個，說明煤系水和太灰水的微生物群落構成較為相近。煤系水和太灰水特有OTU 數分別為1 759和4 107 個，太灰水特有微生物相對較多。

2.3 微生物群落組成

煤系水和太灰水相對豐度≥0.01%的微生物菌群在門水平組成上的差異展現在圖3(a)中。Proteobacteria是煤系水和太灰水中占比最大的菌門，相對豐度整體介于41.48%～97.36%，其次是Bacteroidota，在所有水樣中相對豐度介于0.57%～48.01%，其次是Planctomycetota，相對豐度介于0.13%～15.29%。很明顯，Planctomycetota在煤系水中的占比相對大于太灰水。

圖3 煤系水和太灰水微生物群落組成Fig.3 Microbial community composition of coal measure and Taiyuan limestone

煤系水樣品中，Proteobacteria仍然是優(yōu)勢菌門，其次是Bacteroidota和Planctomycetota，這3 種相對豐度占比前三的菌門分別占總菌門的70.42%、9.97%和4.69%。Proteobacteria、Bacteroidota、Planctomycetota同樣也是太灰水中相對豐度占比前三的菌門，占比分別為78.78%、4.53%和2.27%。這3 種菌門相對豐度在不同含水層差異明顯，即均呈煤系水＞太灰水的規(guī)律，地下水越深，其豐度越低。

屬水平，含水層相對豐度≥0.01%的菌屬組成如圖3(b)所示。Hydrogenophaga菌屬是地下水含水層中的優(yōu)勢菌屬，相對豐度介于0.19%～62.22%。Thiovirga菌屬相對豐度介于0.04%～59.68%，尤其在C6 和T6的水樣中相對豐度分別達到59.68%和25.60%，相對豐度超過了Hydrogenophaga菌屬。Thiobacillus相對豐度介于0.07%～18.06%。

不同深度含水層在屬水平上的微生物菌屬組成具有差異。煤系水相對豐度占比前三的菌屬分別為Thiovirga、Hydrogenophaga和Flavobacterium，相對豐度分別占煤系水中總菌屬的5.98%、4.39%、3.43%。太灰水豐度占比前三的菌屬分別為Hydrogenophaga、Acinetobacter、Thiobacillus，相對豐度占比分別為11.13%、4.72%和4.40%。

微生物與地下水水生環(huán)境之間是共生及相互制約的關系，一方面，地下水環(huán)境為微生物提供養(yǎng)分及適宜的溫度等。另一方面，微生物是水環(huán)境物質循環(huán)，能量流動的介質。Proteobacteria是地下水中常見的細菌門[17-19]。Hydrogenophaga是表征反硝化過程的菌屬[7]，在煤系水和太灰水中均有分布，且太灰水中占比較高(圖3)。說明較高質量濃度的加強了Hydrogenophaga的富集，可作為污染水平的指示菌屬[17]。在之前的研究中，深層地下水中同樣檢測出Bacteroidota的存在[19]。

2.4 微生物群落與環(huán)境因子相關性分析

在消除了導致強共線性(VIF 超過閾值10)的環(huán)境因子后[8]，篩選出可用于分析對地下水微生物群落產生影響的6 種環(huán)境變量(F-、K+、ORP、TOC、pH、)(圖4)。CCA 分析可知，CCA1 和CCA2 對群落分布的解釋量分別為22.6%和20.0%，對含水層微生物群落影響因子排序為F-＞K+＞ORP＞TOC＞pH＞F-、K+、ORP 是對地下水微生物群落最重要的3 種驅動因子。F-與ORP、TOC、pH、K+夾角均呈銳角，呈正相關關系，說明隨著F-質量濃度的增加，這些參數質量濃度增大。F-對煤系水和太灰水的影響相差不大。TOC 和pH 對煤系水微生物群落結構影響更大；K+是影響太灰水的微生物群落結構的重要原因，其次是煤系水。環(huán)境因子的類型對于不同含水層微生物群落的影響是不同的。這是物種對自然環(huán)境選擇性及適應性的反應[20-21]。

圖4 樣品典型相關(CCA)分析Fig.4 Canonical correspondence analysis of samples

污染物F-成為地下水微生物群落構成最重要的影響因子。由于淮北煤田地下水存在著強烈的離子交換反應[22],導致地下水中的鈣離子質量濃度降低、鈉離子質量濃度升高。鈣離子質量濃度降低可以加快含氟礦物(如螢石等)的溶解，使F-釋放到水體中[23]。污染物的質量濃度的升高強化了部分菌群,導致微生物群落組成發(fā)生變化[24]。pH 可以改變元素的化合價及其存在形式，還可以通過調節(jié)細胞間的pH 進而影響微生物群落分布[25]。在淮北煤田，盡管開采活動使得相對封閉的深層地下水變得開放，但在相對缺氧的深層地下水中，ORP 仍然是控制地下水微生物群落組成的關鍵因素(圖4)。這是由于微生物在還原環(huán)境中難以獲取營養(yǎng)物質和能量，微生物群落結構的變化比潛水地下水更為敏感[26]。研究表明，淮北煤田地下水煤系及太灰水主要接受大氣降水蒸發(fā)補給[27-28]，在采動、外部補給等復雜的水文地質條件背景下，這使得深層地下水中的微生物群落組成發(fā)生有別于淺層水或地表水的變化[3,29]。

2.5 地下水菌屬與環(huán)境變量相關性分析

Flavobacterium屬于錳氧化菌，常見于錳礦床或錳礦中[18]。Flavobacterium較易受到多種環(huán)境因子的干擾(圖5)，即隨著TDS、K+、Mg2+、質量濃度的增加，Flavobacterium組分占比隨之減少。Acinetobacter是一種異養(yǎng)硝化好氧反硝化菌，低溫環(huán)境下具有較強的活性，能有效地降解含水層中的污染物[30]。Sulfuritalea屬于β-變形菌綱，β-變形菌綱更易存活于受污染的環(huán)境中，可作為環(huán)境質量監(jiān)測的指標[31]。Sulfuritalea常見于油田產出水[32]、尾礦[33]、被污染的承壓含水層[34]中。最常見的硫氧化微生物之一屬于Thiothrix屬[35]，通常在強化生物除磷(EBPR)工藝被觀察到。Thiothrix還可以利用聚-b-羥基鏈烷酸酯(PHA)聚合物作為底物完成胞內代謝[35]。另外，Thiothrix能利用硫化物作為能量來源進行代謝，太灰水中與Thiothrix呈顯著正相關關系，因此，太灰水中高質量濃度的可能導致了Thiothrix的富集[36]。

圖5 屬水平煤系水與太灰水和Spearman 相關性熱圖分析(*表示p ＜ 0.05；**表示p ＜ 0.01)Fig.5 Spearman correlation heat map analysis on genus level of and coal measure and Taiyuan limestone (* p ＜ 0.05;** p ＜ 0.01)

隨著含水層地下水中Ca2+、Mg2+、質量濃度逐漸增高，這些離子對地下水菌屬的影響也逐漸突顯(圖5)。微生物通過改變自身豐度、多樣性來適應地下水生境系統(tǒng)。不同含水層由于不同地層的巖性、賦存條件等因素，導致環(huán)境因子的理化性質和水化學進程差異，進而影響水體微生物群落多樣性和代謝功能[29]。微生物群落通過營養(yǎng)物質運移，地球化學元素循環(huán)和污染物降解等過程又反過來控制環(huán)境因子的水化學進程，從而達到含水層環(huán)境因子與微生物群落的動態(tài)平衡。研究表明，水體中的環(huán)境變量，例如甲醇能夠極大程度激活深層地下水中的細菌[37]，從而導致不同含水層類型形成獨特的微生物種群特征。本研究以淮北煤田深層地下水為例，為了解深層地下水微生物群落結構提供微生物基礎。

淮北煤田煤系水和太灰水的不同微生物群落特征，為煤礦涌(突)水水源的微生物識別提供了可行依據。

3 結論

(1)淮北煤田地下水煤系水主要陰陽離子分別為Na+和太灰水主要陰陽離子分別為Na+和煤系水主要水化學類型為Na-Cl 型，太灰水主要水化學類型為Ca-Na-SO4型。

(2)研究區(qū)地下水煤系水和太灰水主要菌門均為Proteobacteria、Bacteroidota和Planctomycetota。優(yōu)勢菌門為Proteobacteria(41.48%～97.36%)，其豐度太灰水 ＞ 煤系水。主要菌屬煤系水為Thiovirga、Hydrogenophaga和Flavobacterium；太灰水為Hydrogenophaga、Acinetobacter、Thiobacillus。Hydrogenophaga為優(yōu)勢菌屬(0.19%～62.22%)，其豐度為煤系水 ＜ 太灰水。

(3)研究區(qū)影響地下水微生物群落的主要影響因素程度排列為淮北煤田地下水特征污染物F-是影響地下水微生物群落分布最主要的因素。