陳玥璇 汪潞 柳華鋒

心肌缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）損傷是指急性冠狀動(dòng)脈閉塞后，再灌注導(dǎo)致更嚴(yán)重的心肌損傷，是影響心肌梗死患者預(yù)后的重要因素[1]。鐵死亡是一種新型的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡，其特征是鐵依賴的脂質(zhì)過氧化物累積，在心肌缺血等多種疾病中發(fā)揮重要作用[2]。微小RNA（micro RNAs，miRNAs）在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡和自噬等過程。有研究表明miR-22-3p 可作為診斷冠心病的特異性生物標(biāo)志物[3]，然而miR-22-3p 在I/R 損傷期間對(duì)于心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)機(jī)制尚不清楚。因此，本次研究探討了I/R 過程中miR-22-3p 對(duì)心肌細(xì)胞保護(hù)的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 本次研究起止時(shí)間為2022 年8 月至2023年4 月，采用購自武漢普諾賽生命科技有限公司的大鼠心肌細(xì)胞系H9c2 作為研究對(duì)象。所有實(shí)驗(yàn)操作均在杭州市中醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 H9c2細(xì)胞在含10%胎牛血清、100 U/ml 青霉素和100 g/ml 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液中，置于37 ℃含5%CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染方法參考LipofectamineTM2 000轉(zhuǎn)染說明書，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 氧糖剝奪/復(fù)氧（oxygen and glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R）體外細(xì)胞模型構(gòu)建 H9c2細(xì)胞根據(jù)是否缺氧分為常氧組、OGD/R 組，根據(jù)是否轉(zhuǎn)染miR-22-3p mimic 分為OGD/R 組+miR-NC組，OGD/R+miR-22-3p 組，根據(jù)是否共轉(zhuǎn)染miR-22-3p mimic 和Fer-1 分為OGD/R+Fer-1 組和OGD/R-Fer-1+miR-22-3p 組，根據(jù)是否共轉(zhuǎn)染miR-22-3p mimic 和PLAGL2 過表達(dá)質(zhì)粒分為OGD/R+miR-22-3p 組和OGD/R+miR-22-3p+PLAGL2 組。OGD/R處理方法如下：H9c2細(xì)胞在血清和無糖DMEM中培養(yǎng)，含有1%O2、5%CO2和94% N2，37 ℃下培養(yǎng)6 h。缺氧后，細(xì)胞在正常生長條件下（5%CO2和95%空氣）的完全培養(yǎng)基中再培養(yǎng)12 h。常氧組細(xì)胞在正常生長條件下，用完全DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。本次實(shí)驗(yàn)為驗(yàn)證miR-22-3p 對(duì)鐵死亡的調(diào)控，H9c2 細(xì)胞用60 nmol/L 鐵死亡抑制劑Fer-1 進(jìn)行預(yù)處理24 h，然后用OGD（6 h）/R（12 h）處理。

1.4 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力 將H9c2細(xì)胞以1×104細(xì)胞/孔的密度接種到96 孔板中。OGD/R 處理18 h后，根據(jù)說明書要求，使用CCK-8 試劑盒檢測(cè)分別在24 h、48 h、72 h 和96 h 的細(xì)胞活力。每孔加入10 μl CCK-8溶液，在37 ℃孵育3 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度。

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）用Nanodrop 檢測(cè)從H9c2細(xì)胞中分離的RNA濃度和純度。逆轉(zhuǎn)錄體系為1 μl oligo（dT）Primer，用ddH2O 補(bǔ)充至10 μl，逆轉(zhuǎn)錄程序?yàn)?7 ℃，15 min，85 ℃，5 s。qRT-PCR反應(yīng)體系，12.5 μl SYBR Premix Ex Taq Ⅱ，1 μl cDNA 和上下游引物各0.5 μl，ddH2O 補(bǔ)充至25 μl。采用2-ΔΔCt公式計(jì)算miR-22-3p 相對(duì)表達(dá)量，U6 作為內(nèi)參。引物如下所示：miR-22-3p：5' -AAGCUGCCGUUGAAGAACUGU-3'（正向），5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'（反向）；U6：5'-AACCTTATATCGGGCGGGA-3'（正向），5'-TTACGGCGATGCATAAT-3'（反向）。

1.6 鐵死亡水平測(cè)定 取細(xì)胞懸液，用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌細(xì)胞1～2 次。通過反復(fù)凍融，使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。4 ℃，2 500 r/min 離心20 min，棄沉淀、取上清。根據(jù)試劑盒說明書，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、Fe2+水平。

1.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 借助TargetScan7.1（http：//www.targetscan.org/vert_71/）網(wǎng) 站用于預(yù)測(cè)miR-22-3p與PLAGL2的靶向結(jié)合位點(diǎn)。含有預(yù)測(cè)miR-22-3p 結(jié)合位點(diǎn)的報(bào)告載體pmiRGLO-PLAGL2 野生型質(zhì)粒（PLAGL2-WT）或miRGLO-PLAGL2突變型質(zhì)粒（PLAGL2-MUT）。使用Lipofectamine 2 000 進(jìn) 行miR-22-3p mimic 與PLAGL2質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，并分為PLAGL2-WT+mirR-22-3p組和PLAGL2-MUT-mirR-22-3p 組。48 h 后，用雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定熒光素酶活性。

1.8 Western blot 檢測(cè)Gpx4 蛋白 使用BCA 試劑盒測(cè)定蛋白濃度，再用10% SDA-PAGE 進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。室溫下使用5%脫脂牛奶封閉2 h后，PVDF 膜與一抗PLAGL2（1∶1000）、Gpx4（1∶1000）或β-actin（1∶10000）4 ℃過夜孵育。TBST 洗膜，使用兔二抗（1∶5000）孵育1 h。TBST洗膜，使用ECL試劑檢測(cè)蛋白信號(hào)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。組間計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。設(shè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OGD/R誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞后不同時(shí)間的吸光度值比較見表1

表1 OGD/R誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞后不同時(shí)間的吸光度值比較

由表1 可見，OGD/R 組H9c2 細(xì)胞在第1 天、第2 天和第3 天的吸光度值與常氧組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別=0.21、0.86、0.25，P均＞0.05），OGD/R 組H9c2 細(xì)胞在第4 天的吸光度值低于常氧組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.78，P＜0.05）。

2.2 OGD/R 誘導(dǎo)H9c2 細(xì)胞后ROS、MDA、Fe2+及miR-22-3p水平比較見表2

表2 OGD/R誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞后ROS、MDA、Fe2+及miR-22-3p水平比較

由表2 可見，OGD/R 組H9c2 細(xì)胞ROS 及MDA水平、Fe2+的積累明顯高于常氧組，miR-22-3p 水平明顯低于常氧組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別=4.24、2.54、4.47、3.53，P均＜0.05）。

2.3 Western blot 檢測(cè)OGD/R 誘導(dǎo)H9c2 細(xì)胞后Gpx4蛋白水平見圖1

圖1 Western blot檢測(cè)OGD/R誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞后Gpx4蛋白水平

由圖1 可見，Western blot 實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，Gpx4蛋白表達(dá)在OGD/R組明顯降低。

2.4 H9c2細(xì)胞中miR-22-3p mimic轉(zhuǎn)染效率 miR-22-3p 組的miR-22-3p 表達(dá)水平（3.56±0.43），明顯高于OGD/R+miR-NC組（0.23±0.14），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.25，P＜0.05）。

2.5 H9c2 細(xì)胞OGD/R 處理及轉(zhuǎn)染miR-22-3p mimic后吸光度值比較見表3

表3 H9c2細(xì)胞OGD/R處理及轉(zhuǎn)染miR-22-3p mimic后吸光度值比較

由表3 可見，各組在第1 天和第2 天間吸光度值比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別=0.88、0.22，P均＞0.05），第3 天和第4 天，OGD/R 組吸光度值高于常氧組，OGD/R+miR-22-3p 組吸光度值高于OGD/R+miR-NC 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別=2.98、1.97、2.57、2.46，P均＜0.05）。

2.6 H9c2 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-22-3p mimic 后ROS、MDA、Fe2+水平比較見表4

表4 H9c2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-22-3p mimic后ROS、MDA、Fe2+水平比較

由表4 可見，OGD/R 組H9c2 細(xì)胞中MDA、ROS水平、Fe2+的積累明顯高于常氧組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別=3.33、2.47、2.03，P均＜0.05），而OGD/R+miR-22-3p 組MDA、ROS水平、Fe2+的積累明顯低于OGD/R+miR-NC 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別=2.62、5.35、4.11，P均＜0.05）。

2.7 H9c2 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-22-3p mimic 后Gpx4 表達(dá)水平比較見圖2

圖2 Western blot檢測(cè)H9c2細(xì)胞中Gpx4蛋白表達(dá)

由圖2 可見，OGD/R 組Gpx4 表達(dá)水平下調(diào)，而OGD/R+miR-22-3p組Gpx4表達(dá)水平顯著上調(diào)。

2.8 OGD/R 后細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-22-3p mimic 和Fer-1處理后吸光度值比較見表5

由表5可見，第1 天和第2 天，各組間吸光度值比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別=0.04、0.32，P均＞0.05）。第3 天和第4 天，OGD/R組吸光度值低于常氧組（t分別=4.66、3.21，P均＜0.05），OGD/R+Fer-1 組吸光度值明顯高于OGD/R組（t分別=3.12、3.36，P均＜0.05）。而OGD/R+Fer-1+miR-22-3p 組吸光度值與OGD/R+Fer-1 組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別=0.31、1.06，P均＞0.05）。

2.9 OGD/R 后細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-22-3p mimic 和Fer-1處理后ROS、MDA、Fe2+水平比較見表6

表6 OGD/R后細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-22-3p mimic和Fer-1處理后ROS、MDA、Fe2+水平檢測(cè)

由表6 可見，OGD/R 組H9c2 細(xì)胞MDA 及ROS水平、Fe2+的積累明顯高于常氧組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別=4.52、3.49、3.39，P均＜0.05），GD/R+Fer-1 組逆轉(zhuǎn)下調(diào)MDA、ROS 和Fe2+水平（t分別=3.03、5.33、2.48，P均＜0.05）。OGD/R+Fer-1+miR-22-3p 組H9c2細(xì)胞MDA及ROS水平、Fe2+的積累與OGD/R+Fer-1 組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別=0.21、1.18、0.63，P均＞0.05）。

2.10 miR-22-3p 對(duì)PLAGL2 的表達(dá)調(diào)控檢測(cè)見圖3

圖3 miR-22-3p對(duì)PLAGL2的表達(dá)調(diào)控檢測(cè)

由圖3A 可見，通過Targetscan 靶向關(guān)系預(yù)測(cè)網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)miR-22-3p 和PLAGL2 存在特異性結(jié)合位點(diǎn)。由圖3B 可見，H9c2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-22-3p 組的PLAGL2蛋白表達(dá)明顯低于miR-NC組。

2.11 miR-22-3p 靶向調(diào)控PLAGL2 表達(dá)的檢測(cè)PLAGL2-WT+miR-22-3p 組的熒光素酶活性為（0.95±0.15），明顯低于PLAGL2-MUT+miR-22-3p組（0.24±0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.69，P＜0.05）。

2.12 過表達(dá)PLAGL2對(duì)Gpx4的表達(dá)調(diào)控見圖4

圖4 Western blot檢測(cè)H9c2細(xì)胞PLAGL2和Gpx4蛋白表達(dá)水平

由圖4A、4B 可見，共轉(zhuǎn)染miR-22-3p mimic 和PLAGL2 過表達(dá)質(zhì)粒組細(xì)胞中PLAGL2 表達(dá)顯著高于miR-22-3p轉(zhuǎn)染組，Gpx4表達(dá)顯著低于miR-22-3p轉(zhuǎn)染組。

2.13 OGD/R 后細(xì)胞共轉(zhuǎn)染miR-22-3p mimic 和PLAGL2過表達(dá)質(zhì)粒后吸光度值見表7

表7 OGD/R后細(xì)胞共轉(zhuǎn)染miR-22-3p mimic和PLAGL2過表達(dá)質(zhì)粒后吸光度值

由表7 可見，第1、2 天，各組細(xì)胞吸光度值比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別=0.21、0.12，P均＞0.05）。第3、4 天，OGD/R組吸光度值明顯高于常氧組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別=6.33、7.18，P均＜0.05）。OGD/R+miR-22-3p 組吸光度值明顯高于OGD/R 組（t分別=3.11、4.22，P均＜0.05），OGD/R+miR-22-3p+PLAGL2 組的吸光度值明顯低于OGD/R+miR-22-3p 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別=3.91、3.12，P均＜0.05）。

2.14 OGD/R 后細(xì)胞共轉(zhuǎn)染miR-22-3p mimic 和PLAGL2 過表達(dá)質(zhì)粒后ROS、MDA、Fe2+水平比較見表8

表8 OGD/R后細(xì)胞共轉(zhuǎn)染miR-22-3p mimic和PLAGL2過表達(dá)質(zhì)粒后ROS、MDA、Fe2+水平

由表8可見，OGD/R組ROS、MDA、Fe2+水平明顯高于常氧組（t分別=4.52、3.54、4.01，P均＜0.05），OGD/R+miR-22-3p 組MDA 及Fe2+、ROS 水平明顯低于OGD/R組（t分別=4.71、4.35、3.05，P均＜0.05）。OGD/R+miR-22-3p+PLAGL2組的MDA及Fe2+、ROS水平高于OGD/R+miR-22-3p（t分別=3.74、3.87、3.05，P均＜0.05）。

3 討論

最近的研究表明，I/R 損傷會(huì)導(dǎo)致miRNAs 的表達(dá)改變，影響心肌細(xì)胞的存活和恢復(fù)。此外，仍有其它研究指出miR-22-3p 在冠狀動(dòng)脈疾病過程中起作用，可作為診斷冠狀動(dòng)脈疾病的特異性標(biāo)志物[3]。本次研究揭示miR-22-3p 在體外心肌細(xì)胞OGD/R損傷過程起到保護(hù)作用，其機(jī)制為通過靶向PLAGL2蛋白表達(dá)抑制鐵死亡。

既往研究已證實(shí)鐵死亡在心肌病、心肌梗死、缺血再灌注損傷等疾病中發(fā)揮重要作用[4]。miRNAs如miR-7-5p、miR-150-5p 和miR-706 等通過調(diào)控心肌細(xì)胞鐵死亡，參與心臟發(fā)育、心肌重塑和心力衰竭等生物過程。本次研究發(fā)現(xiàn)OGD/R 誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷過程中伴隨鐵死亡指標(biāo)MDA 及Fe2+、ROS水平上調(diào)，miR-22-3p表達(dá)水平降低。Gpx4在阻斷鐵死亡過程中起主要作用，本次研究發(fā)現(xiàn)OGD/R可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中Gpx4 表達(dá)下調(diào)。進(jìn)一步的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-22-3p下調(diào)了OGD/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞MDA 及Fe2+、ROS 水平，提高心肌細(xì)胞活力，上調(diào)Gpx4 表達(dá)，而鐵死亡抑制劑Fer-1 對(duì)過表達(dá)miR-22-3p后H9c2細(xì)胞活力及鐵死亡無明顯影響，提示miR-22-3p 對(duì)心肌細(xì)胞OGD/R 損傷的保護(hù)功效被Fer-1 阻斷，miR-22-3p 對(duì)心肌細(xì)胞OGD/R 損傷的保護(hù)機(jī)制依賴于降低鐵死亡。Cao 等[5]發(fā)現(xiàn)miR-22在OGD/R 誘導(dǎo)的大鼠神經(jīng)干細(xì)胞中表達(dá)降低，而過表達(dá)miR-22 可減輕OGD/R 誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞損傷。Yuan等[6]揭示心肌梗死患者心肌細(xì)胞中過表達(dá)miR-22-3p 能夠抑制腫瘤細(xì)胞鐵死亡。這些研究可一定程度上也支持本次研究結(jié)論，證實(shí)了miR-22-3p 通過抑制鐵死亡保護(hù)心肌細(xì)胞I/R 損傷的作用。

PLAGL2 是一類源自于PLAG 基因家族的鋅脂蛋白，也是一種細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子，可參與調(diào)控多種基因表達(dá)，已被報(bào)道在多種腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[7]，然而在I/R 損傷中鮮有研究。本次研究通過Targetscan 預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)PLAGL2 和miR-22-3p 存在特異性結(jié)合位點(diǎn)，且過表達(dá)miR-22-3p顯著降低H9c2細(xì)胞中PLAGL2蛋白水平。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示過表達(dá)miR-22-3p顯著降低PLAGL2-WT的熒光素酶活性，而對(duì)PLAGL2-MUT的熒光素酶活性無明顯影響，證實(shí)miR-22-3p 與PLAGL2 可直接結(jié)合。這些結(jié)果提示miR-22-3p通過靶向結(jié)合PLAGL2負(fù)調(diào)控其表達(dá)。此外，本次研究結(jié)果還顯示，PLAGL2過表達(dá)可明顯逆轉(zhuǎn)miR-22-3p 過表達(dá)誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞活力增加，MDA 及Fe2+、ROS 水平抑制和Gpx4表達(dá)上調(diào)，提示PLAGL2參與心肌I/R損傷后細(xì)胞活力和鐵死亡的調(diào)控，miR-22-3p 對(duì)心肌細(xì)胞損傷保護(hù)功效可能是通過靶向負(fù)調(diào)控PLAGL2蛋白表達(dá)來完成。Fan等[8]研究顯示，miR-22-3p可通過靶向調(diào)控PLAGL2表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲。在心肌I/R損傷過程中，miR-22-3p與PLAGL2存在調(diào)控關(guān)系，即miR-22-3p 可通過靶向調(diào)控PLAGL2 表達(dá)進(jìn)而抑制鐵死亡保護(hù)心肌I/R損傷。

綜上所述，本次研究結(jié)果證實(shí)了miR-22-3p 靶向調(diào)控PLAGL2 蛋白表達(dá)抑制鐵死亡，從而保護(hù)OGD/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，為開發(fā)新的臨床治療提供研究方向。本次研究缺乏體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，因此需要后續(xù)開展動(dòng)物研究進(jìn)一步確證miR-22-3p 對(duì)心肌缺血保護(hù)的分子機(jī)制。然而，本次研究只在體外細(xì)胞模型中探究miR-22-3p 對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，不能完全模擬人體心肌I/R 損傷。因此需要繼續(xù)開展動(dòng)物或原代心肌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，以進(jìn)一步確證miR-22-3p對(duì)心肌缺血保護(hù)的功效及分子機(jī)制。