紀(jì) 凱 黃天晴 谷 偉 劉恩慧 王高超 王炳謙郭福元 曹學(xué)彬 鄭龍華 董福霖 徐革鋒①

(1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)生物技術(shù)與遺傳育種重點實驗室 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所 黑龍江哈爾濱 150070;2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306; 3.煙臺經(jīng)海海洋漁業(yè)有限公司 山東煙臺 264006)

鮭鱒是世界第三大水產(chǎn)養(yǎng)殖品種, 據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織統(tǒng)計, 2019 年全球產(chǎn)量超過350 萬噸(FAO,2021)。中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒資料顯示, 2021 年我國鮭鱒總產(chǎn)量不足4 萬t, 同時相較于2020 年總產(chǎn)量約減少2.89%。鮭鱒因其肉質(zhì)鮮嫩可口而深受國內(nèi)外的消費者喜愛, 對其的需求量也因此逐年增加, 而我國虹鱒產(chǎn)量遠(yuǎn)不能滿足國內(nèi)市場的需求, 仍需從國外大量進(jìn)口(戶國等, 2017)。我國淡水養(yǎng)殖的鮭鱒品種主要以虹鱒(Oncorhynchus mykiss)為主, 虹鱒屬于鮭形目鮭科的一種廣鹽性魚類, 是我國廣泛養(yǎng)殖的冷水魚品種, 適宜生長的溫度為 12～18 °C (孫大江等,2010)。受到我國淡水資源日趨緊張及虹鱒生活習(xí)性的制約, 海水養(yǎng)殖虹鱒成為擴(kuò)大我國鮭鱒產(chǎn)量, 解決市場供不應(yīng)求的一種養(yǎng)殖方式。我國水產(chǎn)科技工作人員自20 世紀(jì)70 年代起在大連、煙臺、青島等地的開放海域嘗試養(yǎng)殖鮭魚, 但因夏季海水溫度過高不適合鮭鱒生存而失敗(董雙林, 2019)。然而, 在黃海中央洼地存在一個巨大的季節(jié)性冷水團(tuán), 為鮭鱒魚在海區(qū)開展養(yǎng)殖創(chuàng)造了條件(張竹琦, 1990; Yuet al, 2006;Dong, 2015; Xinet al, 2015; Hanet al, 2016)。

鰓和腸作為魚類滲透壓調(diào)節(jié)的重要器官, 能夠相互協(xié)調(diào)發(fā)揮作用, 兩組織均通過離子交換實現(xiàn)機(jī)體滲透壓調(diào)節(jié)(Giffard-Menaet al, 2006; Conet al,2017)。鰓和腸道中特定的離子轉(zhuǎn)運細(xì)胞通過多種離子通道和轉(zhuǎn)運蛋白來維持滲透壓平衡, 如nka和aqp3等。Nka通過為魚類體內(nèi)的許多離子轉(zhuǎn)運系統(tǒng)提供驅(qū)動力, 在維持魚類體內(nèi)滲透壓平衡的過程中發(fā)揮著重要作用(Kültz, 2015)。Aqp3是重要的水通道, 參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的水通量(Cutleret al, 2007)。環(huán)境鹽度的變化通過影響nka和aqp3的基因表達(dá)進(jìn)而對魚類的滲透壓平衡產(chǎn)生影響。鹽度和溫度的協(xié)同作用會對魚類的滲透壓平衡及消化吸收產(chǎn)生負(fù)面作用, 引起應(yīng)激現(xiàn)象發(fā)生。熱休克蛋白是機(jī)體在應(yīng)激情況下細(xì)胞內(nèi)迅速合成的一組蛋白質(zhì), 在應(yīng)對外界環(huán)境變化的過程中發(fā)揮著重要的作用。據(jù)報道,hsp70在水生動物適應(yīng)溫度和鹽度變化的過程中發(fā)揮著作用(Yanget al,1992)。同時, 腸道滲透壓調(diào)節(jié)功能還與消化和吸收密切相關(guān), 因為上皮組織吸收營養(yǎng)由離子梯度和膜轉(zhuǎn)運蛋白驅(qū)動(Bakkeet al, 2010), 腸道滲透壓的改變通過影響魚類的消化和吸收進(jìn)而影響魚類的生長和發(fā)育。gh-igf-1 軸是魚類生長發(fā)育的重要調(diào)控軸, 外界鹽度的變化可通過擾亂gh和igf-1等因子的表達(dá), 從而影響魚類的生長發(fā)育(李文笙等, 2010; 鄭艷等,2012; 岳蒙蒙, 2017)。

虹鱒具有很強(qiáng)的滲透壓調(diào)節(jié)能力, 經(jīng)過科學(xué)合理的鹽度馴化可以在海水中存活, 并表現(xiàn)出良好的生長性能(Thorarensenet al, 1996; 劉騁躍等, 2018)。早期研究主要集中于不同鹽度條件下虹鱒的馴化方式(付占斐等, 2020)、消化酶活性和氧化應(yīng)激能力(楊靜雯等, 2019)對虹鱒的影響, 而關(guān)于溫度和鹽度交互作用對虹鱒生長、滲透壓調(diào)節(jié)、消化酶活性及應(yīng)激影響的研究尚未見報道。本研究以虹鱒“水科1 號”為研究對象, 通過在3 種溫度(10、16 和22 °C)條件下均設(shè)置5 種鹽度梯度處理(鹽度分別為0、8、16、24、32), 進(jìn)行為期21 d 的養(yǎng)殖試驗, 比較探究溫度和鹽度交互作用對虹鱒生長、消化酶活性和生長、應(yīng)激和滲透壓調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)的影響, 以期為虹鱒的海水馴化和海水養(yǎng)殖提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗魚來源及暫養(yǎng)

虹鱒“水科1 號”來自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所渤海冷水性魚類實驗站。在循環(huán)控溫水族箱(180 cm×60 cm×50 cm)中暫養(yǎng)14 d 后進(jìn)行實驗, 暫養(yǎng)期間的光暗比為(12L : 12D), 水溫控制在(16±0.5) °C。暫養(yǎng)期間保持連續(xù)供氧, 實測溶解氧濃度為 7.8～10.0 mg/L, pH 7.1～7.5。暫養(yǎng)期間每日按照魚體重的2%投喂配合飼料(北京漢業(yè)科技有限公司), 實驗前一天停止投餌。挑選健康個體作為實驗對象備用, 規(guī)格為初始體長(14.16±1.03) cm、初始體重(40.00± 2.36) g。

1.2 實驗設(shè)計

實驗共設(shè)3 種溫度梯度(10、16 和22 °C), 同時每種溫度下設(shè)置5 個鹽度梯度處理(鹽度分別為0、8、16、24、32)。10 °C 條件下鹽度梯度分別以A1～A5表示; 16 °C 條件下分別以B1～B5表示; 22 °C條件下分別以C1～C5表示。以16 °C 且鹽度0 組作為基礎(chǔ), 采用日升(降)溫度1 °C 的同時日升鹽度2 的方法, 直至達(dá)到目的溫度和鹽度, 暫養(yǎng)1 d 后開展為期21 d 的養(yǎng)殖試驗, 實驗設(shè)計見表1。每種鹽度處理設(shè)置三組平行實驗組, 每個平行組放置8 尾魚。鹽度采用曝氣自來水與海水素(海之絢海洋生物有限公司, 青島, 中國)調(diào)配, 鹽度變化通過手持鹽度計(AZ-8371)測定。溫度通過循環(huán)控溫水族箱控制溫度, 溫差控制在±0.2 °C。實驗期間管理與暫養(yǎng)期間一致, 每日投喂商業(yè)飼料兩次至視覺飽足并做好記錄。實驗期間及時撈出死魚及糞便等。

表1 實驗設(shè)計表Tab.1 The experimental design

1.3 樣品采集

生長實驗結(jié)束后停食1 d, 將實驗魚經(jīng)MS-222麻醉后用電子天平(HC-C, 0.01 g)測量終末體重。隨后,分別從每種實驗條件下的三組平行組中各隨機(jī)選取6尾魚分別用于消化酶活性測定以及RNA 提取, 在無菌冰盤上解剖取得鰓和腸道組織(中腸), 剔除內(nèi)容物和脂肪, 經(jīng)液氮迅速冷凍后于–80 °C 超低溫冰箱中保存, 用于后續(xù)實驗測定。

1.4 腸組織酶活性測定

淀粉酶(AMS)活性、脂肪酶(LPS)活性及酶液蛋白含量測定均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行測定。相關(guān)酶活性及蛋白含量的測定均按照相應(yīng)的試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5 相關(guān)基因表達(dá)分析

將鰓和腸組織解凍后, 使用Simply P 總RNA 提取試劑盒(BioFlux, 杭州, 中國)對RNA 進(jìn)行提取。通過分光光度計在260 和280 nm 處測定吸光度值來檢測所提取RNA 的純度, 1%瓊脂糖凝膠電泳評估RNA的完整性。使用PrimeScript RT 試劑盒(TaKaRa, 大連,中國)合成cDNA。采用Roche 公司(瑞士) FastStart Universal SYBR?Green Master Mix (ROX)進(jìn)行實時定量PCR。qPCR 反應(yīng)體系為10.0 μL, PCR 反應(yīng)條件為: 95 °C 10 min, 95 °C 下變性15 s, 40 個循環(huán)60 °C下退火30 s。以β-actin作為內(nèi)參基因。使用CFX96 C1000 TOUCH 熒光定量儀(BIO-RAD, 美國)檢測Ct值, 通過2–ΔΔCt方法計算基因的相對表達(dá)水平, 每個樣本重復(fù)三次。實驗中所用到的引物序列見表2。

表2 PCR 引物的核苷酸序列Tab.2 The nucleotide sequences of PCR primers

1.6 計算公式與統(tǒng)計分析

餌料轉(zhuǎn)化率FCE (feed conversion efficiency)、增重率 WGR (weight gain rate)和特定生長率 SGR(specific growth rate)的計算公式如下:

式中,W0和Wt分別表示實驗魚初始體重和終末體重(g);Cw表示實驗魚在實驗期間總攝食量(g);t表示實驗時間(d)。

實驗數(shù)據(jù)均使用SPSS 25.0 版(SPSS Inc, Chicago,USA)進(jìn)行統(tǒng)計分析, 以溫度和鹽度作為自變量, 進(jìn)行雙因素方差分析(Two-Way ANOVA), 并采用Duncan 多重比較法檢驗不同實驗組平均值間是否存在差異(P<0.05)。統(tǒng)計結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示, 以P<0.05 作為差異顯著水平。使用GraphPad Prism 5.0 (San Diego, CA, USA) 可視化所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 不同溫度和鹽度對虹鱒“水科1 號”生長性能的影響

溫度和鹽度交互處理后虹鱒的FCE、WGR 和SGR 及存活率見表3。從表3 中可以看出, 10 °C 時, 隨著鹽度增大FCE、WGR 和SGR 三項指標(biāo)均呈下降趨勢; 除A1組FCE 與B1(淡水對照組)無顯著差異外,其余鹽度組FCE、WGR、SGR 三項指標(biāo)均低于B1(淡水對照組)。16 °C 時, 隨著鹽度增大FCE、WGR 和SGR 均呈先升高后下降的趨勢; 除B2組FCE、WGR和SGR 均高于B1(淡水對照組), 其余實驗組三項指標(biāo)均較B1(淡水對照組)下降。22 °C 時, 隨著鹽度增大FCE、WGR 和SGR 三項指標(biāo)均呈下降趨勢, 均顯著低于B1(淡水對照組)。此外, 養(yǎng)殖實驗過程中, 三種不同溫度條件下均在32 鹽度組中出現(xiàn)實驗魚死亡現(xiàn)象, 其中16 °C 時三組平行組共死亡1 尾魚, 10 °C時三組平行組共死亡3 尾魚, 22 °C 時三組平行組共死亡4 尾魚。不同溫度和鹽度處理后虹鱒的FCE、WGR 和SGR 雙因素方差分析結(jié)果如表4 所示。從表4 中可得出, 虹鱒的FCE、WGR 和SGR 均受到溫度和鹽度的交互影響顯著(P<0.05)。

表3 溫度和鹽度交互作用對虹鱒生長性能的影響Tab.3 Effect of temperature-salinity interaction on growth performance of rainbow trout

表4 溫度和鹽度及其交互作用對虹鱒生長性能影響的雙因素方差分析P 值Tab.4 Two-factor ANOVA P values for the effects of temperature, salinity, and their interaction on growth performance of rainbow trout

2.2 溫度和鹽度對虹鱒“水科1 號”腸組織中消化酶活性的影響

溫度和鹽度交互作用下虹鱒腸道淀粉酶活性和脂肪酶活性變化見圖1。由圖1 可知, 10 °C 時, 腸道中淀粉酶和脂肪酶活性均隨著鹽度增大呈降低趨勢,各鹽度組淀粉酶活性分別較對照組活性顯著降低約15%、16%、29%、53%和75% (P<0.05); 脂肪酶活性分別較對照組顯著下降約12%、21%、30%、39%和46% (P<0.05)。16 °C 時, 淀粉酶和脂肪酶活性隨著鹽度增大均呈先升高后下降的趨勢, 淀粉酶活性除B2組較對照組顯著升高約23%, 其余鹽度組淀粉酶活性分別較對照組顯著下降約25%、45%和49%; 脂肪酶活性除B2組較對照組顯著升高約8%, 其余鹽度組脂肪酶活性分別較對照組顯著下降約12%、24%和31%。22 °C 時, 腸道中淀粉酶活性和脂肪酶活性隨著鹽度的增大呈下降趨勢, 各鹽度組淀粉酶活性分別較對照組顯著下降約18%、32%、42%、51%和63%;脂肪酶活性分別較對照組顯著下降約10%、16%、19%、34%和47%。此外, 在同一鹽度條件下, 腸道中淀粉酶和脂肪酶活性均隨著溫度的升高呈先升高后下降的趨勢, 16 °C 實驗組顯著高于10 和22 °C 實驗組(P<0.05)。溫度和鹽度交互處理后虹鱒腸道中淀粉酶活性和脂肪酶活性雙因素方差分析結(jié)果如表5所示。從表5 中可以看出, 虹鱒腸道中淀粉酶活性和脂肪酶活性均受到溫度和鹽度的交互影響顯著(P<0.05)。

圖1 溫度和鹽度交互作用對虹鱒腸道消化酶活性的影響Fig.1 Effect of temperature- salinity interaction on intestinal digestive enzyme activity of rainbow trout

表5 溫度和鹽度及其交互作用對虹鱒腸道消化酶影響的雙因素方差分析P 值Tab.5 Two-factor ANOVA P values for the effects of temperature, salinity, and their interaction on the intestinal digestive enzyme activities of rainbow trout

2.3 溫度和鹽度交互作用對虹鱒“水科1 號”鰓和腸組織中基因表達(dá)的影響

鰓組織中g(shù)h表達(dá)量如圖2a, 結(jié)果表明, 10 °C 時,gh表達(dá)量隨著鹽度增大呈下調(diào)趨勢, 各實驗組分別較對照組顯著下調(diào)6%、10%、18%、22%和31%(P<0.05); 16 °C 時,gh表達(dá)量隨實驗組鹽度增大呈先上調(diào)后下調(diào)的趨勢, B2組和B3組表達(dá)量分別較對照組顯著上調(diào)約79%和47%, B4組較對照組無顯著差異(P>0.05), B5組較對照組顯著下調(diào)16% (P<0.05);22 °C 時,gh表達(dá)量隨著鹽度增大呈下調(diào)趨勢, 各實驗組分別較對照組顯著下調(diào)5%、7%、13%、19%和28% (P<0.05)。鰓組織中igf-1表達(dá)量如圖2b 所示, 從圖中可以觀察到,igf-1表達(dá)量的變化趨勢基本與gh一致, 10 °C 時,igf-1表達(dá)量隨著鹽度增大呈下調(diào)趨勢,各實驗組分別較對照組顯著下調(diào)1%、1%、8%、29%和49% (P<0.05); 16 °C 時,igf-1表達(dá)量隨實驗組鹽度增大呈先上調(diào)后下調(diào)的趨勢, B2組和B3組表達(dá)量分別較對照組顯著上調(diào)約48%和21%, B4組較對照組無顯著差異(P>0.05), B5組較對照組顯著下調(diào) 16%(P<0.05); 22 °C 時,igf-1表達(dá)量隨著鹽度增大呈下調(diào)趨勢, 各實驗組分別較對照組顯著下調(diào)1%、3%、7%、19%和27% (P<0.05)。鰓組織中hsp70表達(dá)量如圖2c所示, 各溫度下hsp70表達(dá)量隨鹽度增大呈上調(diào)趨勢,10 °C 時, 各鹽度組hsp70分別較對照組顯著上調(diào)約25%、98%、132%、218%和494% (P<0.05); 16 °C 時,除B2組和B3組較對照組無顯著差異外(P>0.05), 其余鹽度組分別較對照組顯著上調(diào)約 73%和 129%;22 °C 時, 各鹽度組分別較對照組顯著上調(diào)約68%、128%、118%、246%和301% (P<0.05)。鰓組織中aqp3表達(dá)量如圖2d 所示, 三種不同溫度下aqp3表達(dá)量隨鹽度增大均呈下調(diào)趨勢, 10 °C 時, 除A1組與對照組無顯著差異外(P>0.05), 其余鹽度組分別較對照組顯著下調(diào)9%、17%、25%和40% (P<0.05); 16 °C 時, 除B2組較對照組無顯著差異外(P>0.05), 其余鹽度組分別較對照組顯著下調(diào)10%、22%和33% (P<0.05);22 °C 時, 除C1 組較對照組無顯著差異外(P>0.05),其余鹽度組分別較對照組顯著下調(diào)6%、15%、25%和36% (P<0.05)。鰓組織中nka表達(dá)量如圖2e 所示,三種不同的溫度下nka表達(dá)量隨鹽度增大均呈上調(diào)趨勢, 10 °C 時, 除A1組與對照組無顯著差異外(P>0.05), 其余鹽度組分別較對照組顯著上調(diào)19%、98%、210%和390% (P<0.05); 16 °C 時, 除B2組較對照組無顯著差異外(P>0.05), 其余鹽度組分別較對照組顯著上調(diào)56%、155%和310% (P<0.05); 22 °C 時, 除C1組較對照組無顯著差異外(P>0.05), 其余鹽度組分別較對照組顯著上調(diào)9%、83%、198%和365% (P<0.05)。此外, 在鹽度相同溫度不同時, 16 °C 實驗組較10 °C和22 °C 實驗組gh和igf-1表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05)、hsp70表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)、aqp3表達(dá)量(除16和32 鹽度時)無顯著差異(P>0.05)、nka表達(dá)量(除0鹽度時)顯著下調(diào)(P<0.05)。不同溫度和鹽度處理后虹鱒鰓組織中g(shù)h、igf-1、hsp70、aqp3和nka基因表達(dá)雙因素方差分析結(jié)果如表6 所示。從表6 中可以看出,虹鱒鰓組織中g(shù)h、igf-1、hsp70、aqp3和nka基因表達(dá)均受到溫度和鹽度的交互影響顯著(P<0.05)。

圖2 溫度和鹽度交互作用對虹鱒鰓組織中g(shù)h、igf-1、hsp70、aqp3 和nka 基因表達(dá)的影響Fig.2 Effect of temperature-salinity interaction on gh, igf-1, hsp70, aqp3, and nka gene expression in gill tissue of rainbow trout

表6 溫度和鹽度及其交互作用對虹鱒鰓組織中g(shù)h、igf-1、hsp70、aqp3 和nka 影響的雙因素分析P 值Tab.6 Two-way ANOVA P values for the effects of temperature, salinity and their interaction on gh, igf-1, hsp70,aqp3, and nka in gill tissue of rainbow trout

腸組織中g(shù)h表達(dá)量如圖3a, 10 °C 時,gh表達(dá)量隨鹽度增大呈先上調(diào)后下降的趨勢, 除A2組較對照組無顯著差異外(P>0.05), 其余鹽度組分別較對照組顯著下調(diào)8%、14%、19%和25% (P<0.05); 16 °C 時gh表達(dá)量隨鹽度增大呈先上調(diào)后下調(diào)的趨勢, B2和B3組分別較對照組顯著上調(diào)77%和16% (P<0.05), 其余鹽度組分別較對照組顯著下調(diào)2%和11% (P<0.05);22 °C 時,gh表達(dá)量隨鹽度增大整體呈下降趨勢, 各鹽度組分別較對照組顯著下調(diào)10%、10%、19%、24%和31% (P<0.05)。腸組織中IGF表達(dá)量如圖3b, 10 °C時,igf-1表達(dá)量隨鹽度增大呈先上調(diào)后下調(diào)的趨勢,除A2組較對照組無顯著差異外(P>0.05), 其余鹽度組分別較對照組顯著下調(diào) 7%、11%、18%和 24%(P<0.05); 16 °C 時,igf-1表達(dá)量隨鹽度增大呈先上調(diào)后下調(diào)的趨勢, B2和B3組分別較對照組顯著上調(diào)92%和7% (P<0.05), 其余鹽度組分別較對照組顯著下調(diào)7%和13% (P<0.05); 22 °C 時,igf-1表達(dá)力隨鹽度增大呈下調(diào)的趨勢; 各實驗組分別均較對照組顯著下調(diào)9%、6%、19%、23%和30%(P<0.05)。腸組織中hsp70表達(dá)量如圖3c, 結(jié)果顯示, 不同溫度條件下hsp70表達(dá)量隨鹽度增大均呈上調(diào)趨勢; 10 °C 時,各鹽度組hsp70分別較對照組顯著上調(diào)約31%、29%、97%、159%和205% (P<0.05); 16 °C 時, 除B2組較對照組無顯著差異外(P>0.05), 其余鹽度組分別較對照組顯著上調(diào)約34%、93%和124%; 22 °C 時, 各鹽度組分別較對照組顯著上調(diào)約76%、71%、180%、217%和285% (P<0.05)。腸組織中aqp3表達(dá)量如圖3d, 不同溫度條件下aqp3表達(dá)量均隨鹽度增大呈上調(diào)趨勢,10 °C 時, 隨著鹽度組鹽度增大, 各鹽度組分別較對照組顯著下調(diào) 4%、45%、304%、316%和 497%(P<0.05); 16 °C 時, 隨著鹽度組鹽度增大, 各鹽度組分別較對照組顯著下調(diào)36%、176%、273%和418%(P<0.05); 22 °C 時, 隨著鹽度組鹽度增大, 各鹽度組分別較對照組顯著下調(diào)5%、60%、257%、291%和778% (P<0.05)。腸組織中nka表達(dá)量如圖3e, 三種不同的溫度下, 各實驗組nka表達(dá)量隨鹽度增大均呈上調(diào)趨勢, 10 °C 時, 隨著鹽度組鹽度增大, 各鹽度組分別較對照組顯著上調(diào)6%、135%、469%、595%和606%(P<0.05); 16 °C 時, 隨著鹽度組鹽度增大, 各鹽度組分別較對照組顯著上調(diào)61%、354%、597%和719%(P<0.05); 22 °C 時, 隨著鹽度組鹽度增大, 各鹽度組分別較對照組顯著上調(diào)18%、84%、350%、560%和700% (P<0.05)。此外, 在鹽度相同溫度不同時, 16 °C實驗組較10 °C 和22 °C 實驗組gh和igf-1表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05)、hsp70表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)。溫度和鹽度交互處理后虹鱒鰓組織中g(shù)h、igf-1、hsp70、aqp3和nka基因表達(dá)雙因素方差分析結(jié)果如表7 所示。從表7 中可以看出, 虹鱒腸組織中g(shù)h、igf-1、hsp70、aqp3和nka基因表達(dá)均受到溫度和鹽度的交互影響顯著(P<0.05)。

圖3 不同溫度和鹽度對虹鱒腸組織中g(shù)h、igf-1、hsp70、aqp3 和nka 基因表達(dá)的影響Fig.3 Effects of temperature and salinity on gh, igf-1, hsp70, aqp3,and nka gene expression in intestinal tissue of rainbow trout

表7 溫度和鹽度及其交互作用對虹鱒腸組織中g(shù)h、igf-1、hsp70、aqp3 和nka 影響的雙因素方差分析P 值Tab.7 Two-way ANOVA P values of the effects of temperature,salinity, and their interactions on gh, igf-1, hsp70, aqp3, and nka in rainbow trout intestinal tissues

3 討論

在溫度和鹽度馴化過程的中, 不同的升(降)溫和升鹽方式會影響魚類的生長發(fā)育及存活率。有研究表明, 通過較慢的升溫速率更能真實地反映自然環(huán)境中魚類受到影響(Galbreathet al, 2004; 姜旭陽等,2019)。因此本實驗選用日升溫度或日降溫度1 °C 的方式模擬養(yǎng)殖過程中面臨的溫度變化。有關(guān)魚類生長發(fā)育及存活率受到鹽度馴化方式的影響已有不少報道, 鹽度馴化過程中升鹽速率過大會影響魚類的生長發(fā)育。黃國強(qiáng)等(2013)對褐牙鲆(Paralichthy solivaceus)鹽度馴化的過程中發(fā)現(xiàn), 采用日升鹽度7的方式時, 褐牙鲆血清滲透壓需要2 d 才能恢復(fù)穩(wěn)定;采用日升鹽度14 的方式血清滲透壓則需要4 d 才能回復(fù)穩(wěn)定。付占斐等(2020)在研究不同鹽度馴化方式對虹鱒和硬頭鱒的影響中發(fā)現(xiàn), 隨著日升鹽度的增大存活率隨之下降, 作者指出, 采用緩慢的升鹽方式即日升鹽度2 進(jìn)行鹽度馴化更有利于虹鱒和硬頭鱒的生長發(fā)育。因此, 本實驗中采用日升鹽度2 的方式達(dá)到實驗?zāi)康柠}度, 在養(yǎng)殖試驗過程中, 三種不同溫度條件均在32 鹽度組中出現(xiàn)虹鱒死亡現(xiàn)象, 可能由于實驗魚個體間存在差異, 無法耐受當(dāng)前的實驗條件。溫度和鹽度是影響水產(chǎn)動物生長和存活的重要環(huán)境因子, 合適的溫度范圍以及適當(dāng)?shù)柠}度環(huán)境可促進(jìn)水產(chǎn)動物的生長發(fā)育, 反之則會產(chǎn)生不利影響(Buckelet al, 1995; 金方彭等, 2018; 王潤萍等, 2019;李培倫等, 2020b)。據(jù)報道, 硬骨動物血液中滲透壓約為12, 約為海水鹽度(38)的三分之一(Mylonaset al,2009)。大量研究表明, 中低鹽度下會促進(jìn)廣鹽性魚類的生長, 因為此時的鹽度更接近魚類的等滲點, 降低了對滲透壓調(diào)節(jié)的需求, 可為魚類生長提供更多的能量(Martinez-Cardenaet al, 2014; Godaet al, 2019;Haideret al, 2021)。本研究結(jié)果表明, 溫度和鹽度交互影響對虹鱒的FCE、WGR 和SGR 影響顯著(P<0.05)。在16 °C 時, 鹽度為8 實驗組虹鱒的FCE、WGR 和SGR 較B1淡水對照組顯著增加, 即適當(dāng)?shù)纳啕}度提高了虹鱒的生長性能。這在不同的廣鹽魚類中也有報道, 如歐洲鱸(Dicentrarchus labrax) (Bernardinoet al,2016)、黃鰭鯛(Acanthopagrus latus)和亞洲鱸(Lates calcarifer) (Mozanzadehet al, 2021)、大西洋鱈魚(Gadus morhua) (árnasonet al, 2013)等。

魚類的消化酶活性通過影響機(jī)體對營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收進(jìn)而影響魚類的生長發(fā)育, 而養(yǎng)殖水體中的溫度和鹽度是影響魚類消化酶活性的主要因素(歐志聯(lián), 2018)。本研究結(jié)果顯示, 同一鹽度不同溫度條件下, 虹鱒腸道中淀粉酶和脂肪酶的活性隨著溫度增大呈先升高后下降的趨勢。劉鑒毅等(2015)在溫度對點籃子魚(Siganus guttatus)消化酶活性影響的研究中發(fā)現(xiàn), 點籃子魚腸道中淀粉酶的活性隨著溫度的升高呈先升后降的趨勢。梅景良等(2004)在研究溫度和pH 對黑鯛(Sparus macrocephalus)腸等消化酶活性的影響中發(fā)現(xiàn), 脂肪酶活性的變化趨勢隨著溫度的升高先上升達(dá)到峰值后下降。上述研究結(jié)果與本實驗中觀察到的結(jié)果相似。本研究中, 同一溫度不同鹽度條件下, 10 °C 和22 °C 虹鱒腸道中淀粉酶和脂肪活性整體隨著鹽度的升高而降低; 16 °C 時, 腸道中脂肪酶和淀粉酶活性隨鹽度增大先升高后下降。楊靜雯等(2021)在研究鹽度對虹鱒和硬頭鱒消化酶活性的研究中發(fā)現(xiàn), 隨著鹽度的升高, 虹鱒腸道中脂肪酶活性表現(xiàn)為先升后降, 鹽度為5 時活性最高, 與本研究中溫度為16 °C、鹽度為8 實驗組的研究結(jié)果相近。諸多研究表明, 鹽度的變化對消化酶活性的影響有三種不同的情況, 分別為促進(jìn)、抑制和無顯著影響(羅鳴鐘等, 2015; 劉永士等, 2020; 李培倫等, 2020a)。本研究中, 受到溫度和鹽度的雙重影響, 虹鱒腸道中消化酶的活性在不同實驗條件下表現(xiàn)出不同的變化趨勢。造成這種現(xiàn)象的原因有很多, 虹鱒的最適生長溫度為12～18 °C, 高出或低于此溫度范圍都會影響虹鱒正常的生長發(fā)育(夏斌鵬等, 2017; 劉騁躍等, 2019;姜旭陽等, 2021)。溫度的變化會影響魚類獲取食物的欲望, 以及在腸道中消化食物吸收營養(yǎng)和儲存多余能量的能力(Volkoffet al, 2020)。環(huán)境鹽度的變化可能會改變魚類的飲水量、腸道中內(nèi)容物的pH 值以及離子濃度等, 進(jìn)而影響魚類的消化酶活性(Liuet al,2017; Mozanzadehet al, 2021)。本研究結(jié)果表明, 在適宜的溫度條件下, 適當(dāng)?shù)脑黾欲}度會促進(jìn)虹鱒的消化酶活性, 這與本研究中生長性能指標(biāo)相印證。同時, 在美洲鯡(Alosa sapidissima) (成永洲, 2015)、斜帶石斑魚(Epinephelus coioides) (Sakamotoet al, 1993)等的研究中也證實了這一點。

生長激素(Growth Hormone,gh)和胰島素生長因子(Insulin-like Growth Factor,igf)除了參與魚類生長發(fā)育調(diào)節(jié)作用外, 還能夠通過參與滲透壓調(diào)節(jié)來促進(jìn)水生生物鹽度適應(yīng)的過程(劉紅云等, 2004; 董云偉等, 2008)。養(yǎng)殖水體溫度和鹽度的變化不僅會影響魚類的生長發(fā)育, 滲透壓調(diào)節(jié)等, 還會導(dǎo)致魚類產(chǎn)生異常的應(yīng)激反應(yīng)。在本研究中, 鰓和腸組織中g(shù)h和igf-1表達(dá)量在16 °C 時隨實驗組鹽度增大呈先升高后下降的趨勢, 鹽度為8 實驗組表達(dá)量較對照組顯著上調(diào)(P<0.05), 說明此鹽度下利于促進(jìn)虹鱒的生長。Madsen 等(1992)在對褐鱒(Salmo trutta)和虹鱒海水適應(yīng)的研究中指出, 低鹽度下gh表達(dá)量上調(diào)從而促進(jìn)了魚體的生長發(fā)育。李明云等(2015)在研究低鹽脅迫對大黃魚(Pseudosciaena crocea)gh和igf-1基因表達(dá)變化的影響時指出, 低鹽環(huán)境下大黃魚鰓、肝和腸等組織中g(shù)h和igf-1的表達(dá)量升高。二者的研究結(jié)果與本研究相似。但在10 °C 和22 °C 時, 虹鱒鰓和腸組織中g(shù)h和igf-1表達(dá)量隨著鹽度的升高整體呈現(xiàn)下降趨勢。這可能是由于在溫度和鹽度的雙重因素影響下,虹鱒處于應(yīng)激狀態(tài)而抑制了鰓和腸組織中g(shù)h和igf-1基因的表達(dá)。

熱休克蛋白70 (Heat Shock Protein,hsp70)又稱應(yīng)激蛋白70, 是HSPs 家族中重要的一員, 當(dāng)機(jī)體處于應(yīng)激條件下(溫度、鹽度等)時會被誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)。有報道稱,hsp70參與水生動物溫度和鹽度適應(yīng)的過程(Bakkeet al, 2010)。本研究結(jié)果顯示, 鰓和腸組織中hsp70的相對表達(dá)量在各溫度下均隨實驗組鹽度增大呈上調(diào)趨勢。在鹽度相同溫度不同時, 鰓和腸組織中hsp70表達(dá)量均表現(xiàn)為22 °C 時最高, 10 °C 次之,16 °C 最低。虹鱒鰓和腸組織中hsp70相對表達(dá)量不同程度的變化, 說明溫度和鹽度的交互影響造成虹鱒體內(nèi)應(yīng)激現(xiàn)象的產(chǎn)生。據(jù)報道稱, 溫度和鹽度的變化會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)肽鏈?zhǔn)ピ械恼郫B結(jié)構(gòu), 使空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變, 失去原有功能;hsp70會在外界因素刺激下大量表達(dá), 修復(fù)或降解細(xì)胞內(nèi)的變性蛋白質(zhì), 增加機(jī)體的抗應(yīng)激能力, 從而緩解溫度和鹽度變化帶來的應(yīng)激壓力(任寶波等, 2005; 辛苑茹等, 2019)。

養(yǎng)殖環(huán)境鹽度的改變會影響魚類滲透壓平衡,進(jìn)而影響魚類的生長發(fā)育。鰓和腸作為魚類滲透壓調(diào)節(jié)的重要器官, 能夠相互協(xié)調(diào)發(fā)揮作用, 兩組織通過離子交換、吸收水分等方式實現(xiàn)機(jī)體滲透壓調(diào)節(jié)。在本研究中, 我們觀察到暴露于不同溫度和鹽度下虹鱒鰓和腸道中aqp3的表達(dá)存在差異。鰓組織中, 不同溫度下,aqp3表達(dá)量隨著實驗組鹽度增大呈下調(diào)趨勢。Tipsmark 等(2010)在對大西洋鮭(Salmo salar)海水馴化時滲透壓調(diào)節(jié)組織中水通道蛋白表達(dá)的研究中發(fā)現(xiàn), 海水條件下會誘導(dǎo)大西洋鮭鰓組織中aqp3的表達(dá)下調(diào)。Cutler 等(2002)和Giffard-Mena 等(2007)分別在對歐洲鰻鱺(Anguilla anguilla)和歐洲鱸受鹽度影響的研究中指出, 海水馴化后廣鹽魚的鰓組織中aqp3表達(dá)量呈下調(diào)趨勢。上述研究與本實驗中觀察到的結(jié)果相似。有報道指出,aqp3在鰓組織中的作用可能是通過促進(jìn)水流出鰓上皮到循環(huán)系統(tǒng)中(Cutleret al, 2000)。但這不利于處于高鹽環(huán)境中的魚類維持滲透壓的平衡, 這可能是造成鰓組織中aqp3表達(dá)量下調(diào)的原因。在本研究的腸組織中, 不同溫度下, 腸組織中aqp3的表達(dá)量隨實驗組鹽度增大呈上調(diào)趨勢。Choi 等(2013)在對紅大馬哈魚(Oncorhynchusnerka)海水馴化的研究中發(fā)現(xiàn), 腸組織中aqp3表達(dá)量會增加, 與本實驗的研究結(jié)果相似。眾多的研究表明,aqp3存在于腸道的上皮細(xì)胞中, 通過吸收控制鹽分的流入來維持滲透壓的平衡(Martinezet al, 2005), 本研究腸組織aqp3表達(dá)量的變化表明其在維持滲透壓平衡中發(fā)揮著作用。在本研究中, 不同溫度下, 虹鱒鰓和腸組織中nka表達(dá)量均隨實驗組鹽度增大呈上調(diào)趨勢。這與Tang 等(2012)對經(jīng)鹽度馴化的日本鰻鱺(Anguilla japonica)鰓組織中的nka和Chourasia 等(2018)對高鹽適應(yīng)下羅非魚(Oreochromis mossambicus)腸道中nka的表達(dá)趨勢一致。nka對維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要, 通過進(jìn)行離子轉(zhuǎn)運產(chǎn)生初始電化學(xué)梯度,為其他跨膜蛋白進(jìn)行離子和水交換提供基礎(chǔ), 在維持魚類滲透壓平衡中發(fā)揮著重要的作用(Zhanget al,2019; Saghafiankhoet al, 2020)。在虹鱒鰓和腸組織中觀察到aqp3和nka不同程度的表達(dá)水平, 表明aqp3和nka在到維持虹鱒滲透壓平衡的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用。

4 結(jié)論

綜上可得出結(jié)論, 本文研究了不同鹽度和溫度對虹鱒“水科1 號”生長指標(biāo)、消化酶活性及相關(guān)基因表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 16 °C 下, 鹽度為8 實驗組的虹鱒較淡水對照組生長表現(xiàn)更好, 即虹鱒在適宜生長的溫度下, 適當(dāng)?shù)奶嵘B(yǎng)殖水體鹽度有利于促進(jìn)虹鱒的生長。本研究中還發(fā)現(xiàn), 與低鹽度組相比, 各溫度下高鹽度組整體的試驗周期雖然更長, 但從生長指標(biāo)、消化酶活性及鰓和腸組織中基因表達(dá)的結(jié)果來看, 并沒有彌補(bǔ)鹽度升高帶來的負(fù)面影響, 盡管在最適的生長溫度下, 高鹽度仍抑制了虹鱒的生長發(fā)育。本研究為溫度和鹽度變化對虹鱒海水馴化和海水養(yǎng)殖的研究提供了基礎(chǔ)資料。