鄭 婷,魏靈珠,向 江,程建徽,吳 江

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所,杭州,310021)

葡萄是果樹生產(chǎn)上的重要樹種。我國(guó)葡萄產(chǎn)業(yè)發(fā)展快速,由于栽培技術(shù)和設(shè)施的完善,葡萄“上山下灘”,種植區(qū)域不斷擴(kuò)大,種植面積與產(chǎn)量迅速增加,成為我國(guó)6大水果之一[1]。為了提高葡萄的適應(yīng)能力,人們通常使用砧木進(jìn)行嫁接[2]。嫁接育苗不僅可以增強(qiáng)葡萄抗病和抗逆能力,還能改善接穗的生長(zhǎng)結(jié)果習(xí)性,加快新品種的繁殖[3-5]。在國(guó)際葡萄品種目錄數(shù)據(jù)庫(kù)中,已有1 343個(gè)砧木品種進(jìn)行了登記[6]。其中,國(guó)內(nèi)常用的砧木主要有“SO4”“5BB”“3309C”“貝達(dá)”“1103P”“140R”和“520A”等[7]。

“陽(yáng)光玫瑰”以“安蕓津21號(hào)”與“白南”為親本雜交而成,無(wú)論是外觀和內(nèi)在品質(zhì),還是品種抗性方面都表現(xiàn)優(yōu)異[8]。近年來(lái),隨著栽培水平的提高,“陽(yáng)光玫瑰”成為葡萄界的“愛(ài)馬仕”,受到消費(fèi)者的一致追捧。簡(jiǎn)小楠[9]測(cè)定了14種砧木對(duì)“陽(yáng)光玫瑰”物候期、生長(zhǎng)結(jié)果習(xí)性、果實(shí)品質(zhì)的影響,發(fā)現(xiàn)“3309C”“SO4”“Gloire”是浙江地區(qū)最適合“陽(yáng)光玫瑰”的砧木品種。而劉帥等的研究證實(shí),“陽(yáng)光玫瑰”自根苗的幼苗光合特性比砧穗組合的光合能力更佳[10]。由于南北方的氣候差異,在進(jìn)行嫁接育苗時(shí),南方主要利用1年生的砧木小苗,北方主要利用多年生的砧木,或者采用高接。

目前,有關(guān)“陽(yáng)光玫瑰”的砧穗組合研究較多,但多集中于其對(duì)果實(shí)品質(zhì)的影響,而在葡萄所處生長(zhǎng)階段的轉(zhuǎn)變以及分子水平的驗(yàn)證缺乏理論依據(jù)。因此,本研究以“陽(yáng)光玫瑰”和3種生產(chǎn)常用的砧木“SO4”“5BB”和“3309C”作為試驗(yàn)材料,分別將“陽(yáng)光玫瑰”嫁接到1年生和多年生的砧木上,結(jié)合植物學(xué)習(xí)性、細(xì)胞學(xué)觀察和分子生物學(xué),研究不同砧木對(duì)“陽(yáng)光玫瑰”生長(zhǎng)的影響,旨在明確嫁接對(duì)接穗生長(zhǎng)狀態(tài)轉(zhuǎn)變的作用以及對(duì)花芽分化能力的影響,篩選“陽(yáng)光玫瑰”適合的砧木,為生產(chǎn)中“陽(yáng)光玫瑰”的嫁接栽培提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試材

供試砧木品種為“3309C”“SO4”和“5BB”(見(jiàn)表1),接穗為5年生“陽(yáng)光玫瑰”葡萄上生長(zhǎng)健壯、芽飽滿、不帶病毒的當(dāng)年生木質(zhì)化新梢。試驗(yàn)地點(diǎn)在浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院楊渡試驗(yàn)基地,常規(guī)管理。經(jīng)過(guò)對(duì)葡萄新梢、葉片等指標(biāo)的調(diào)查,確定了品種的真實(shí)性。

表1 3個(gè)葡萄砧木品種特性

1.2 嫁接處理

接穗采集:5—6月,當(dāng)砧木和接穗的新梢均達(dá)到半木質(zhì)化時(shí),早晨采集半木質(zhì)化的“陽(yáng)光玫瑰”接穗,去除所有葉片,選擇生長(zhǎng)充實(shí)的新梢中部,留1～2個(gè)芽,保留葉柄1～2 cm,并用濕毛巾包裹或放入水中,以防失水。

砧木選擇:1年生扦插苗及多年生“3309C”“SO4”“5BB”自根苗,選擇生長(zhǎng)健壯的新梢,粗度與接穗相近。

嫁接:采用單芽劈接法,將接穗嫁接到1年生扦插苗及多年生自根苗上,砧木新梢保留4～6片葉短截,嫁接后用塑料薄膜包扎。待嫁接芽長(zhǎng)出8～10片葉時(shí)統(tǒng)計(jì)葉片及枝條形態(tài)學(xué)特征,枝條上、中、下部位的葉片取樣,測(cè)定葉片長(zhǎng)度、葉片寬度、節(jié)間長(zhǎng)度、節(jié)間粗度、葉片數(shù)和卷須數(shù)。

1.3 石蠟切片制作

取材:取1年生和多年生砧木嫁接的“陽(yáng)光玫瑰”的上部和下部葉片,用固定液固定24 h以上。將葉片從固定液取出,在通風(fēng)櫥內(nèi)用手術(shù)刀將目的部位組織修平整,將修切好的組織和對(duì)應(yīng)的標(biāo)簽放于脫水盒內(nèi)。

脫水浸蠟:將脫水盒放進(jìn)脫水機(jī)內(nèi)依次梯度酒精進(jìn)行脫水。75%酒精4 h,85%酒精2 h,90%酒精2 h,95%酒精1 h,無(wú)水乙醇I 30 min,無(wú)水乙醇II 30 min,醇苯5～10 min,二甲苯I 5～10 min,二甲苯II 5～10 min,65 ℃融化石蠟I 1 h,65 ℃融化石蠟II 1 h,65 ℃融化石蠟III 1 h。

包埋:將浸好蠟的葉片于包埋機(jī)內(nèi)進(jìn)行包埋。先將融化的蠟放入包埋框,待蠟?zāi)讨皩⑷~片從脫水盒內(nèi)取出,按照包埋面的要求放入包埋框并貼上對(duì)應(yīng)的標(biāo)簽。于-20 ℃凍臺(tái)冷卻,蠟?zāi)毯髮⑾瀴K從包埋框中取出并修整蠟塊。

切片:將修整好的蠟塊,放入-20 ℃凍臺(tái)冷卻,再將冷卻的蠟塊置于石蠟切片機(jī)切片,厚4 μm。切片漂浮于攤片機(jī)40 ℃溫水上,將葉片展平,載玻片將葉片撈起,60 ℃烘箱內(nèi)烤片。水烤干蠟烤化后取出常溫保存?zhèn)溆?用于觀察葉片細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

1.4 葉綠素含量測(cè)定

利用分光光度計(jì)法檢測(cè)“陽(yáng)光玫瑰”嫁接苗和自根苗的上部、下部葉片的葉綠素含量,稱取0.5 g經(jīng)液氮研磨過(guò)的葉片,加入預(yù)冷的95%乙醇5 mL,避光浸提24 h后,8 000 rpm離心20 min,提取上清液后分別測(cè)定663 nm、645 nm下的吸光值,Ca=12.72 A663-2.59 A645,Cb=22.88 A645-4.67 A663,C=Ca+Cb,Ca、Cb分別為葉綠素a和葉綠素b的濃度。

1.5 開(kāi)花相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)

利用改良CTAB法從葡萄葉片中提取總RNA,使用PrimeScriptTM RT試劑盒(Takara,Tokyo,Japan)合成cDNA。選擇葡萄開(kāi)花路徑關(guān)鍵基因VvFLC、VvSOC、VvTFL、VvFT、VvAP1、VvAP2、VvLFY進(jìn)行表達(dá)水平檢測(cè),以VvActin作為內(nèi)參基因,基因表達(dá)水平的計(jì)算采用2-△Ct方法[11]。用Primer 5軟件設(shè)計(jì)qRT-PCR引物(見(jiàn)表2)。

表2 引物列表

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2016軟件處理數(shù)據(jù)和制圖,利用SPSS軟件進(jìn)行方差分析,顯著性由鄧肯氏新復(fù)極差法檢驗(yàn)(p<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同砧木對(duì)“陽(yáng)光玫瑰”葡萄枝條生長(zhǎng)的影響

1年生和多年生砧木對(duì)“陽(yáng)光玫瑰”枝條和葉片的生長(zhǎng)有明顯影響。嫁接在多年生砧木上的“陽(yáng)光玫瑰”的葉片長(zhǎng)、寬均比嫁接在1年生砧木上的大,而葉片形狀沒(méi)有明顯差異(見(jiàn)圖1)。嫁接在多年生砧木上的“陽(yáng)光玫瑰”比1年生砧木的節(jié)間長(zhǎng)0.38～2.97 cm,其中“5BB”和“3309C”的差異比“SO4”大,嫁接在多年生“5BB”砧木上的節(jié)間粗比1年生砧木大0.13 cm(見(jiàn)表3)。

表3 “陽(yáng)光玫瑰”嫁接在不同砧木上的枝梢生長(zhǎng)指標(biāo)

在3種砧木中,嫁接在“5BB”上的“陽(yáng)光玫瑰”枝條節(jié)間長(zhǎng)和節(jié)間粗均小于嫁接在“SO4”和“3309C”的“陽(yáng)光玫瑰”,葉片數(shù)和卷須數(shù)也更少(見(jiàn)表3)。

2.2 不同砧木對(duì)“陽(yáng)光玫瑰”葉綠素含量的影響

通過(guò)檢測(cè)葉綠素含量發(fā)現(xiàn),下部葉片的葉綠素含量均比上部葉片高,尤其在“SO4”砧木中,下部葉片葉綠素含量最高,“5BB”砧木最低?！瓣?yáng)光玫瑰”嫁接在“5BB”砧木上的長(zhǎng)勢(shì)最弱,整體葉綠素水平比嫁接在“SO4”和“3309C”上的都低(見(jiàn)圖2)。

2.3 不同砧木對(duì)“陽(yáng)光玫瑰”葉片細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響

葡萄葉片的結(jié)構(gòu)從上到下依次為上表皮、柵欄組織、海綿組織和下表皮。上下表皮由單層細(xì)胞構(gòu)成,排列緊密,上表皮面積大于下表皮。柵欄組織為單層細(xì)胞,垂直上表皮分布,圓柱形細(xì)胞,排列緊密整齊。海綿組織為多層細(xì)胞,分布松散,排列疏松,細(xì)胞間隙大。

相比多年生砧木,嫁接在1年生砧木苗上的“陽(yáng)光玫瑰”的葉片薄壁細(xì)胞少、氣孔數(shù)少、主脈最外側(cè)細(xì)胞活躍排列更緊密,內(nèi)部細(xì)胞不規(guī)則,組織不發(fā)達(dá),柵欄組織排列不緊密,海綿組織所占比例大。嫁接在多年生砧木上的“陽(yáng)光玫瑰”的莖尖細(xì)胞活躍,排列緊密,分生能力強(qiáng)(見(jiàn)圖3)。

圖3 嫁接在1年生和多年生砧木上的“陽(yáng)光玫瑰”的細(xì)胞結(jié)構(gòu)

2.4 不同砧木對(duì)“陽(yáng)光玫瑰”開(kāi)花相關(guān)基因表達(dá)的影響

由圖4可知,在“陽(yáng)光玫瑰”自根苗中,7個(gè)開(kāi)花相關(guān)基因的表達(dá)量依次為VvFLC>VvSOC>VvAP2 >VvTFL>VvLFY>VvAP1 >VvFT。VvFT、VvTFL、VvLFY、VvAP1、VvFLC在砧木“3309C”“SO4”“5BB”中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于嫁接“陽(yáng)光玫瑰”之后。嫁接在1年生“SO4”和“3309C”砧木苗上的“陽(yáng)光玫瑰”的VvFT、VvTFL、VvAP2、VvSOC、VvFLC的表達(dá)量高于嫁接在“SO4”和“3309C”多年生砧木苗上的表達(dá)量?！瓣?yáng)光玫瑰”嫁接在1年生的“SO4”和“3309C”砧木苗上,階段轉(zhuǎn)化特征基因VvFT的表達(dá)量高于“陽(yáng)光玫瑰”自根苗,VvTFL的表達(dá)量低于“陽(yáng)光玫瑰”自根苗。VvLFY、VvSOC、VvFLC在嫁接后的表達(dá)量也比在“陽(yáng)光玫瑰”自根苗中低。在對(duì)“5BB”砧木的研究中,由于植株生長(zhǎng)狀況的原因,呈現(xiàn)出與其他砧木不同的規(guī)律,其中,嫁接在多年生砧木上的“陽(yáng)光玫瑰”的VvFT、VvAP2、VvSOC、VvFLC基因表達(dá)量較高,其他基因較低。

圖4 嫁接在不同砧木苗上的“陽(yáng)光玫瑰”的開(kāi)花相關(guān)基因表達(dá)水平

3 討論

近年來(lái),“陽(yáng)光玫瑰”以品質(zhì)佳、抗性強(qiáng)、耐貯運(yùn)的特點(diǎn)快速搶占了我國(guó)葡萄市場(chǎng)。為了提高“陽(yáng)光玫瑰”的適應(yīng)性和生長(zhǎng)速度,砧木嫁接是生產(chǎn)中最常用的方法[12-14]。砧木能夠提高葡萄的抗性,降低非生物脅迫對(duì)葡萄的傷害[15-17]?！癝O4”“5BB”“3309C”是我國(guó)葡萄生產(chǎn)中常用的砧木,劉眾杰等[7]研究表明,“SO4”和“3309C”對(duì)澇害、干旱、鹽害有著較強(qiáng)的抗性,“5BB”對(duì)澇害也有一定的抗性,本研究中將“陽(yáng)光玫瑰”嫁接在“SO4” “5BB”“3309C”3種砧木上,“5BB”的生長(zhǎng)狀況遠(yuǎn)不如其他兩種砧木。

童期是實(shí)生葡萄生長(zhǎng)必經(jīng)的過(guò)程,通過(guò)無(wú)性繁殖雖然沒(méi)有童期,但也有著營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)為主的幼樹期。在葡萄階段轉(zhuǎn)化過(guò)程中形態(tài)學(xué)和生理生化物質(zhì)發(fā)生了變化,包括葉面積增大、厚度增加、顏色加深、芽由癟小細(xì)長(zhǎng)變飽滿鈍圓,出現(xiàn)卷須,葉組織發(fā)達(dá)、薄壁細(xì)胞增多、氣孔數(shù)增多、木質(zhì)部牢固性降低等[18]。本研究中,嫁接在多年生砧木上的“陽(yáng)光玫瑰”葉片長(zhǎng)、寬均比嫁接在1年生砧木上的大,嫁接在“5BB”砧木上的葉綠素水平比“SO4”和“3309C”低;1年生苗嫁接的“陽(yáng)光玫瑰”葉片薄壁細(xì)胞少、氣孔數(shù)少、主脈最外側(cè)細(xì)胞活躍排列更緊密。多年生苗嫁接的“陽(yáng)光玫瑰”莖尖細(xì)胞活躍,排列緊密,分生能力強(qiáng),卷須數(shù)目更多?；ㄑ糠只芰Φ墨@得代表了葡萄從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)換,這一過(guò)程與FT、TFL、LFY、MADS、AP2、FLC、SOC、AP3等花芽分化相關(guān)基因有關(guān)[18-20]。其中FT為成花素基因,誘導(dǎo)開(kāi)花;TFL1為花序分生組織特征基因,延長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng),抑制開(kāi)花;LFY/AP1抑制TFL1,促進(jìn)轉(zhuǎn)化;FLC、AP2為抑制成花基因[21-24]。本研究中,由于砧木的品種差異造成了花芽分化相關(guān)基因的表達(dá)差異,嫁接在1年生“SO4”和“3309C”砧木上的“陽(yáng)光玫瑰”的VvFT、VvTFL、VvAP2、VvSOC、VvFLC的表達(dá)量高于多年生上述砧木,階段轉(zhuǎn)化特征基因VvFT的表達(dá)量高于“陽(yáng)光玫瑰”自根苗,VvTFL的表達(dá)量低于“陽(yáng)光玫瑰”自根苗,表明嫁接促進(jìn)了“陽(yáng)光玫瑰”花芽分化能力的獲得,加速了從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)換。

當(dāng)然,生長(zhǎng)階段的轉(zhuǎn)換過(guò)程受環(huán)境、栽培技術(shù)等外界條件以及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、基因表達(dá)等內(nèi)在引物的共同調(diào)控[25-27],從而控制新梢生長(zhǎng),改變花芽分化的能力。因此,在實(shí)際生產(chǎn)中,在有效利用嫁接技術(shù)的基礎(chǔ)上,也要關(guān)注栽培技術(shù)的配套和葡萄園環(huán)境的有效調(diào)控。

4 結(jié)論

綜合本研究結(jié)果與生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)說(shuō)明,嫁接技術(shù)可改變葡萄生長(zhǎng)階段的轉(zhuǎn)換,促進(jìn)花芽分化能力的獲得。嫁接在多年生砧木上比嫁接在1年生砧木上的“陽(yáng)光玫瑰”葡萄植株生長(zhǎng)更加健壯,莖尖細(xì)胞更活躍,分生能力更強(qiáng)。從“陽(yáng)光玫瑰”的嫁接結(jié)果來(lái)看,“3309C”和“SO4”比“5BB”更適合作為“陽(yáng)光玫瑰”的嫁接砧木。