馮蓬 ，朱立國 ，高春雨 ，張威 ，高景華 ，孫凱 ，李路廣 ，車穎 ，回瑾

1.中國中醫(yī)科學院望京醫(yī)院，北京 100020； 2.山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南 250355

椎間盤退變（intervertebral disc degeneration，IDD）是導致盤源性腰痛和其他脊柱退行性疾病的主要原因[1]，是大部分脊柱退行性疾病的重要病理基礎，往往在MRI影像中被早期識別[2]。國外研究表明，腰痛的終生患病率高達84%，慢性腰痛的患病率約為23%，有11%～12%患者因腰痛致殘[3]。隨著人們生活方式的改變，腰痛患病率逐年增加且有年輕化趨勢，與IDD的病理改變高度相關[4]。

細胞焦亡是細胞程序性死亡的一種方式。越來越多的研究表明，IDD與髓核細胞（NPCs）焦亡相關，腫瘤壞死因子（TNF）-α及其進一步激活的核因子（NF）-κB信號通路可能是NPCs焦亡的中心環(huán)節(jié)[5]。在退變的NPCs中，TNF-α、NOD樣受體蛋白3（NLRP3）、胱天蛋白酶（Caspase）-1、白細胞介素（IL）-1β表達顯著上調(diào)，其水平能夠反映NPCs的焦亡程度[6]。焦亡的髓核組織進一步釋放炎性介質(zhì)，誘導炎性細胞浸潤，引發(fā)炎癥級聯(lián)反應[7]。抑制NLRP3激活可以減少細胞外基質(zhì)降解，對NPCs起到保護作用，從而緩解IDD。

壯腰通絡方是朱立國教授在《外臺秘要》腰痛類方的證治特點及用藥規(guī)律基礎上總結(jié)而成[8]，具有補益肝腎、活血通絡作用，用于治療脊柱退行性疾病所致腰痛及腰椎功能障礙，臨床應用多年，療效顯著[9]。實驗研究發(fā)現(xiàn)，該方能降低腰椎間盤退行性病變大鼠血清炎癥因子水平，增加椎間盤組織NPCs數(shù)量[10]。本研究觀察壯腰通絡方對IDD大鼠NPCs焦亡的影響，進一步探究其延緩IDD的作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物

8周齡SPF級雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量（200±20）g，購于中國食品藥品檢定研究院，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2017-0005。飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學院中醫(yī)基礎理論研究所動物房，通風良好，溫度20～25 ℃，濕度40%～50%，12 h/12 h光暗交替，自由攝食飲水，動物使用許可證號SYXK（京）2021-0017。本實驗經(jīng)北京隆安實驗動物中心倫理委員會審批（BJLongan-L-L-003）。

1.2 藥物及制備

壯腰通絡方由杜仲、熟地黃、當歸、丹參、延胡索、獨活、川芎、秦艽、牛膝按15∶15∶12∶12∶10∶10∶10∶12∶12比例組成，飲片購于中國中醫(yī)科學院望京醫(yī)院中藥房，由中國中醫(yī)科學院望京醫(yī)院骨傷科研究所制成原藥材濃度分別為25.2、12.6、6.3 g/mL濃縮液備用。TNF-α競爭性抑制劑依那西普，美國MedChemExpress，純度≥98.0%，貨號HY-108847，使用前用生理鹽水配制成1 g/mL溶液。

1.3 主要試劑與儀器

BCA蛋白定量檢測試劑盒、RIPA裂解液、Cocktail蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、PMSF、蛋白上樣緩沖液、抗體稀釋液、ECL試劑盒（武漢Servicebio，貨號分別為G2026-200T、G2002-30ML、G2006-250UL、G2007-1ML、G2008-1ML、G2013-1ML、G2025-100ML、G2014-50ML），中性甲醛（上海碧云天生物技術有限公司，貨號P0099），10%EDTA脫鈣液（武漢Servicebio，貨號G1105），TNF-α、IL-18 ELISA試劑盒（英國Abcam，貨號分別為ab236712、ab213909），IL-1β ELISA試劑盒（美國Invitrogen，貨號ER5RBX5），Ⅱ型膠原（collagenⅡ）抗體（英國Abcam，貨號ab307674），聚集蛋白聚糖（aggrecan）抗體（美國Proteintech，貨號13880-1-AP），NLRP3、Caspase-1、NF-κB p65、NF-κB抑制蛋白（IκB）-α抗體（武漢Servicebio，貨號分別為GB114320、GB11383、GB11997、GB11212）。垂直電泳儀（武漢Servicebio，型號BV-2），病理切片機（上海徠卡儀器有限公司，型號RM2016），顯微鏡（日本尼康儀器有限公司，型號E100），核磁共振成像系統(tǒng)（德國Siemens，型號MAGNETOM skyra3.0T）。

2 實驗方法

2.1 分組及造模

48只大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為正常組、模型組、依那西普組和壯腰通絡方高、中、低劑量組，每組8只。除正常組外，其余各組采用針刺尾椎法建立IDD模型[11-12]：戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，選定C6-7、C7-8為針刺間隙，消毒皮膚，以26G針頭經(jīng)纖維環(huán)水平穿至髓核中，穿入后將針體旋轉(zhuǎn)360°，保持30 s后垂直拔出，無菌棉球按壓針孔15 s。分別于第0、14、28日穿刺。

2.2 給藥方法和模型評定

于首次造模后次日開始給藥，壯腰通絡方高、中、低劑量組分別予252、126、63 g/kg壯腰通絡方藥液灌胃（相當于60 kg成人臨床用藥量的2、1、0.5倍），灌胃體積10 mL/kg，每日1次，連續(xù)30 d。正常組、模型組和依那西普組灌胃等體積生理鹽水。依那西普組造模同時于針刺處注射1 mg/mL依那西普溶液，注射體積10 mL/kg，模型組和壯腰通絡方高、中、低劑量組注射等體積生理鹽水。給藥結(jié)束后，利用核磁共振成像系統(tǒng)掃描C6-7、C7-8椎間盤和C8-9椎間盤（正常對照），以評估IDD程度。

2.3 取材

給藥結(jié)束后麻醉大鼠，腹主動脈取血，3 000 r/min離心15 min，吸取上清液，置于-80 ℃冰箱保存。用鑷子和手術刀剔除附著在C6-7椎間盤周圍的軟組織，使其可清晰分辨椎體和纖維環(huán)包裹的椎間盤，使用手術刀尖端輕輕嵌入上軟骨終板與椎體界限，并將上軟骨終板翹起，可見透明膠凍狀髓核組織，無菌小刮匙取出髓核組織，置于離心管中，液氮暫存，用于Western blot檢測。在C8-9離斷尾椎，將包含的C7-8椎間盤置于4%多聚甲醛中，隨后ETDA脫鈣處理，制作石蠟切片（4 μm），用于免疫組化染色。

2.4 指標檢測

2.4.1 ELISA檢測

取大鼠血清，按ELISA試劑盒說明書操作步驟檢測TNF-α、IL-1β、IL-18含量。

2.4.2 Western blot檢測

將C6-7髓核組織取出，加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑混合液50 μL，冰上裂解15 min，4 ℃、2 000×g離心5 min，收集上清液，進行BCA蛋白定量，加入蛋白上樣緩沖液，95 ℃使蛋白變性。每孔上樣20 μg蛋白，恒壓250 V電泳22 min，恒流300 mA轉(zhuǎn)膜45 min。加aggrecan、collagenⅡ一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，加二抗，室溫孵育1 h，ECL發(fā)光液顯影，以GAPDH為內(nèi)參，Image J 1.5.0軟件分析蛋白相對灰度值。

2.4.3 免疫組化染色

C7-8椎間盤石蠟切片脫蠟至水，進行熱抗原修復，自然冷卻，切片置于PBS（pH7.4）中脫色，3%過氧化氫室溫避光孵育25 min，PBS洗滌3次，每次5 min，滴加3%BSA，室溫封閉30 min。甩掉封閉液，滴加NLRP3、Caspase-1、NF-κB p65、IκB-α一抗（均為1∶1 000），濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜。PBS洗滌3次，每次5 min，滴加二抗（1∶200），室溫孵育50 min。DAB顯色，蘇木素復染，400倍視野下觀察結(jié)果。采用Image J 1.5.0軟件對切片進行分析，以平均光密度評價表達強度。

3 統(tǒng)計學方法

4 結(jié)果

4.1 各組大鼠椎間盤退變程度評估

正常組大鼠C6-7和C7-8椎間盤信號均一，未見退變征象；模型組、依那西普組和壯腰通絡方高、中、低劑量組與正常對照比較，C6-7和C7-8椎間盤信號明顯變黑，提示C6-7和C7-8發(fā)生IDD。見圖1。

圖1 各組大鼠椎間盤核磁共振T2加權像

4.2 壯腰通絡方對模型大鼠血清腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1β、白細胞介素-18含量的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-18含量均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，依那西普組和壯腰通絡方高、中劑量組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-18含量顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），壯腰通絡方低劑量組TNF-α含量顯著降低（P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-18含量比較（，pg/mL）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別正常組模型組依那西普組壯腰通絡方高劑量組壯腰通絡方中劑量組壯腰通絡方低劑量組IL-18 37.30±1.22 56.90±2.66**48.28±1.35##51.63±0.54#51.55±0.47#59.22±2.87只數(shù)8 8 8 8 8 8 TNF-α 3.00±0.78 37.85±8.26**0.82±0.64##10.75±0.62##12.20±1.53##24.40±3.35##IL-1β 37.50±0.08 102.50±2.69**50.80±7.63##71.80±7.02##73.20±7.98##100.59±5.15

4.3 壯腰通絡方對模型大鼠髓核組織聚集蛋白聚糖和Ⅱ型膠原表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠髓核組織aggrean、collagenⅡ蛋白表達顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，依那西普組和壯腰通絡方高、中劑量組aggrean、collagenⅡ蛋白表達顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。見圖2、表2。

表2 各組大鼠髓核組織aggrean、collagenⅡ蛋白表達比較（）

表2 各組大鼠髓核組織aggrean、collagenⅡ蛋白表達比較（）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

collagenⅡ1.000±0.000 0.197±0.004**1.154±0.007##0.780±0.179##0.600±0.090##0.290±0.107組別正常組模型組依那西普組壯腰通絡方高劑量組壯腰通絡方中劑量組壯腰通絡方低劑量組只數(shù)8 8 8 8 8 8 aggrean 1.000±0.000 0.584±0.014**0.991±0.012##0.697±0.033#0.725±0.003##0.544±0.064

圖2 各組大鼠髓核組織aggrean、collagenⅡ蛋白免疫印跡

4.4 壯腰通絡方對模型大鼠髓核組織NOD樣受體蛋白3、胱天蛋白酶-1、核因子-κB p65和核因子-κB抑制蛋白-α表達的影響

NLRP3和Caspase-1主要定位在NPCs細胞質(zhì)和細胞核，NF-κB p65、IκB-α主要在NPCs細胞質(zhì)表達。正常組有少量NLRP3、Caspase-1、NF-κB p65表達，IκB-α表達較高；模型組和壯腰通絡方低劑量組髓核組織結(jié)構紊亂，可見NPCs焦亡后殘留的空泡，壯腰通絡方高、中劑量組空泡顯著減少，髓核組織結(jié)構有所恢復。與正常組比較，模型組大鼠髓核組織NLRP3、Caspase-1、NF-κB p65蛋白表達顯著升高，IκB-α蛋白表達顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，依那西普組和壯腰通絡方高、中劑量組大鼠髓核組織NLRP3、Caspase-1、NF-κB p65蛋白表達顯著降低，IκB-α蛋白表達顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。見圖3～圖7。

圖4 各組大鼠髓核組織Caspase-1表達（免疫組化染色）

圖5 各組大鼠髓核組織NF-κB p65表達（免疫組化染色）

圖6 各組大鼠髓核組織IκB-α表達（免疫組化染色）

圖7 各組大鼠髓核組織NLRP3、Caspase-1、NF-κB p65、IκB-α蛋白表達比較（）

5 討論

IDD臨床表現(xiàn)以腰痛和腰椎功能障礙為主，可歸屬中醫(yī)學“腰痛”“腰腿痛”“痹證”范疇，屬慢性筋傷骨病。腰部主要有肝經(jīng)、腎經(jīng)和膀胱經(jīng)貫穿，肝主疏泄，腎主藏精納氣?！端貑枴ゐ粽撈费浴白诮钪魇嵌麢C關也”，肝腎虧虛導致腰部筋脈失去濡養(yǎng)，使腰部筋骨松弛難以御邪。風、寒、濕是常見侵襲腰部的外來邪氣。肝腎虧虛狀態(tài)下，風、寒、濕邪氣乘虛而入，最易傷及腰部筋脈，使本就缺乏濡養(yǎng)的筋脈更加瘀阻，最終導致腰痛。聚焦于臨床最為常見的肝腎虧虛、瘀血阻絡證型，壯腰通絡方以補益肝腎、活血通絡為綱，標本兼治。方中杜仲、熟地黃、當歸、牛膝滋補肝腎、補血養(yǎng)血，固護肝腎之本；延胡索、川芎、丹參重在行氣、活血、通絡；獨活、秦艽祛風除濕、和血舒筋，祛除筋脈中瘀阻的風、寒、濕邪。

NPCs焦亡是炎癥小體激活引發(fā)的細胞程序性死亡，與NF-κB信號通路密切相關，是IDD的主要表型改變[13-14]。當IDD發(fā)生時，髓核失去內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，TNF-α激活NPCs的NF-κB信號通路，NF-κB p65合成增加，同時IκB-α泛素化降解程序激活，促進NF-κB p65作為轉(zhuǎn)錄因子參與焦亡蛋白合成，最終增加NLRP3炎性小體合成及IL-1β和IL-18前體合成[15-18]。NLRP3炎性小體通過多種途徑誘導細胞焦亡，其中誘導Caspase-1前體的自剪切并成熟是最經(jīng)典的細胞焦亡途徑[15]。成熟的Caspase-1進一步剪切Gasdermin D、IL-1β和IL-18前體蛋白使其活化，活化的Gasdermin D釋放N端結(jié)構域，該結(jié)構域結(jié)合膜脂并打開細胞膜，導致細胞滲透壓變化，成熟的IL-1β和IL-18釋放到細胞外，引發(fā)炎癥瀑布，形成NPCs焦亡惡性循環(huán)[15，17]。因此，抑制NPCs焦亡可能是抑制髓核炎癥瀑布，阻斷NPCs焦亡惡性循環(huán)，進而延緩IDD的有效措施[19]。本研究從NPCs焦亡角度探索壯腰通絡方治療IDD的作用機制：首先，ELISA結(jié)果表明，壯腰通絡方能降低IDD大鼠血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-18含量，表明壯腰通絡方能夠顯著降低髓核炎癥水平，推測其參與了焦亡關鍵蛋白IL-1β和IL-18合成及分泌；其次，Western blot結(jié)果表明，壯腰通絡方能上調(diào)髓核組織aggrean、collagenⅡ蛋白表達，二者具有保持髓核水分、維持正常代謝、平衡椎間盤應力的作用，有助于維持髓核的基本生物學功能和抑制內(nèi)環(huán)境誘導的細胞焦亡；最后，免疫組化染色結(jié)果顯示，壯腰通絡方能抑制髓核組織NLRP3、Caspase-1、NF-κB p65蛋白表達，促進IκB-α蛋白表達，表明壯腰通絡方通過抑制NPCs的NF-κB信號通路激活抑制NLRP3炎性小體合成和Caspase-1成熟。

綜上所述，壯腰通絡方能夠顯著抑制NPCs焦亡，延緩IDD，其機制可能與抑制髓核組織NF-κB信號通路，限制NLRP3炎性小體和Caspase-1活化有關。本研究進一步明確了壯腰通絡方治療IDD的作用機制，但其具體機制仍有很大探索空間。前期研究發(fā)現(xiàn)，髓核是免疫豁免器官，誘導NPCs焦亡的TNF-α并非NPCs本身分泌，而是以M1型巨噬細胞為主導的免疫細胞合成并分泌[18]，M1型巨噬細胞既是退變髓核的主要炎性細胞類型，也是NPCs焦亡惡性循環(huán)的始動因素。因此，壯腰通絡方是否能對M1型巨噬細胞產(chǎn)生調(diào)控作用以限制NPCs焦亡惡性循環(huán)，是課題組今后研究的方向。