郭悅，萬雨欣，徐偉慧，于志丹，王志剛

3種類型秸稈降解對(duì)黑土微生物群落及功能的影響

郭悅1，2，萬雨欣1，2，徐偉慧1，2，于志丹1，王志剛1，2

（齊齊哈爾大學(xué) 1. 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，2. 黑龍江省農(nóng)業(yè)微生物制劑產(chǎn)業(yè)化技術(shù)創(chuàng)新中心，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

秸稈的降解主要依賴于微生物對(duì)木質(zhì)纖維素殘?bào)w的作用．黑土土質(zhì)肥沃，富含微生物，利用宏基因組測序了解秸稈降解過程中黑土微生物的變化具有重要意義．以3種東北黑土區(qū)典型農(nóng)作物秸稈即大豆、水稻、玉米秸稈為材料，加入到黑土中，在30℃條件下進(jìn)行微宇宙實(shí)驗(yàn)，分析在秸稈降解過程中土壤微生物群落和功能的變化．結(jié)果表明，大豆、水稻和玉米秸稈在黑土環(huán)境中富集了不同的微生物．大豆秸稈主要富集放線菌（Actinobacteria）、綠彎菌（Chloroflexi）、COG1858，水稻秸稈主要富集擬桿菌（Bacteroidetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、COG1472、COG3250，玉米秸稈主要富集變形菌（Proteobacteria）、酸桿菌（Acidobacteria）、ENOG410XNTA．不同類型的秸稈降解過程中會(huì)富集不同的木質(zhì)纖維素降解菌，木質(zhì)纖維素降解相關(guān)的功能途徑和酶的豐度也有所增加．

黑土微生物；秸稈降解；宏基因組測序；微生物群落和功能

黑土具有良好的土壤性狀，富含有機(jī)質(zhì)，土壤肥沃，肥力可達(dá)普通土壤的10倍[1]，適合農(nóng)作物生長[2]．黑土地區(qū)是中國主要的糧食產(chǎn)區(qū)，非常適合大豆、玉米和水稻的種植．此外，黑土中有豐富的微生物種類，是秸稈降解的主要驅(qū)動(dòng)因素[3-4]．存在大量降解秸稈纖維素的微生物，在農(nóng)業(yè)發(fā)展和土壤生態(tài)學(xué)中發(fā)揮著重要作用[5]．木質(zhì)纖維素是植物殘?bào)w的重要組成部分，是秸稈的主要成分，其豐富的碳源對(duì)土壤碳循環(huán)至關(guān)重要[6-7]．秸稈中的碳可以為作物生長提供有利的土壤條件，也可以提高土壤肥力和作物產(chǎn)量[8-9]，對(duì)秸稈進(jìn)行生物降解可以提高秸稈的利用率．秸稈的降解過程需要許多酶的參與，具有產(chǎn)酶能力的菌富集在秸稈表面和內(nèi)部并在作物秸稈中起到了分解者的作用[10]．大量研究報(bào)道了木質(zhì)纖維素降解菌，它們產(chǎn)生纖維素降解酶，能夠?qū)⒋蟮睦w維素聚合物降解為小分子化合物或單體化合物，最終轉(zhuǎn)化為CO2和H2O[11]．細(xì)菌具有抗逆性強(qiáng)、繁殖快等特點(diǎn)[12]，因此在木質(zhì)纖維素降解中備受青睞．芽孢桿菌屬（）作為研究中最常見的菌屬在木質(zhì)纖維素降解中發(fā)揮了重要作用[13]，其他一些菌屬同樣具有產(chǎn)木質(zhì)纖維素降解相關(guān)酶的能力，如普氏菌屬（）、棲瘤胃解纖維素菌屬（）和梭狀菌屬（）[14-15]、節(jié)桿菌屬（）[16]等．秸稈較高的碳氮比環(huán)境會(huì)限制微生物的繁殖[17]，但放線菌的固氮能力可能在微生物驅(qū)動(dòng)的植物殘?bào)w分解過程中提高氮的有效性[18]．放線菌作為重要的細(xì)菌門是土壤細(xì)菌中分布最廣的門之一，對(duì)植物殘?bào)w的降解能力也是眾所周知的[19-21]，放線菌具有更好的適應(yīng)能力，在秸稈木質(zhì)纖維素降解研究中具有更重要的生理生態(tài)作用[22]．

大豆、水稻和玉米是東北黑土區(qū)的主要糧食作物．在一年一度的農(nóng)作物收獲之后，剩余的農(nóng)作物秸稈造成了一些環(huán)境問題，如秸稈燃燒會(huì)釋放有害氣體．因此，如何通過無污染的方式處理秸稈資源是一個(gè)亟待解決的問題．木質(zhì)纖維素降解是非常復(fù)雜的過程，需要微生物產(chǎn)生的各種酶共同發(fā)揮作用[23]．本文結(jié)合東北黑土區(qū)的實(shí)際情況，將大豆、水稻和玉米秸稈添加到黑土中進(jìn)行微宇宙實(shí)驗(yàn)．在微環(huán)境馴化120 d的條件下，分析了大豆、水稻和玉米秸稈降解對(duì)黑土微生物多樣性、群落結(jié)構(gòu)和功能的影響，旨在為秸稈的無害化處理提供理論依據(jù)．

1　材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)材料

黑土采集于黑龍江省齊齊哈爾市克山縣（48°21′43″N，126°03′05″E）．從地面（0～20 cm表土）取樣并充分混合以形成復(fù)合樣品．隨后，將樣品在室溫下風(fēng)干，并通過3 mm篩，在處理之前除去植物碎片和大石頭．土壤理化性質(zhì)見表1．

表1　黑土的理化性質(zhì)

注：數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差．下同．

大豆、水稻、玉米秸稈采集于黑龍江省齊齊哈爾市建華區(qū)曙光村（47°35′99″N，123°92′46″E）．將大豆、水稻、玉米秸稈切成3～4 cm的小段，并在80℃的烘箱中烘干至恒質(zhì)量．秸稈理化性質(zhì)見表2．

表2　秸稈的理化性質(zhì) （%）

注：不同小寫字母表示處理之間有顯著差異<0.05．下同．

1.2　樣品采集及處理

將大豆、水稻、玉米秸稈分別與黑土以10∶1的比例在盆中均勻混合，分別設(shè)為DH（大豆秸稈與黑土混合）、SH（水稻秸稈與黑土混合）、YH（玉米秸稈與黑土混合）組，并置于30℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行微宇宙實(shí)驗(yàn)．整個(gè)過程持續(xù)120 d，水分保持在60%左右．分別在第0天和第120天收集秸稈樣品表面的土壤，用于宏基因組測序，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)置不加秸稈的黑土作為對(duì)照組（CK）．

1.3　宏基因組學(xué)測序與統(tǒng)計(jì)分析

使用E.Z.N.A.?Soil DNA Kit試劑盒提取土壤微生物總DNA．宏基因組測序工作由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司使用Illumina NovaSeq測序平臺(tái)完成[24]．具體流程為：（1）文庫分子一端與引物堿基互補(bǔ)，經(jīng)過一輪擴(kuò)增，將模板信息固定在芯片上；（2）固定在芯片上的分子另一端隨機(jī)與附近的另外一個(gè)引物互補(bǔ)，也被固定住，形成“橋”；（3）PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生DNA簇；（4）DNA擴(kuò)增子線性化成為單鏈；（5）加入改造過的DNA聚合酶和帶有4種熒光標(biāo)記的dNTP，每次循環(huán)只合成1個(gè)堿基；（6）用激光掃描反應(yīng)板表面，讀取每條模板序列第1輪反應(yīng)所聚合上去的核苷酸種類；（7）將“熒光基團(tuán)”和“終止基團(tuán)”化學(xué)切割，恢復(fù)3′端粘性，繼續(xù)聚合第2個(gè)核苷酸；（8）統(tǒng)計(jì)每輪收集到的熒光信號(hào)結(jié)果，獲知模板DNA片段的序列．

來自土壤的DNA樣品在Illumina NovaSeq 6000平臺(tái)上進(jìn)行測序，每個(gè)樣品平均6 Gb．（1）所有的原始數(shù)據(jù)都通過Fastp（https://github.com/OpenGene/fastp，version 0.20.0）對(duì)reads 3′端和5′端的adapter序列進(jìn)行質(zhì)量剪切，去除剪切后長度小于50 bp、平均堿基質(zhì)量值低于20以及含N堿基的reads，保留高質(zhì)量的pair-end reads和single-end reads；（2）過濾后的讀數(shù)用MEGAHIT（https://github.com/voutcn/megahit，version 1.1.2）對(duì)優(yōu)化序列進(jìn)行拼接組裝，在拼接結(jié)果中篩選≥300 bp的contigs作為最終的組裝結(jié)果；（3）用Prodigal（https://github.com/hyattpd/Prodigal）來預(yù)測開放閱讀框架（ORF），選擇核酸長度≥100 bp的基因，并將其翻譯為氨基酸序列；（4）使用CD-HIT（http://weizhongli-lab.org/cd-hit/，version 4.6.1）對(duì)所有樣品預(yù)測出來的基因序列進(jìn)行聚類，去除冗余，并獲得唯一的基因目錄；（5）使用SOAPaligner（https://github.com/ShujiaHuang/SOAPaligner）通過比較干凈的讀數(shù)和基因目錄來計(jì)算基因深度和相對(duì)豐度．分別將每個(gè)樣品的高質(zhì)量reads與非冗余基因集進(jìn)行比對(duì)（95% identity），統(tǒng)計(jì)基因在對(duì)應(yīng)樣品中的豐度信息；（6）使用Diamond（http://www.diamondsearch.org/index.php，version 0.8.35）將非冗余基因集的氨基酸序列與NR數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)（BLASTP比對(duì)參數(shù)設(shè)置期望值e-value為1e-5），并通過NR庫對(duì)應(yīng)的分類學(xué)信息數(shù)據(jù)庫獲得物種注釋，然后使用物種對(duì)應(yīng)的基因豐度總和計(jì)算該物種的豐度；（7）使用Diamond（http://www.diamondsearch.org/index.php，version 0.8.35）將非冗余基因集的氨基酸序列與EggNOG（evolutionary genealogy of genes：Non-supervised Orthologous Groups）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)（BLASTP比對(duì)參數(shù)設(shè)置期望值e-value為1e-5），獲得基因?qū)?yīng)的COG（Clusters of orthologous groups of proteins，直系同源蛋白簇）功能，然后使用COG對(duì)應(yīng)的基因豐度總和計(jì)算該COG的豐度．原始數(shù)據(jù)上傳至NCBI網(wǎng)站SRA數(shù)據(jù)庫（Accession Number：PRJNA918990）．

所有數(shù)據(jù)均在Excel 2019整理，通過SPSS 22.0（IBM，Armonk，New York，USA）進(jìn)行所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析．?dāng)?shù)據(jù)分析采用單因素方差分析（ANOVA），<0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．在屬水平上計(jì)算微生物的多樣性Chao、Shannon指數(shù)；使用基于bray-curtis距離算法的PCoA分析（主坐標(biāo)分析）檢驗(yàn)樣本間微生物群落結(jié)構(gòu)的相似性．基于基因的物種分類學(xué)注釋，比對(duì)NR數(shù)據(jù)庫獲得樣本物種的分類學(xué)注釋信息，使用Reads Number計(jì)算豐度．在EggNOG數(shù)據(jù)庫中獲得基因?qū)?yīng)的COG，然后使用COG對(duì)應(yīng)的基因豐度總和計(jì)算該COG的豐度．使用GraphPad Prism8.0.2軟件繪制柱形圖，使用Origin 2021軟件繪制柱狀堆疊圖，使用TBtools軟件（Toolbox for Biologists v1.09876）繪制豐度熱圖．

2　結(jié)果與分析

2.1　3種類型秸稈降解對(duì)黑土微生物群落多樣性的影響

第0天和第120天土壤微生物的多樣性指數(shù)見圖1．由圖1可見，隨著時(shí)間的推移，土壤微生物的多樣性發(fā)生了顯著變化．在秸稈降解第0天取樣的3個(gè)處理組（DH，SH，YH）和CK組的多樣性在整個(gè)過程中是最低的．秸稈降解后，黑土中微生物群落的多樣性顯著增加，沒有添加秸稈的CK組變化較?。瓺H，SH，YH組的Chao指數(shù)在第120天分別比第0天升高了371.33，365.00，333.67（見圖1a），Shannon指數(shù)分別升高了0.50，0.38，0.52（見圖1b）．這些結(jié)果表明，秸稈降解會(huì)增加黑土微生物的多樣性．

圖1　3種類型秸稈降解過程中黑土微生物群落α多樣性的變化

基于bray-curtis距離算法的PCoA分析不同處理間微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性結(jié)果見圖2．由圖2a可見，第0天的DH，SH，YH組與CK組并未完全分離開，表示在該階段各個(gè)處理組之間差異較小，并不顯著．由圖2b可見，第120天的DH，SH，YH組與CK組明顯分離，說明在第120天DH，SH，YH組與CK組彼此之間均存在顯著差異．

圖2　3種類型秸稈降解過程中黑土微生物群落β多樣性的變化

注：圖中橢圓為置信橢圓．

2.2　3種類型秸稈降解對(duì)黑土微生物群落組成的影響

通過NR物種注釋在門水平上對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析（見圖3），將相對(duì)豐度小于0.01的菌門合并為others后，除未分類的細(xì)菌，共發(fā)現(xiàn)了11個(gè)相對(duì)豐度較高的菌門．其中放線菌門（Actinobacteriota）、變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）為優(yōu)勢菌門．在120 d的實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，CK組的各個(gè)菌門的豐度變化較小．放線菌門作為主要菌門之一，在DH，SH，YH組都顯著減少，分別減少了35.07%，44.12%，44.68%．同為優(yōu)勢菌的變形菌門，在第120天時(shí)，DH，SH，YH組分別比CK高出15.62%，16.60%，21.92%．由此可見，碳氮比最高的玉米秸稈富集了更多的變形菌．3種秸稈中碳氮比最小的大豆秸稈與另外2組相比可以富集更多的綠彎菌門，在第120天的相對(duì)豐度為21.65%．

對(duì)屬水平上前30名的菌屬變化進(jìn)行分析（見圖4）．由圖4可見，DH，SH，YH組均顯著富集了固氮菌屬（）、厭氧菌屬（）以及一些屬水平未分類的變形菌（Proteobacteria）、綠彎菌（Chloroflexi）和酸桿菌（Acidobacteria）等，這些菌的豐度在第120天與第0天相比均有顯著增加．而芽孢桿菌屬（）、泛菌屬（）、假諾卡氏菌（）等菌株的豐度顯著減少．從不同秸稈處理組的差異來看，鞘氨醇單胞菌屬（）在DH和YH組中顯著富集，尤其是在YH組，而在SH組的豐度顯著減少；假單胞菌（）在DH和SH組顯著減少，而在YH組則差異較小．

圖3　3種秸稈降解過程中黑土微生物門水平群落結(jié)構(gòu)的變化

圖4　3種秸稈降解過程中黑土微生物屬水平群落豐度熱圖

2.3　3種類型秸稈降解對(duì)黑土微生物群落功能的影響

比對(duì)Egg NOG數(shù)據(jù)庫后，對(duì)DH，SH，YH處理組以及CK組的細(xì)菌功能進(jìn)行了COG功能注釋，其中19個(gè)COG功能屬于新陳代謝，分別包括碳水化合物的運(yùn)輸和代謝、能源生產(chǎn)和轉(zhuǎn)化以及無機(jī)離子運(yùn)輸和代謝．繪制豐度前20功能的熱圖（見圖5），與水解酶家族相關(guān)的COG1472，COG3250，COG3693在DH，SH，YH組均有所增加，其中在SH組中增加最多，分別是第0天的2.12，3.92，12.77倍．與糖苷水解酶家族相關(guān)的ENOG410XNTA和COG2730在3組中也顯著增加，其中SH和YH富集到更多，達(dá)到了第0天的8倍以上，但同樣屬于糖苷水解酶家族的COG1486在DH，SH，YH組中均有所減小，其中YH最少，僅為第0天的0.61倍．與-半乳糖苷酶（-galactosidase）相關(guān)的COG1874在SH組中顯著富集，是第0天的2.72倍．與其他處理組相比，DH顯著富集了與細(xì)胞色素C過氧化物酶相關(guān)的COG1858；YH顯著富集了與具有過氧化氫酶和廣譜過氧化物酶活性的雙功能酶相關(guān)的COG0376．

圖5　3種秸稈降解過程中COG功能注釋豐度熱圖

3　討論與結(jié)論

土壤微生物在有機(jī)物分解中起到重要作用[25]．農(nóng)作物秸稈作為一種優(yōu)質(zhì)的纖維素結(jié)構(gòu)體，可以為土壤碳循環(huán)提供優(yōu)質(zhì)碳源．同時(shí)，土壤中豐富的微生物群落共同利用秸稈中的木質(zhì)纖維素進(jìn)行生命活動(dòng)．3種類型秸稈降解會(huì)增加土壤細(xì)菌的多樣性，顯著改變黑土中微生物的群落結(jié)構(gòu)[26-27]．在秸稈降解過程中，變形菌門長期作為土壤中優(yōu)勢菌門[26，28-30]．同時(shí)，秸稈降解會(huì)降低土壤中放線菌門的相對(duì)豐度[30-31]．?dāng)M桿菌門作為另一個(gè)優(yōu)勢菌門，是分解半纖維素和木聚糖的重要菌門[32]．因此，DH，SH，YH組中，擬桿菌門的豐度都顯著大于CK，其中以水稻秸稈降解過程中DH組豐度最高．在屬水平上，固氮菌屬（）顯著增加，可以將空氣中植物無法吸收的氮?dú)廪D(zhuǎn)化成可以吸收利用的氨或者其他含氮有機(jī)物[33]，與第0天比較，第120天固氮菌顯著增加，固氮微生物可以提供氮素，緩解因秸稈過高的碳氮比而不利于降解的問題[4，34]．同時(shí)，固氮菌屬在YH中更加顯著富集，這是玉米秸稈含有更高的碳氮比導(dǎo)致的．鏈霉菌屬（）作為放線菌門的重要菌屬，在秸稈降解過程中具有重要的生態(tài)作用[35]，并且在植物殘?bào)w降解過程中保持穩(wěn)定存在．克雷伯氏菌（）是腸桿菌科常見的菌屬，在木質(zhì)纖維素降解過程中同樣發(fā)揮了重要作用[36]．秸稈的加入引起了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的變化，這些變化是由于秸稈的加入增加了土壤的碳含量，改變了土壤的理化性質(zhì)，導(dǎo)致了土壤環(huán)境的巨大變化．不同類型的秸稈含有不同的碳含量，因此微生物的富集及其對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響存在差異[37]．通過COG注釋對(duì)功能進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，注釋到的前20個(gè)COG中有19個(gè)屬于新陳代謝，其中15個(gè)屬于碳水化合物的運(yùn)輸和代謝，說明秸稈降解過程中需要大量的碳水化合物的相關(guān)酶，如-淀粉酶、-半乳糖苷酶、-葡萄糖苷酶、過氧化氫酶和糖苷水解酶等[38]，該過程需要多種酶進(jìn)行協(xié)同作用達(dá)到將其資源化利用的效果．

綜上所述，通過宏基因組學(xué)測序結(jié)果表明，不同類型的秸稈降解過程中會(huì)富集不同的木質(zhì)纖維素降解菌，木質(zhì)纖維素降解相關(guān)的功能途徑和酶的豐度也有所增加．本文為今后黑土地區(qū)的秸稈降解研究提供了理論依據(jù)，對(duì)減少環(huán)境污染具有重要意義．

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Effects of degradation of three types of straw on microbial communities and functions in black soil

GUO Yue1，2，WAN Yuxin1，2，XU Weihui1，2，YU Zhidan1，WANG Zhigang1，2

（1. School of Life Sciences，Agriculture and Forestry，2. Heilongjiang Provincial Technology Innovation Center of Agromicrobial Preparation Industrialization，Qiqihar University，Qiqihar 161006，China）

Straw degradation depends mainly on bacterial and fungal actions on lignocellulosic residues．Black soil is fertile and rich in microorganisms．Therefore，it is of great significance to understand the changes in soil microorganisms during straw degradation by metagenomic sequencing．Three typical crop straw，namely soybean，rice and corn straws，from the black soil region of northeast China were added to black soil at 30℃ for microcosm experiments to analyze the changes in soil microbial communities and functions during the straw degradation process．The results showed that soybean，rice and corn straw were enriched with different microorganisms in black soil．Soybean straw was mainly enriched with Actinobacteria，Chloroflexi and COG1858．Rice straw was mainly enriched with Bacteroidetes，Verrucomicrobia，COG1472 and COG3250．Corn straw was mainly enriched with Proteobacteria，Acidobacteria，ENOG410XNTA．The processes of different straw degradation were enriched with different lignocellulose-degrading bacteria，and the abundance of functional pathways and enzymes related to lignocellulose degradation increased．

black soil microorganisms；straw degradation；metagenomic sequencing；microbial communities and functions

1007-9831（2023）09-0051-08

Q93

A

10.3969/j.issn.1007-9831.2023.09.012

2023-06-29

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31870493）；黑龍江省重點(diǎn)研究開發(fā)項(xiàng)目（GA21B007）；齊齊哈爾大學(xué)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201810232167）

郭悅（1997-），女，黑龍江齊齊哈爾人，在讀碩士研究生，從事環(huán)境微生物學(xué)研究．E-mail：1275598797@qq.com

王志剛（1980-），男，內(nèi)蒙古赤峰人，教授，博士，從事微生物資源與開發(fā)研究．E-mail：wangzhigang@qqhru.edu.cn