盧登洋， 王鑫， 唐章虎， 吳翠云*， 蒲云峰，閆敏， 鮑荊凱， 姜喜*

（1.塔里木大學(xué)園藝與林學(xué)學(xué)院，南疆特色果樹高效優(yōu)質(zhì)栽培與深加工技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300； 2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院輪臺果樹資源圃，新疆 巴音郭楞 841600； 3.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300）

梨是薔薇科（Rosaceae）梨亞科（Pomaceae）梨屬（PyrusL.）落葉果樹[1-2]，中國是梨的起源中心和主要的多樣性中心之一，梨樹在中國已有3 000多年的栽培歷史[3-5]。梨味甜、汁液多、肉質(zhì)脆，具有較多的營養(yǎng)物質(zhì)和一定的保健功能[6-7]。近年來，隨著人們對高品質(zhì)生活的追求，越來越多的消費(fèi)者喜歡具有一定營養(yǎng)保健功能的優(yōu)良梨品種。大量研究表明，梨果實(shí)中的酚類物質(zhì)是重要的抗氧化成分[8-10]，抗氧化活性是近年來研究的熱點(diǎn)，也是反映水果品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。

在梨果實(shí)發(fā)育過程中，果實(shí)中的總黃酮和總酚含量大部分都呈現(xiàn)下降趨勢。研究發(fā)現(xiàn)，梨果實(shí)中的總酚含量、總黃酮含量和1,1-二苯基-2-苦肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazylradical，DPPH）自由基清除能力隨著果實(shí)發(fā)育呈逐漸降低的趨勢[11-13]，且晚熟梨的總酚含量比早熟梨高30%～40%[14]。目前關(guān)于梨果實(shí)的多酚類物質(zhì)的研究多以采后梨果實(shí)為試驗(yàn)材料，關(guān)于不同品種梨果實(shí)田間栽培過程中多酚類物質(zhì)組成、含量和抗氧化活性變化規(guī)律的研究報(bào)道較少。本試驗(yàn)對白梨系統(tǒng)的碭山酥梨、西洋梨系統(tǒng)的庫車阿木特、麻梨果實(shí)發(fā)育過程中多酚類物質(zhì)組成、含量及抗氧化活性進(jìn)行研究，調(diào)查不同梨品種多酚等功能性成分的動(dòng)態(tài)變化，為3 種梨果實(shí)品質(zhì)的形成規(guī)律和功能性新品種選育提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為碭山酥梨、庫車阿木特和麻梨，均采自新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院輪臺果樹資源圃。隨機(jī)抽取常規(guī)管理、樹勢健壯、樹冠大小基本一致且無病害的3株樹，分別于盛花期后50 d（5月25日）開始，每隔15 d隨機(jī)采集樹冠外圍中部、東、南、西、北5個(gè)方向、大小均勻一致且無病蟲害的果實(shí)共30個(gè)，直至果實(shí)完全成熟（9月20日）。每次采集樣品后置于冰盒中保存并迅速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室備用。試驗(yàn)用蘆丁和沒食子酸購自阿拉丁試劑（上海）有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備 將果實(shí)清洗干凈、控干水分后，在每個(gè)果實(shí)中部位置橫切約3 mm帶皮果實(shí)切片，放到-20 ℃冰箱預(yù)凍后用真空凍干機(jī)凍干，然后用研磨儀打成粉末，放到-80 ℃超低溫冰箱備用。精確稱取1.000 g 凍干果肉，加入25 mL 乙醇超聲30 min，并于5 000 r·min-1離心20 min，取上清液，重復(fù)3次。樣液用于總黃酮、總酚、DPPH、2,2’-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2, 2’-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS+）含量測定和高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析。

1.2.2 總黃酮、總酚含量測定 總黃酮含量的測定采用硝酸鋁比色法[15]，用蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=0.225 7x+0.024 1（R2=0.991 8），將標(biāo)準(zhǔn)曲線中算出的結(jié)果換算為以每克梨果干重（dry weight, DW)中含蘆丁當(dāng)量（rutin equivalent,RE）毫克數(shù)表示（mg RE·g-1DW）?？偡雍康臏y定采用Folin-酚法[15]，用沒食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=1.866 7x+0.031 2（R2=0.998 5），將標(biāo)準(zhǔn)曲線中算出的結(jié)果換算為以每克梨果干重中所含沒食子酸當(dāng)量（gallic acid equivalent, CAE）毫克數(shù)表示（mg GAE·g-1DW）。

1.2.3 高效液相色譜分析 用外標(biāo)法測定梨果實(shí)中的酚類物質(zhì)組成與含量，具體色譜條件參照Pu等[16]的方法。

1.2.4 抗氧化活性測定 用DPPH、ABTS+自由基清除法[15]測定，以Trolox 作對照，DPPH、ABTS+自由基清除能力的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程分別為y=4.940 1x-0.039 9（R2=0.996 0）、y=6.272 0x-0.028 4（R2=0.996 9），測定結(jié)果以每克梨果干重中所含維生素E 當(dāng)量（vitamin E equivalent, TE）毫克數(shù)計(jì)（μmol TE·g-1DW）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2019 分析測量數(shù)據(jù)，結(jié)合SPSS 17.0進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 梨果實(shí)發(fā)育過程中總黃酮、總酚含量的動(dòng)態(tài)變化分析

2.1.1 梨果實(shí)發(fā)育過程中總黃酮含量的動(dòng)態(tài)變化 由圖1可以看出，3種梨果實(shí)在發(fā)育過程中總黃酮含量變化趨勢基本一致，在盛花后50 d 時(shí)含量較高，隨著果實(shí)的發(fā)育逐漸降低。果實(shí)發(fā)育前期，庫車阿木特、碭山酥梨和麻梨的總黃酮含量降低迅速，由盛花后50 d 時(shí)的19.94、28.91 和23.41 mg RE·g-1DW 分別下降至80 d 時(shí)的10.20、10.12和9.82 mg RE·g-1DW，3個(gè)梨品種的降幅分別為48.83%、64.99%和58.04%；至果實(shí)成熟時(shí)，總黃酮含量分別降至4.35、0.60 和0.62 mg RE·g-1DW。3個(gè)梨品種果實(shí)中，幼果期總黃酮含量以碭山酥梨較高，庫車阿木特果實(shí)中含量較低；而果實(shí)成熟時(shí)，庫車阿木特果實(shí)中總黃酮含量明顯高于麻梨和碭山酥梨，說明在果實(shí)發(fā)育過程中庫車阿木特的總黃酮含量變幅較小，碭山酥梨的總黃酮含量變幅較大。

圖1 梨果實(shí)發(fā)育過程中總黃酮含量的動(dòng)態(tài)變化Fig. 1 Dynamic changes of total flavonoids content during pear fruit development

2.1.2 梨果實(shí)發(fā)育過程中總酚含量的動(dòng)態(tài)變化由圖2 可知，3 種梨果實(shí)的總酚含量在發(fā)育過程中變化基本一致。盛花后50 d時(shí)碭山酥梨和麻梨果實(shí)中總酚含量明顯高于庫車阿木特，分別達(dá)16.28和16.45 mg GAE·g-1DW，而庫車阿木特果實(shí)中總酚含量為10.51 mg GAE·g-1DW；隨著果實(shí)的生長，碭山酥梨、麻梨和庫車阿木特果實(shí)中總酚含量80 d時(shí)分別下降至6.89、5.78 和6.44 mg GAE·g-1DW，3 個(gè)梨品種的降幅分別為57.65%、64.86% 和38.71%。在盛花后125 d 時(shí)庫車阿木特果實(shí)中總酚含量降至最低，為2.95 mg GAE·g-1DW，此后維持在3.5 mg GAE·g-1DW 左右；碭山酥梨和麻梨中總酚含量在成熟時(shí)降至最低，分別為2.21 和1.51 mg GAE·g-1DW。在果實(shí)發(fā)育過程中，3 種梨果實(shí)的總酚含量均出現(xiàn)不同程度的波動(dòng)，其中麻梨的總酚含量變動(dòng)幅度較大，庫車阿木特變幅較小。

圖2 梨果實(shí)發(fā)育過程中總酚含量的動(dòng)態(tài)變化Fig. 2 Dynamic changes of total phenol content during pear fruit development

2.2 梨果實(shí)發(fā)育過程中酚類物質(zhì)組分含量的變化分析

HPLC 結(jié)果（圖3）表明，3 種梨果實(shí)發(fā)育過程中共檢測到13 種酚類物質(zhì)。梨果實(shí)中的酚類物質(zhì)含量均在幼果期較高，在成熟期含量較低；其中，熊果苷、槲皮葡萄糖苷、異鼠李素3-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、異鼠李素?；禾擒盏确宇愇镔|(zhì)含量隨著果實(shí)的發(fā)育逐漸降低；兒茶素、山奈酚-雙脫氧己糖苷、表兒茶素、槲皮素鼠李糖苷、蘆丁、異鼠李素3-O-蕓香苷、山奈酚3-O-蕓香苷等酚類物質(zhì)含量隨著果實(shí)發(fā)育呈現(xiàn)出不斷上下起伏的變化趨勢，但其含量仍在幼果期較高。

圖3 梨果實(shí)在發(fā)育過程中酚類物質(zhì)組分含量變化Fig. 3 Changes of phenolic components during pear fruit development

在13 種酚類物質(zhì)中，以熊果苷含量最高，平均達(dá)到3 353.43 μg·g-1DW，占總組分的51.88%；其次是綠原酸，平均含量為2 350.29 μg·g-1DW，占總組分的36.34%；其他酚類組分含量較低，在8.09～150.65 μg·g-1DW 之間，僅占總酚含量的0.13%～2.33%，其中含量最少的是異鼠李素?；禾擒?。在幼果期，庫車阿木特、碭山酥梨、麻梨的熊果苷和綠原酸含量分別是成熟期的5.36 和1.73倍、30.97和6.00倍、26.20和28.32倍。碭山酥梨果實(shí)中熊果苷、山奈酚-雙脫氧己糖苷、綠原酸、山奈-3-氧-蕓香苷、兒茶素、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷和異鼠李素?；禾擒蘸烤葞燔嚢⒛咎睾吐槔娓摺?種梨果實(shí)兒茶素、山奈酚-3-氧-蕓香苷、表兒茶素、異鼠李素3-O-蕓香苷和蘆丁在果實(shí)發(fā)育期波動(dòng)較大，不同品種之間存在差異。從HPLC結(jié)果可以看出，在梨果實(shí)發(fā)育過程中，碭山酥梨的熊果苷和綠原酸含量較庫車阿木特和麻梨分別高49.40%和30.61%、57.34%和19.35%。

2.3 梨果實(shí)發(fā)育過程中抗氧化活性的動(dòng)態(tài)變化分析

2.3.1 梨果實(shí)DPPH 自由基清除能力 從圖4 可以看出，3種梨果實(shí)發(fā)育過程中的DPPH 自由基清除能力大致呈現(xiàn)出由高到低的變化趨勢。在果實(shí)發(fā)育前期，庫車阿木特、碭山酥梨和麻梨的DPPH自由基清除能力降低迅速，由盛花后50 d 時(shí)的63.89、68.06 和61.11 μmol TE·g-1DW 分別下降至80 d 時(shí)的28.18、25.93 和31.37 μmol TE·g-1DW，3 種梨的降幅分別為55.90%、61.90%和48.68%；庫車阿木特和碭山酥梨的DPPH 自由基清除能力均在盛花后140 d 時(shí)達(dá)到最低，分別為17.00 和14.39 μmol TE·g-1DW，而麻梨在果實(shí)成熟期最低，為12.18 μmol TE·g-1DW。

圖4 梨果實(shí)DPPH自由基清除能力變化Fig. 4 Changes in DPPH free radical scavenging capacity in pear fruit

2.3.2 梨果實(shí)ABTS+自由基清除能力 從圖5 可知，3 種梨的ABTS+自由基清除能力在果實(shí)發(fā)育過程中呈現(xiàn)不斷變化的趨勢。在盛花后50 d時(shí)，碭山酥梨和麻梨果實(shí)中ABTS+自由基清除能力明顯高于庫車阿木特，分別達(dá)到164.60 和167.76 μmol TE·g-1DW，而庫車阿木特果實(shí)中ABTS+自由基清除能力為102.64 μmol TE·g-1DW；隨著果實(shí)的生長，盛花后65 d 時(shí)，麻梨、碭山酥梨和庫車阿木特ABTS+自由基清除能力分別下降至88.88、62.21 和38.91 μmol TE·g-1DW，3 種梨的降幅分別為46.00%、60.53%和62.09%。在幼果期時(shí)，碭山酥梨和麻梨果實(shí)中ABTS+自由基清除能力較高，庫車阿木特較低；而在果實(shí)成熟時(shí)，以碭山酥梨的ABTS+自由基清除能力最高，明顯高于庫車阿木特和麻梨。

2.4 梨果實(shí)發(fā)育過程中酚類物質(zhì)與抗氧化活性的相關(guān)性分析

由表1可知，梨果實(shí)的抗氧化活性（即DPPH、ABTS+自由基清除能力）與總黃酮、總酚以及13種酚類物質(zhì)的含量均存在正相關(guān)關(guān)系，3 種梨果實(shí)中總黃酮、總酚、熊果苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、綠原酸、兒茶素、異鼠李素酰化己糖苷和表兒茶素等物質(zhì)與DPPH 自由基清除能力均存在極顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），且相關(guān)系數(shù)達(dá)0.95 及以上。梨果實(shí)中總酚、熊果苷、綠原酸、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷、山奈酚-雙脫氧己糖苷、槲皮素鼠李糖苷和山奈酚-3-O-葡萄糖苷等酚類物質(zhì)與ABTS+自由基清除能力均存在極顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），且相關(guān)系數(shù)達(dá)0.90 及以上。蘆丁、山奈酚-3-O-蕓香苷與DPPH 自由基清除能力呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），相比之下相關(guān)性稍弱些，但對梨果實(shí)的抗氧化活性也可產(chǎn)生重要影響。

表1 不同品種梨果實(shí)發(fā)育過程中酚類物質(zhì)與抗氧化活性的相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis between phenolic substances and antioxidant activity during fruit development of different pear varieties

3 討論

多酚是梨果實(shí)中重要的功能成分，富含多酚的梨果實(shí)具有保健功能和較高的營養(yǎng)價(jià)值[12]。本研究所測試的庫車阿木特、碭山酥梨、麻梨果實(shí)中總酚、總黃酮、酚類物質(zhì)和抗氧化活性均存在差別。3 種梨果實(shí)的總黃酮和總酚含量在發(fā)育過程中變化基本一致，呈現(xiàn)出前期高、后期低的變化趨勢，庫車阿木特、碭山酥梨和麻梨在果實(shí)成熟期與幼果期相比，其總黃酮和總酚含量分別下降了87.20%、63.84%、97.93% 和 86.44%、97.33%、90.82%，與劉杰超等[17]發(fā)現(xiàn)棗果實(shí)在成熟期時(shí)總酚含量比幼果期低60%的研究結(jié)果相似。不同梨品種在不同發(fā)育期多酚物質(zhì)含量變化趨勢基本一致，但變化幅度差別較大[18]。因此，可以進(jìn)一步研究品種間多酚積累規(guī)律，為培育具有特殊營養(yǎng)功能的優(yōu)良梨品種奠定基礎(chǔ)。

本研究顯示，熊果苷、綠原酸是梨果實(shí)中最主要的酚類物質(zhì)，而蘋果中主要的多酚物質(zhì)為綠原酸、表兒茶素、兒茶素和蘆丁等[19]。在幼果期，庫車阿木特、碭山梨和麻梨的熊果苷和綠原酸含量分別是成熟期的5.36 和1.73 倍、30.97 和6.00 倍、26.20和28.32倍，表明果實(shí)發(fā)育階段越早，酚類物質(zhì)越豐富，因此在梨樹栽培管理中的疏果階段，可以利用疏除的幼果提取其功能性成分，比如熊果苷的提取物可應(yīng)用于美白化妝品，綠原酸的提取物可用于抗菌、抗病毒的保健品和藥物，從而提高梨果的應(yīng)用價(jià)值[20]。在3種梨果實(shí)發(fā)育過程中，熊果苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、綠原酸、異鼠李素3-O-葡萄糖苷、槲皮葡萄糖苷、異鼠李素?；禾擒盏确宇愇镔|(zhì)含量呈下降趨勢；麻梨的異鼠李素?；禾擒蘸彤愂罄钏?-O-葡萄糖苷在盛花后125 和140 d 均未測出。因此，不同品種間酚類物質(zhì)的變化規(guī)律和范圍略有不同[21-22]。

目前用于研究植物中抗氧化活性的方法有很多，但近年來最常用的方法是通過清除自由基的方法，這些方法有快速、簡單、穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)[23]。本文通過清除DPPH 和ABTS+的抗氧化能力來評價(jià)3 種梨果實(shí)發(fā)育過程中的抗氧化活性。抗氧化活性檢測發(fā)現(xiàn)，在果實(shí)發(fā)育前期，庫車阿木特、碭山酥梨和麻梨的DPPH 和ABTS+自由基清除能力逐漸降低，盡管在果實(shí)發(fā)育過程中，3 種梨果實(shí)的DPPH、ABTS+自由基清除能力呈現(xiàn)不完全一致的變化趨勢，但總體碭山酥梨的抗氧化能力要強(qiáng)于其他2個(gè)品種。

相關(guān)性分析顯示，3 種梨果實(shí)抗氧化活性與總黃酮、總酚以及13 種酚類物質(zhì)含量均存在正相關(guān)關(guān)系，其中梨果實(shí)中總黃酮、總酚、熊果苷、兒茶素、綠原酸、表兒茶素、山奈酚-3-O-葡萄糖苷和異鼠李素?；禾擒盏任镔|(zhì)與DPPH 自由基清除能力均存在極顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），且相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.95及以上。梨果實(shí)中最主要的抗氧化活性成分是總酚、熊果苷、綠原酸等，與張?jiān)芠24]和黃春輝等[25]在獼猴桃的研究中發(fā)現(xiàn)獼猴桃的抗氧化能力與總酚含量呈顯著正相關(guān)的研究結(jié)果一致。