劉海兵，徐莉莉，廖華寧，馬 娜，楊 柳，耿 蓉

（安徽安科余良卿藥業(yè)有限公司，安徽 合肥）

雄蠶蛾為蠶蛾科動物家蠶蛾Bombyx mori Linnaeus 雄蟲全體，《名醫(yī)別錄》首載原蠶蛾，列為中品，《本草綱目》載用雄原蠶蛾，列于第三十九卷，現(xiàn)今使用的與以上記述的基本相符，但南方所用原蠶蛾為家蠶蛾的雄性成蟲全體，而北方以柞蠶為主，兩者雖功能相近，但是兩種動物，不應(yīng)混淆。雄蠶蛾咸性溫，歸肝、腎經(jīng)，具有補肝益腎，壯陽澀精，用于陽痿，遺精，白濁，尿血，創(chuàng)傷，潰瘍及燙傷。國內(nèi)目前雄蠶蛾在浙江、陜西、山東、北京、山西等11 個省市的地方藥材標準中收載，但大多標準較簡單[1-4]，其質(zhì)量標準尚不能更好地滿足其質(zhì)量控制需要，因此我們系統(tǒng)地研究了雄蠶蛾藥材的性狀、鑒別、檢查、含量測定等質(zhì)量控制內(nèi)容，為雄蠶蛾藥材的質(zhì)量控制提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料與儀器

ME104 型電子分析天平，DHG-9070A 型電熱鼓風干燥箱；GLT-A 型馬弗爐。UV-754 型紫外一可見分光光度計；電熱恒溫干燥箱。硅膠G 薄層板，實驗所用試藥與試劑均為分析純。

雄蠶蛾對照藥材（批號111746-201306）、亮氨酸對照品（批號876-200204）、纈氨酸對照品（批號140681-200401）、丙氨酸對照品（批號0873-9802）；小牛血清白蛋白 (BSA)、考馬斯亮藍G-250 (批號220729) 。采集的雄蠶蛾樣品共10 批，來自于安徽、江蘇、浙江和江西等4 省8 市，均為活體鮮品。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀

本品全體呈污白色，密被白色鱗片，體長約2 cm，翅展約4 cm。頭部小，復(fù)眼1 對，黑色，半圓形。胸部有翅2 對，前翅較大，近三角形，后翅較小，近圓形，多已殘缺。腹部較狹窄，末稍稍尖。質(zhì)脆易碎。氣微腥。具體見圖1。

圖1 雄蠶蛾性狀圖

2.2 薄層鑒別

2.2.1 薄層色譜鑒別(1)

取雄蠶蛾樣品，60 ℃烘干6 h，粉碎，取粉末1 g，加乙醇20 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液置水浴上濃縮至干，殘渣加乙醇2 mL 使溶解，離心5 min，取上清液作為供試品溶液。取雄蠶蛾對照藥材0.5 g 同法制備對照藥材溶液。另取亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸對照品，加乙醇制成每1 mL 各含1 mg 的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗，吸取上述三種溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以正丁醇-醋酸-水（3:3:1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以0.5%茚三酮乙醇溶液，于105 ℃烘至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品和對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，各樣品薄層色譜見圖2。

圖2 雄蠶蛾藥材亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸薄層色譜鑒別

2.2.2 薄層色譜鑒別(2)

分別吸取“2.2.1”項下對照藥材和供試品溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以正己烷-三氯甲烷-甲醇（8:3:1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃烘至顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，各樣品薄層色譜見圖3。

圖3 雄蠶蛾藥材薄層色譜鑒別

2.3 檢查

2.3.1 干燥失重

取本品60 ℃干燥6 h，按照2020 年版《中國藥典》四部通則0831 干燥失重測定法測定，測定10 批樣品干燥失重結(jié)果為2.07%～3.11%。

2.3.2 灰分

取本品60 ℃干燥6 h，按照2020 年版《中國藥典》四部通則2302 總灰分測定法測定，測定10 批樣品灰分結(jié)果為3.73%～5.19%。

2.4 浸出物

雄蠶蛾主要含脂肪酸和雄性激素，溶于稀乙醇，因此用稀乙醇作溶劑，按照2020 年版《中國藥典》四部通則2201 醇溶性浸出物測定法下的冷浸法，測定10 批樣品浸出物結(jié)果為10.98%～15.44%。

2.5 含量測定

2.5.1 蛋白質(zhì)標準溶液的制備

取小牛血清白蛋白標準品10 mg，精密稱定，置100 mL 量瓶中，加水使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.5.2 考馬斯亮藍G-250 染色溶液的配制

精密稱取考馬斯亮藍G-250 染料0.02 g，加95%乙醇10 mL 溶解，再加磷酸20 mL，加水定容至200 mL，混勻，過濾，取濾液即得。

2.5.3 標準曲線的制備

精密量取蛋白質(zhì)標準溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置具塞試管中，加水至1 mL，搖勻，再加入考馬斯亮藍G-250 溶液5 mL，放置5 min，以第1 支試管中的溶液為空白，照紫外-可見分光光度法，在595 nm 波長處測定吸光度。以蛋白濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標制作標準曲線，得線性回歸方程Y= 0.0074X+0.0079，r=0.996（n=6）。結(jié)果表明標準蛋白在濃度為10.46 μg/mL～104.6 μg/mL 范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系，可以用來進行蛋白質(zhì)含量的測定。

2.5.4 精密度試驗

精密吸取標準液0.4 mL，加水至1 mL，同“2.5.3”項下方法測定其吸光度。重復(fù)操作6 次，測定的吸光度RSD 為1.48%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.5.5 重現(xiàn)性試驗

制備雄蠶蛾藥材供試品溶液，平行處理6 份，測定吸光度，計算各樣品蛋白含量RSD 為1.28%，結(jié)果表明樣品測定重現(xiàn)性良好。

2.5.6 穩(wěn)定性試驗

制備雄蠶蛾藥材供試品溶液，按上述方法測定樣品在10 min, 20 min, 30 min, 60 min，90 min，120 min 時的吸光度。測定吸光度RSD 為1.69%，結(jié)果表明樣品在2 h 內(nèi)測定是穩(wěn)定的。

2.5.7 準確度試驗

采用加樣回收法，精密雄蠶蛾藥材樣品6 份，每份約0.1 g，精密稱定，分別精密加入含量為3.3 mg/mL 的小牛血清白蛋白對照品溶液1 mL，另加入pH值為8.0 的蒸餾水1 mL，60 ℃提取30 min，制備供試品溶液，測定蛋白含量，并計算加樣回收率。平均回收率為99.21%，RSD 為1.75%，結(jié)果表明本方法準確度較好。

2.5.8 樣品測定

取本品，60 ℃干燥6 h，粉碎，過四號篩，于P2O5干燥器中干燥12 h。稱取干燥粉末用濾紙包裹，置于索氏提取器中，加入適量石油醚（30～60 ℃），60 ℃恒溫水浴回流提取約4 h，至提取液無色，取出濾紙包，揮干溶劑。稱取藥渣粉末約0.1 g，精密稱定，置5 mL離心管中，加pH 值為8.0 的蒸餾水2 mL，稱定重量。60 ℃超聲提取30 min，稱定重量并用pH 值為8.0 的蒸餾水補足減失的重量。靜置，離心（每分鐘12 000轉(zhuǎn)）5 min，精密取上清液0.05 mL，照標準曲線制備項下的方法，自“各管補加雙蒸水至1 mL”起，依法測定吸光度，依據(jù)標準曲線計算供試品溶液中蛋白質(zhì)的含量，10 批樣品蛋白質(zhì)含量見表1。

表1 雄蠶蛾藥材蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果(n=2)

3 討論

蛋白質(zhì)及激素類為雄蠶蛾藥材的活性成分[5-7]，因此，從蛋白質(zhì)含量角度對雄蠶蛾藥材質(zhì)量進行考察具有重要意義。鑒于此，本研究通過對10 個產(chǎn)地雄蠶蛾藥材的蛋白質(zhì)含量進行了比較分析研究，以期為中藥雄蠶蛾質(zhì)量標準的建立提供理論和實驗依據(jù)。

由于雄蠶蛾含有較多的油脂成分，對蛋白質(zhì)的含量測定有較大影響，故需對雄蠶蛾藥材樣品進行前處理，以充分提取可溶性蛋白質(zhì)。我們分別采用石油醚（30～60 ℃）、乙醚、乙酸乙酯和無水乙醇對樣品進行脫脂處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用石油醚脫脂處理后效果較好。比較回流和超聲兩種提取方式下蛋白質(zhì)得率的高低。結(jié)果表明，超聲方式提取的蛋白量較高。分別對提取溶劑的pH 值、料液比、提取溫度和時間進行單因素考察，確定雄蠶蛾藥材最佳提取條件為：采用20 倍體積的pH 值8.0 的蒸餾水，60 ℃提取30 min 時可溶性蛋白的提取率為最高。

比較2020 年版《中國藥典》四部中“蛋白質(zhì)含量測定”中六種方法[8]，考馬斯亮藍染色法(Bradford 法)靈敏度高，最低檢測1～5 mg，測定快速、簡便，染色穩(wěn)定，干擾物質(zhì)少。因此，本研究中首次采用該方法測定雄蠶藥材中的蛋白含量。

段秀俊等[9]蠶蛾藥材的質(zhì)量標準提升研究中建立了雄蠶蛾性狀鑒別、顯微鑒別、水分、總灰分、酸不溶性灰分、薄層鑒別及含量測定等質(zhì)量標準對于控制蠶蛾藥材質(zhì)量具有顯著意義，但其總氮量的測定對蛋白質(zhì)含量的測定專屬性不強，17 中氨基酸含量的測定方法一般企業(yè)質(zhì)控部門不具備檢驗條件。本研究建立的質(zhì)量控制方法簡單、穩(wěn)定、可靠，成本可控。