侯敏杰，林淑璇，呂 洋

(河北北方學(xué)院病理學(xué)教研室,河北 張家口 075000)

食管癌是全球第八大最常見的癌癥類型,是導(dǎo)致癌癥死亡的第六大原因[1]。我國(guó)的食管癌在華北地區(qū)尤為高發(fā),且食管癌患者的預(yù)后仍然較差[2-3]。中藥在放化療治療食管癌過程中起到了顯著的增效減毒作用[4]。苦參堿已被證明具有抗纖維化、抗病毒、抗炎及免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用[5-9]。細(xì)胞自噬作為一種細(xì)胞死亡過程,已被證實(shí)與多種人類疾病相關(guān),其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要意義[10]。自噬可以調(diào)節(jié)腫瘤的形成、增殖、轉(zhuǎn)移以及能量代謝等諸多方面[11]。研究發(fā)現(xiàn),苦參堿可以誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌[12]、乳腺癌[13]和髓母細(xì)胞瘤[14]等多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬。但目前關(guān)于苦參堿對(duì)食管癌細(xì)胞自噬的作用研究較少。基于此,本研究初步探討苦參堿對(duì)食管癌自噬的作用及可能的作用機(jī)制,以期為苦參堿在臨床食管癌治療中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、藥物、試劑及儀器

Eca-109細(xì)胞株購(gòu)自南京凱基生物科技有限公司;苦參堿(純度≥98%)購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司;RPMI 1640 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Corning公司,胎牛血清購(gòu)自德國(guó)Cegrogen Biotech公司,胰蛋白酶購(gòu)自以色列Biological Industries (BioInd) 公司,四甲基偶氮唑鹽[3-(4,5)-dimethylthahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazolumromide,MTT]購(gòu)自梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司,蛋白提取試劑盒購(gòu)自英文特生物技術(shù)(北京)有限公司,聚氰基丙烯酸正丁脂蛋白定量試劑盒購(gòu)自河北瑞帕特生物科技有限公司,自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)購(gòu)自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司,兔抗人微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein light chain 3,LC3)、Beclin1和多聚蛋白62(polyprotein 62,P62)一抗購(gòu)自日本MBL公司,兔抗人肝激酶B1(liver kinase B1,LKB1)一抗、磷酸化肝激酶B1(phosphorylated liver kinase B1,p-LKB1)一抗、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)試劑盒購(gòu)自武漢愛博泰克生物技術(shù)有限公司,兔抗人腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK)、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(phosphorylated adenosine monophosphate-actived protein kinase,p-AMPK)一抗購(gòu)自杭州華安生物技術(shù)有限公司,兔抗人哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、磷酸化哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(phosphorylated mammalian target of rapamycin,p-mTOR)一抗購(gòu)自上海帛龍生物科技有限公司,二抗及熒光二抗購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司,RNA提取試劑盒購(gòu)自成都福際生物技術(shù)有限公司,反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司,Beclin1基因引物購(gòu)自上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司;CO2恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó) Thermo 公司,倒置相差熒光顯微鏡購(gòu)自日本Nikon公司,AI600超靈敏化學(xué)發(fā)光成像儀購(gòu)自美國(guó) GE 公司,Mastercycler nexus gradient 基因擴(kuò)增儀購(gòu)自德國(guó) Eppendorf 公司,PikoReal 五通道實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀購(gòu)自美國(guó) Thermo 公司,透射電子顯微鏡購(gòu)自日本日立公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

Eca-109細(xì)胞復(fù)蘇后,置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度約80%時(shí),去除上清,磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)洗滌細(xì)胞,2.5 g·L-1胰蛋白酶消化細(xì)胞后加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的 RPMI 1640培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性

取傳代培養(yǎng)Eca-109細(xì)胞重懸計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞密度為8×107L-1,接種于96孔板中,于細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度約 60%時(shí),吸去上清,將細(xì)胞分為對(duì)照組、低濃度苦參堿組、中濃度苦參堿組和高濃度苦參堿組。對(duì)照組細(xì)胞加入100 μL含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基,低濃度苦參堿組細(xì)胞加入終質(zhì)量濃度為1.0 g·L-1苦參堿溶液,中濃度苦參堿組細(xì)胞加入終質(zhì)量濃度為1.5 g·L-1苦參堿溶液,高濃度苦參堿組細(xì)胞加入終質(zhì)量濃度為2.0 g·L-1苦參堿溶液。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,加入20 μL MTT,避光孵育 4 h 后,吸去上清,每孔加入100 μL二甲基亞砜,溫箱孵育10 min,用酶標(biāo)儀測(cè)490 nm處吸光度(absorbance,A)值,計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=[1-(A藥物處理組-A空白孔)/(A未處理組-A空白孔)]×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取均值。

1.2.3 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)Eca-109細(xì)胞中 LC3 蛋白的定位及表達(dá)

取傳代培養(yǎng)Eca-109細(xì)胞,重懸計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞密度為1×109L-1,接種于24孔培養(yǎng)板(24孔板中已提前放好無菌小圓片),細(xì)胞進(jìn)行爬片,待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度約80% 時(shí),吸去上清,分為對(duì)照組、低濃度苦參堿組、中濃度苦參堿組和高濃度苦參堿組。對(duì)照組細(xì)胞加入500 μL含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基,低、中、高濃度苦參堿組細(xì)胞的干預(yù)措施同“1.2.2”項(xiàng)。各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后用多聚甲醛固定 2 h,棄甲醛,經(jīng)破膜、染色阻斷后,添加兔抗人 LC3 一抗(滴度為11 000),4 ℃ 過夜,避光加入熒光二抗,抗熒光封片,激光共聚焦觀察并保存圖像。

1.2.4 Western blot法檢測(cè)Eca-109細(xì)胞中P62和LC3蛋白的表達(dá)

1.2.5 RT-qPCR法檢測(cè)Eca-109細(xì)胞中Beclin1 mRNA的表達(dá)

1.2.6 透射電子顯微鏡觀察Eca-109細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)

1.2.7 Western blot法檢測(cè)Eca-109細(xì)胞中LC3、Beclin1、LKB1、p-LKB1、AMPK、p-AMPK、mTOR和p-mTOR蛋白的相對(duì)表達(dá)量

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 對(duì)照組、低濃度苦參堿組、中濃度苦參堿組和高濃度苦參堿組Eca-109細(xì)胞增殖抑制率比較

對(duì)照組、低濃度苦參堿組、中濃度苦參堿組和高濃度苦參堿組細(xì)胞增殖抑制率分別為(2.903±0.788)%、(26.540±1.386)%、(30.220±1.357)%、(39.990±1.167)%。低、中、高濃度苦參堿組細(xì)胞增殖抑制率顯著高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);中濃度苦參堿組和高濃度苦參堿組細(xì)胞增殖抑制率顯著高于低濃度苦參堿組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);高濃度苦參堿組細(xì)胞增殖抑制率顯著高于中濃度苦參堿組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 對(duì)照組、低濃度苦參堿組、中濃度苦參堿組和高濃度苦參堿組Eca-109細(xì)胞中LC3蛋白的定位及表達(dá)

對(duì)照組、低濃度苦參堿組、中濃度苦參堿組和高濃度苦參堿組Eca-109細(xì)胞質(zhì)中均可見到紅色熒光標(biāo)記的LC3蛋白陽性表達(dá)。對(duì)照組細(xì)胞中LC3蛋白呈彌散狀態(tài);各濃度苦參堿組細(xì)胞中LC3蛋白呈斑點(diǎn)狀態(tài),且苦參堿濃度越高,細(xì)胞質(zhì)中呈斑點(diǎn)狀LC3蛋白越多。結(jié)果見圖1。

A:對(duì)照組;B:低濃度苦參堿組;C:中濃度苦參堿組;D:高濃度苦參堿組。

2.3 對(duì)照組、低濃度苦參堿組、中濃度苦參堿組和高濃度苦參堿組Eca-109細(xì)胞中P62和LC3蛋白表達(dá)比較

低、中、高濃度苦參堿組Eca-109細(xì)胞中P62蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);中濃度苦參堿組和高濃度苦參堿組Eca-109細(xì)胞中P62蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著低于低濃度苦參堿組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);中濃度苦參堿組與高濃度苦參堿組Eca-109細(xì)胞中P62蛋白的相對(duì)表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。低濃度苦參堿組與對(duì)照組Eca-109細(xì)胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);中濃度苦參堿組和高濃度苦參堿組Eca-109細(xì)胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ顯著高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。中濃度苦參堿組和高濃度苦參堿組Eca-109細(xì)胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ顯著高于低濃度苦參堿組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);高濃度苦參堿組Eca-109細(xì)胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ顯著高于中濃度苦參堿組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見圖2和表1。

表1 對(duì)照組、低濃度苦參堿組、中濃度苦參堿組和高濃度苦參堿組Eca-109細(xì)胞中P62蛋白表達(dá)量及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比較

A:對(duì)照組;B:低濃度苦參堿組;C:中濃度苦參堿組;

2.4 對(duì)照組、低濃度苦參堿組、中濃度苦參堿組和高濃度苦參堿組Eca-109細(xì)胞中Beclin1 mRNA表達(dá)比較

對(duì)照組、低濃度苦參堿組、中濃度苦參堿組和高濃度苦參堿組Eca-109細(xì)胞中Beclin1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為1.000±0.000、1.730±0.180、3.230±0.255、8.123±0.890。低、中、高濃度苦參堿組Eca-109細(xì)胞中Beclin1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。中濃度苦參堿組和高濃度苦參堿組Eca-109細(xì)胞中Beclin1 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于低濃度苦參堿組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);高濃度苦參堿組Eca-109細(xì)胞中Beclin1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著高于中濃度苦參堿組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.5 對(duì)照組和高濃度苦參堿組 Eca-109細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)

對(duì)照組細(xì)胞中可見正常的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器和細(xì)胞核;高濃度苦參堿組細(xì)胞質(zhì)中可見大量大小不等的自噬泡,并可見包裹有細(xì)胞內(nèi)容物的自噬體,而細(xì)胞核未見明顯異常;結(jié)果見圖3。

A:對(duì)照組(×3 000);B～D:高濃度苦參堿組(×20 000)

2.6 對(duì)照組、自噬抑制劑組、苦參堿組和自噬抑制劑+苦參堿組Eca-109細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白及LKB1/AMPK/mTOR 信號(hào)通路蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

自噬抑制劑組與對(duì)照組Eca-109細(xì)胞中Beclin1蛋白的相對(duì)表達(dá)量和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);苦參堿組和自噬抑制劑+苦參堿組Eca-109細(xì)胞中Beclin1蛋白的相對(duì)表達(dá)量和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ 均顯著高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)?？鄥A組和自噬抑制劑+苦參堿組Eca-109細(xì)胞中Beclin1蛋白的相對(duì)表達(dá)量和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ 均顯著高于自噬抑制劑組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);自噬抑制劑+苦參堿組Eca-109細(xì)胞中Beclin1蛋白的相對(duì)表達(dá)量和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ 均顯著低于苦參堿組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

自噬抑制劑組Eca-109細(xì)胞中p-LKB1/LKB1、p-AMPK/AMPK顯著低于對(duì)照組,p-mTOR/mTOR顯著高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);苦參堿組Eca-109細(xì)胞中p-LKB1/LKB1、p-AMPK/AMPK顯著高于對(duì)照組,p-mTOR/mTOR顯著低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);自噬抑制劑+苦參堿組Eca-109細(xì)胞中p-LKB1/LKB1、p-AMPK/AMPK顯著高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);自噬抑制劑+苦參堿組與對(duì)照組Eca-109細(xì)胞中p-mTOR/mTOR比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?？鄥A組和自噬抑制劑+苦參堿組Eca-109細(xì)胞中p-LKB1/LKB1、p-AMPK/AMPK顯著高于自噬抑制劑組,p-mTOR/mTOR顯著低于自噬抑制劑組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);自噬抑制劑+苦參堿組Eca-109細(xì)胞中p-LKB1/LKB1、p-AMPK/AMPK顯著低于苦參堿組,p-mTOR/mTOR顯著高于苦參堿組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見表2和圖4。

表2 對(duì)照組、自噬抑制劑組、苦參堿組和自噬抑制劑+苦參堿組Eca-109細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白及LKB1/AMPK/mTOR 信號(hào)通路蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

A:對(duì)照組;B:自噬抑制劑組;C:苦參堿組;D:自噬抑制劑+苦參堿組。

3 討論

食管癌是常見的消化道惡性腫瘤,其早期手術(shù)治療有較好的臨床效果,但對(duì)于進(jìn)展期患者,單純手術(shù)治療難以取得滿意的臨床效果,且術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移較為多見,因此常輔助以化學(xué)治療、免疫治療等綜合治療。長(zhǎng)期使用一類藥物進(jìn)行治療時(shí),除藥物本身會(huì)對(duì)患者身體造成一定的損害外,腫瘤亦容易產(chǎn)生耐藥性。因此,需要尋找有效且毒副作用較小的新型抗腫瘤藥物,制定個(gè)性化方案,以延長(zhǎng)患者的遠(yuǎn)期生存率,提高患者的生存質(zhì)量。

中醫(yī)藥文化歷史悠久,中草藥因其治療疾病安全有效且毒副作用較小等優(yōu)勢(shì),已被廣泛用于治療各種疾病。苦參是一味傳統(tǒng)中草藥,屬豆科槐屬植物,其性寒味苦,主要功能是清熱燥濕、利尿?？鄥A是來源于苦參的單體成分,目前關(guān)于苦參堿對(duì)食管癌的治療效果罕有報(bào)道,其作用機(jī)制也不清楚。有研究發(fā)現(xiàn),苦參堿具有阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬和凋亡等作用,體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其對(duì)肝癌、結(jié)腸癌有較好的抑制作用[15-17]。

研究顯示,苦參堿對(duì)胃癌具有顯著的抗腫瘤活性,而且苦參堿誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞死亡時(shí)凋亡和自噬均被激活[18]。細(xì)胞自噬與腫瘤有著密切關(guān)系,在自噬過程中,哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物(mammalian target of rapamycin complex,mTORC)處于整個(gè)自噬過程的起點(diǎn)。細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路如果可以影響到mTORC的活性,那么就能調(diào)控下游自噬的過程?？鼓[瘤藥物常通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡或自噬發(fā)揮治療作用[19]。LIN 等[20]研究發(fā)現(xiàn),苦參堿可抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和侵襲,同時(shí)促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡和自噬,進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究發(fā)現(xiàn),不同濃度苦參堿組Eca-109細(xì)胞中LC3熒光斑點(diǎn)隨濃度升高而增多,提示苦參堿可誘導(dǎo)Eca-109細(xì)胞自噬。

AMPK 的激活能磷酸化結(jié)節(jié)性硬化癥復(fù)合物,從而促進(jìn) mTOR的失活,誘導(dǎo)細(xì)胞自噬水平的提高。AMPK 也能直接磷酸化mTOR調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白,抑制 mTOR,上調(diào)細(xì)胞自噬。LKB1是AMPK的上游激酶,其可通過形成p-LKB1進(jìn)而激活A(yù)MPK,從而調(diào)節(jié)自噬。有研究表明,細(xì)胞在缺氧或者缺乏營(yíng)養(yǎng)的狀況下,能激活A(yù)MPK并顯著增加 AMPK蛋白的表達(dá),抑制mTOR的活性,進(jìn)而激活自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)[21]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn) ,Beclin1蛋白表達(dá)量及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p-LKB1/LKB1和p-AMPK/AMPK在苦參堿組細(xì)胞中最高,當(dāng)加入自噬抑制劑后,相關(guān)蛋白的表達(dá)量下降;而p-mTOR/mTOR在苦參堿組最低,當(dāng)加入自噬抑制劑后,p-mTOR/mTOR卻增加。本研究還發(fā)現(xiàn),苦參堿可促進(jìn)p-LKB1、p-AMPK蛋白的表達(dá),抑制p-mTOR蛋白的表達(dá),進(jìn)而上調(diào)自噬,這表明苦參堿激活了LKB1/AMPK/mTOR信號(hào)通路。以上結(jié)果提示,苦參堿可能是通過調(diào)節(jié)LKB1/AMPK/mTOR通路蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)食管癌Eca-109細(xì)胞發(fā)生自噬的。

4 結(jié)論

苦參堿可以抑制細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生自噬,LKB1/AMPK/mTOR信號(hào)通路可能涉及自噬的誘導(dǎo)。本研究為苦參堿治療食管癌提供一定的理論基礎(chǔ),苦參堿可能成為未來臨床輔助治療食管癌的新措施,但苦參堿誘發(fā)自噬的具體機(jī)制有待深入探究。