王曉春 高婷 楊煒迪 王川 陳彩錦

（1 寧夏農(nóng)林科學(xué)院動物科學(xué)研究所，750000，寧夏銀川；2 寧夏農(nóng)林科學(xué)院固原分院，756000，寧夏固原）

紫花苜蓿（MedicagosativaL.）被譽(yù)為“牧草之王”，具有適應(yīng)性強(qiáng)、產(chǎn)草量高和營養(yǎng)豐富等優(yōu)點，是世界各國人工草地和畜牧養(yǎng)殖中重要的草種[1]。近年來，隨著我國“振興奶業(yè)苜蓿發(fā)展行動”和“糧改飼”等政策的實施，苜蓿的種植面積逐漸擴(kuò)大，已是我國種植面積最大的豆科牧草[2]。市場上流通的苜蓿種子主要是國外育成品種。紫花苜蓿傳統(tǒng)育種方法周期長，制約了育種速度，國產(chǎn)自主苜蓿品種的研發(fā)任重道遠(yuǎn)。轉(zhuǎn)基因分子育種技術(shù)通過外源目的基因的高效轉(zhuǎn)化，可加速育種進(jìn)程。

體細(xì)胞胚胎再生具有嵌合體少、多再生型和遺傳背景一致的優(yōu)點[3]，是一種常用的高效遺傳轉(zhuǎn)化途徑。有關(guān)紫花苜蓿體胚途徑建立再生體系的研究相對較多，李玉珠等[4]以9 個苜蓿品種的下胚軸為外植體，通過不同激素配比，有2 個品種最終誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚。溫之雨等[5]通過愈傷誘導(dǎo)和體胚誘導(dǎo)等幾個關(guān)鍵環(huán)節(jié)的研究，最終建立了紫花苜蓿品種三得利的高頻再生體系。但紫花苜蓿體細(xì)胞胚胎再生途徑依然存在培養(yǎng)周期長、分化率低和可重復(fù)性差等缺點。本研究以紫花苜蓿地方品種固原紫花為對象，開展不同外植體、激素種類和激素濃度配比的研究，旨在建立該品種高頻再生體系，為該品種的遺傳轉(zhuǎn)化提供穩(wěn)定的受體。

1 材料與方法

1.1 材料及無菌苗培養(yǎng)

供試材料為紫花苜蓿地方品種固原紫花。將固原紫花干種子在水龍頭下沖洗，留下飽滿的種子，在超凈工作臺消毒，先用75%的酒精振蕩消毒1min，無菌水沖洗3 遍，再用0.1%升汞消毒15min，沖洗后接種在1/2 MS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2 外植體選取

取發(fā)芽7d 后無菌苗的下胚軸、莖段、子葉和健壯再生苗的幼嫩葉片和葉柄，并將下胚軸、莖段和葉柄切割成1cm 長小段，子葉和真葉劃割四邊，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基內(nèi)。

1.3 不同2,4-D 濃度對苜蓿愈傷/胚性愈傷組織的誘導(dǎo)

以MS 培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，分別添加0、2、4、6、8mg/L 的2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）處理，接種下胚軸、莖段和子葉3 種外植體，每個處理20 瓶，每瓶15 個外植體。待完全脫分化后，轉(zhuǎn)入1/2 MS 培養(yǎng)基內(nèi)分化，統(tǒng)計出愈率，記錄完全脫分化時間、愈傷組織狀態(tài)及體細(xì)胞胚發(fā)育情況。12d 繼代一次，繼代培養(yǎng)基為原培養(yǎng)基。

1.4 2,4-D 與不同細(xì)胞分裂素組合對苜蓿愈傷/胚性愈傷組織的誘導(dǎo)

以MS 培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，通過低濃度（0.5mg/L）的細(xì)胞分裂素6-芐基氨基嘌呤（6-BA）、激動素（KT）與初篩出的2,4-D 濃度范圍進(jìn)行組合，配方見表1。待完全脫分化后觀測出愈率，并記錄愈傷組織狀態(tài)及體細(xì)胞胚發(fā)育情況。

1.5 胚性愈傷組織/體胚苗的分化培養(yǎng)

將脫分化后的愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基。分化培養(yǎng)基以1/2 MS 培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加低濃度6-BA、KT 和NAA，設(shè)置6 個分化培養(yǎng)基處理：D0（不添加對照，CK）[6]、D1（0.5mg/L KT+0.1mg/L NAA）、D2（0.5mg/L KT+0.3mg/L NAA）[7]、D3（1.0mg/L KT+0.5mg/L NAA）[8]、D4（0.4mg/L KT）[9]、D5（2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA）[10]，D2 根據(jù)D3 降低了NAA 濃度。

1.6 再生苗的誘導(dǎo)及體細(xì)胞的分化

分化出的再生苗經(jīng)培養(yǎng)基1/2 MS+0.1mg/L 吲哚丁酸（IBA）進(jìn)行生根、壯苗培養(yǎng)后，以葉片和葉柄為外植體，再經(jīng)誘導(dǎo)和分化培養(yǎng)，觀察再生苗的誘導(dǎo)、分化情況。

1.7 培養(yǎng)條件

所有培養(yǎng)基pH 均調(diào)至5.8，蔗糖濃度30g/L，瓊脂粉7.5g/L。在智能人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)，溫度25℃±2℃，除愈傷階段暗處理，其他培養(yǎng)均為16h/8h 光暗周期，光照強(qiáng)度2000lx，每天觀察并及時挑揀出生菌的培養(yǎng)瓶。

1.8 數(shù)據(jù)處理

愈傷組織誘導(dǎo)率（%）=完全脫分化的愈傷組織數(shù)/接種的外植體數(shù)×100；分化率（%）=有體細(xì)胞胚發(fā)生的愈傷組織數(shù)/接種的愈傷組織數(shù)×100；成苗率（%）=發(fā)育出莖、葉的植株數(shù)/接種的有體胚發(fā)生的愈傷組織數(shù)×100。

利用Excel 對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，用SPSS 17.0 軟件對結(jié)果進(jìn)行Duncan 法多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度2,4-D 對苜蓿愈傷/胚性組織誘導(dǎo)的影響

由表2 可知，不添加2,4-D 的對照處理外植體誘導(dǎo)率為0.0%，與添加2,4-D 處理間差異顯著（P＜0.05）。當(dāng)2,4-D 濃度為2、4mg/L 時，誘導(dǎo)率都達(dá)到100.0%，約24d 后完全脫分化，愈傷塊在顏色和質(zhì)地上無明顯區(qū)別，但整體上前者比后者體積小。當(dāng)2,4-D 濃度為6mg/L 時，誘導(dǎo)率下降為84.7%，愈傷塊體積較2,4-D 4mg/L 處理?。划?dāng)增大到8mg/L 時，誘導(dǎo)率降到76.6%，愈傷塊體積最小，且在繼代培養(yǎng)過程中，脫分化愈傷組織開始褐化時間早于其他處理。由此可見，高濃度的2,4-D 對外植體愈傷化有抑制作用。

表2 不同濃度2,4-D 對苜蓿愈傷組織的誘導(dǎo)Table 2 Induction effects of different concentrations of 2,4-D on alfalfa callus

2.2 不同外植體的愈傷效果

將無菌苗的莖段、下胚軸和葉片3 種外植體分別放置在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)，誘導(dǎo)率均達(dá)到100.0%。下胚軸和幼莖放置3d 后愈傷化啟動，增粗，逐漸蓬松。大概4d 后可見葉片增厚（圖1）。下胚軸和幼莖愈傷速度前期稍快于葉片，但經(jīng)繼代培養(yǎng)，24d 后都能完全脫分化，不同來源外植體愈傷組織在形態(tài)上無明顯區(qū)別。

圖1 固原紫花的不同外植體及對應(yīng)的出愈狀態(tài)Fig.1 Different explants of Guyuan alfalfa and corresponding callus status

2.3 2,4-D 與不同細(xì)胞分裂素組合對苜蓿胚性愈傷組織誘導(dǎo)及分化的影響

常見的苜蓿胚性愈傷組織誘導(dǎo)是通過生長素2,4-D 與低濃度細(xì)胞分裂素6-BA、KT 的組合。通過2.2 結(jié)果可見，2,4-D 濃度在6mg/L 及以上時對苜蓿愈傷組織的誘導(dǎo)具有抑制作用。采用表1 配方，經(jīng)過20～25d 的誘導(dǎo)，除了CK，其余10 個組合外植體都已完全脫分化，誘導(dǎo)率達(dá)到100%（表3）。當(dāng)2,4-D 濃度為5mg/L 時，誘導(dǎo)出的愈傷塊體積略大于其他濃度，但愈傷塊在顏色和質(zhì)地上無區(qū)別，說明1～5mg/L 2,4-D 組合0.5mg/L 的6-BA與KT 對愈傷組織的形成有促進(jìn)作用。添加6-BA和KT 后形成的愈傷組織在質(zhì)地上有區(qū)別，前者為黃綠色，后者整體偏白色（圖2）。

圖2 不同細(xì)胞分裂素（6-BA、KT）與2,4-D 組合形成的愈傷組織Fig.2 Callus formed by combinations of different cytokinins(6-BA,KT)with 2,4-D

表3 不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基的愈傷塊的分化Table 3 Differentiation of callus in different induction media

分別將以上完全脫分化的愈傷塊轉(zhuǎn)入不添加任何激素且培養(yǎng)條件一致的分化培養(yǎng)基1/2 MS 中（參照李娟等[9]的文章），觀察分化出的胚狀體，統(tǒng)計分化率（表3）。

經(jīng)過20～30d 的培養(yǎng)，主要形成2 種類型的愈傷組織，一種是有綠色球形胚或有綠色芽點的愈傷組織，多次繼代，不失活，屬于胚性愈傷組織；另一種是無組織狀態(tài)、繼代1 次后逐漸褐化、失活，為非胚性愈傷組織（圖3）。I1～I(xiàn)10 培養(yǎng)基誘導(dǎo)出的愈傷組織在1/2 MS 培養(yǎng)基內(nèi)都分化出了胚狀體，但分化率都不高。添加6-BA 的組合（I1～I(xiàn)5）中，I2 組合的分化率最高（10.2%），I1 組合最低（7.2%）。添加KT 的組合（I6～I(xiàn)10）中，I7 組合的分化率最高（12.6%），I9 組合最低（7.4%）。由此可見，分化率最高的培養(yǎng)基2,4-D 添加濃度為2.0mg/L。不同濃度2,4-D 與6-BA 組合的胚狀體平均分化率為8.4%，與KT 組合的胚狀體平均分化率為9.4%，誘導(dǎo)培養(yǎng)基I7 分化率最高，2,4-D添加濃度為2.0mg/L、KT 為0.5mg/L。

圖3 2 種不同類型愈傷組織Fig.3 Two different types of calluses

2.4 不同分化培養(yǎng)基對胚性愈傷組織/體胚苗的影響

將添加2.0mg/L 2,4-D 組合0.5mg/L KT 的培養(yǎng)基誘導(dǎo)出的完全脫分化愈傷塊轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基，如圖4 所示，5 個分化培養(yǎng)基胚狀體分化率均高于CK，其中D4 的分化率（42.7%）顯著高于其他處理（P＜0.05），D5 的分化率最低，略高于CK（P＞0.05）。

圖4 不同分化培養(yǎng)基內(nèi)胚狀體/體胚苗的分化率比較Fig.4 Comparison of differentiation rates of embryo/seedlings in different differentiation media

2.5 再生苗的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)

將以上分化出的再生苗經(jīng)生根、壯苗培養(yǎng)（1/2 MS 培養(yǎng)基+0.1mg/L IBA）后擴(kuò)繁，擴(kuò)大再生苗數(shù)量。以再生苗的幼嫩葉片和葉柄為外植體，以不同濃度的2,4-D（1.0～8.0mg/L）組合0.5mg/L 6-BA、KT 培養(yǎng)基誘導(dǎo)，20d 后發(fā)現(xiàn)外植體均能100%誘導(dǎo)出胚性愈傷組織（黃綠色，有綠點），在不添加激素的分化培養(yǎng)基（1/2 MS）也分化出大量的胚狀體，且能分化為無根小苗，剝離出后在壯苗培養(yǎng)基里可發(fā)育成完整植株。

3 討論

3.1 不同來源外植體對苜蓿愈傷組織誘導(dǎo)及胚狀體分化的影響

紫花苜蓿體胚誘導(dǎo)途徑中常見的外植體有下胚軸、子葉、莖段、葉柄和根等，通常選擇生理代謝旺盛、分化程度較低的離體組織。下胚軸分化能力相對較強(qiáng)，是最佳外植體[11-12]。以子葉為外植體，可成功建立苜蓿高頻再生體系[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，下胚軸和莖段出愈早于葉片，完全脫分化時間短于葉片2～4d，但經(jīng)24d 誘導(dǎo)后，都能100%脫分化。不同外植體脫分化后的愈傷組織形態(tài)和質(zhì)地沒有明顯區(qū)別。但有研究[10-15]顯示，體胚分化能力與外植體來源有關(guān)。本研究中，3 種外植體的愈傷組織轉(zhuǎn)入不添加任何激素的分化培養(yǎng)基后，分化率都較低，最終分化出胚狀體的愈傷組織很少，多數(shù)都失活并褐化死亡，無法比較不同外植體的體胚分化能力。

3.2 2,4-D 與不同細(xì)胞分裂素組合對苜蓿愈傷組織誘導(dǎo)及體細(xì)胞胚發(fā)育的影響

2,4-D 濃度是影響苜蓿愈傷組織誘導(dǎo)率的主要因素[16]。不添加2,4-D（CK）的培養(yǎng)基苜蓿誘導(dǎo)率為0.0%，而添加2,4-D 的培養(yǎng)基都有愈傷組織出現(xiàn)。當(dāng)2,4-D 濃度為2、4mg/L 時，誘導(dǎo)率達(dá)100.0%；當(dāng)濃度為8mg/L 時，誘導(dǎo)率最低，愈傷塊體積最小，開始褐化時間也早，說明高濃度的2,4-D 對苜蓿愈傷組織的誘導(dǎo)有抑制作用，這個結(jié)論與史毅等[10]研究結(jié)果一致。

2,4-D 在苜蓿愈傷組織的誘導(dǎo)和體細(xì)胞胚早期發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用，且常與低濃度細(xì)胞分裂素配合使用[11]。王英哲等[13]研究顯示，2,4-D 與KT 組合能分化出胚狀體。張凌云等[7]認(rèn)為，2,4-D與6-BA 組合是最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基。李玉珠等[4]研究顯示，在相同濃度2,4-D 培養(yǎng)基上，有的品種添加KT 能誘導(dǎo)出胚狀體，而有的品種添加6-BA 有胚狀體出現(xiàn)。本研究中，當(dāng)2,4-D 濃度為1.0～5.0mg/L時，與0.5mg/L 6-BA 或KT 組合，都有胚狀體產(chǎn)生，但胚狀體分化率都較低，故有必要開展分化培養(yǎng)條件研究。

3.3 不同分化培養(yǎng)基對胚狀體分化的影響

高濃度的2,4-D 對苜蓿胚發(fā)生存在抑制作用[17]，故通常在愈傷組織脫分化后降低2,4-D 濃度或不添加。本研究發(fā)現(xiàn)，5 個添加激素處理（3個添加KT 組合NAA，1 個只添加KT，1 個添加6-BA 組合NAA）分化率都高于不添加激素的1/2 MS 培養(yǎng)基對照，說明添加低濃度的KT、6-BA 與NAA 組合以及單獨添加低濃度KT 對苜蓿體胚分化都有促進(jìn)作用。細(xì)胞分裂素對促進(jìn)體細(xì)胞胚成熟及進(jìn)一步分化有顯著作用[18]。KT 有促進(jìn)組織細(xì)胞分裂和分化不定芽的作用[8]，但KT 的添加不利于愈傷組織分化[19]。以上研究結(jié)果的不同可能與誘導(dǎo)愈傷組織的基本培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、苜蓿品種等因素有關(guān)。苜蓿體胚分化依然存在再生率不穩(wěn)定和試驗重復(fù)性差等問題，應(yīng)根據(jù)不同苜蓿品種開展相應(yīng)的分化培養(yǎng)條件、激素種類和濃度等研究。

3.4 再生苗對高頻再生體系建立的影響

以再生苗為外植體，開展愈傷組織的誘導(dǎo)和分化，發(fā)現(xiàn)葉片和葉柄在不同濃度2,4-D（1.0～8.0mg/L）和低濃度6-BA、KT 組合下，在不添加激素的1/2 MS 培養(yǎng)基上均能100%產(chǎn)生體細(xì)胞胚，經(jīng)剝離后都能發(fā)育成完整植株。從愈傷組織的誘導(dǎo)到完整植株的出現(xiàn)，與初代相比，再生周期縮短，植株更健壯，說明基因型是影響苜蓿體胚再生植株形成的最關(guān)鍵因素。這也驗證了Sairam 等[20]關(guān)于苜蓿愈傷組織的再生能力受基因型控制且高度遺傳的結(jié)論。由此可見，建立一個苜蓿品種穩(wěn)定高頻的體細(xì)胞胚胎再生途徑，可先誘導(dǎo)、分化出少數(shù)再生植株，再進(jìn)行大量擴(kuò)繁，從而以再生植株的外植體建立再生體系。

4 結(jié)論

以苜蓿地方品種固原紫花為材料，通過2,4-D與不同細(xì)胞分裂素組合及胚狀體分化培養(yǎng)基的比較篩選，得出胚性愈傷組織誘導(dǎo)率最高的培養(yǎng)基為MS 基本培養(yǎng)基+2.0mg/L 2,4-D+0.5mg/L KT，誘導(dǎo)率為12.6%；分化率最高的培養(yǎng)基為1/2 MS+0.4mg/L KT，分化率為42.7%。以分化出的再生苗開展誘導(dǎo)、分化，很容易建立穩(wěn)定的體胚高頻再生體系，可見苜蓿再生能力高度遺傳，高度依賴基因型。