◆作者：李 靜 嚴(yán) 霞 趙尉如 張 展 姬生躍 劉 燊* 張輝華

◆單位：1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)研究所；3.中基高科（北京）生物技術(shù)有限公司

我國培育的黃羽肉雞品種在畜禽中占比較大，成功將地方品質(zhì)資源轉(zhuǎn)化為了優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品（文杰，2021）。生產(chǎn)中，抗生素曾作為添加劑廣泛用于提高畜禽生產(chǎn)性能，但濫用導(dǎo)致藥物在畜禽體內(nèi)殘留，對食品安全和人類公眾健康造成威脅（Tian M，2021）。2020 年，中國禁止在日糧中添加抗生素來提高畜禽的飼料利用率和生長性能（Melaku M，2021）。此形勢下，尋找綠色高效的替抗產(chǎn)品成為研究熱點(diǎn)。市場上的抗生素替代品有益生菌、益生元、酶、草藥、抗菌肽等（Khan RU，2021）。在已經(jīng)應(yīng)用的產(chǎn)品中，作為動物防御關(guān)鍵屏障的抗菌肽具有天然抗菌、無毒副作用、作用快、選擇性強(qiáng)等特點(diǎn)，對提高畜禽生長性能、抗氧化等方面有積極作用（Ahmed T，2019；孫得發(fā)，2020）。與抗生素不同的是，抗菌肽是針對生物膜非蛋白質(zhì)細(xì)胞成分，使膜的通透性增大，成分較為穩(wěn)定（Boparai J，2020）。由于抗菌肽多機(jī)制、多途徑發(fā)揮作用，不僅增強(qiáng)了其抗菌效果，也降低了細(xì)菌發(fā)生耐藥性概率。因此具有安全高效、選擇性強(qiáng)和低組織蓄積性等多重優(yōu)勢，將其開發(fā)為治療藥物是目前的趨勢（Ahmed T，2019；孫得發(fā)，2020）。研究發(fā)現(xiàn)由至少兩種抗菌肽合成的新型雜合抗菌肽可以克服天然抗菌肽的缺點(diǎn)，并顯示出更強(qiáng)的抗菌效果（Gong GL，2018）。蜂毒素（Melittin）對革蘭氏菌具有抗菌作用，有抗癌、抗炎和佐劑特性，但對哺乳動物細(xì)胞存在較強(qiáng)的溶血性（Memariani H，2020；Ryu M，2021）。將蜂毒素與抗菌肽相結(jié)合是一種將蜂毒素的細(xì)胞毒性降至最低的解決方案（Memariani H，2019）。死亡素（Thanatin）是存在昆蟲“斑腹刺- 益蝽”血淋巴中的抗菌肽，較高濃度下對動物細(xì)胞不表現(xiàn)出溶血性，具有對細(xì)菌細(xì)胞膜的選擇性高于動物細(xì)胞膜的優(yōu)點(diǎn)（Dash R，2021）。應(yīng)用融合蛋白和氨基酸替換技術(shù)將蜂毒素與死亡素氨基酸進(jìn)行融合表達(dá)后，選擇效果最好的突變體進(jìn)行表達(dá)，得到的重組蜂毒素具有較高殺菌活性、穩(wěn)定性，可作為新一代多肽類飼料添加劑。

研究表明，在日糧中添加抗菌肽可以提高免疫性能，改善腸道組織結(jié)構(gòu)環(huán)境，具有預(yù)防疾病、降低死亡率和料重比的作用（Xie Z，2020）。此前本課題組已通過體外抑菌實驗驗證了重組蜂毒素對致病菌金黃色葡萄球菌、大腸桿菌均有顯著的抑制效果（陳柏東，2021）。然而，有關(guān)雜合抗菌肽在肉雞生產(chǎn)中應(yīng)用效果的報道較少。為此，本研究借鑒相關(guān)理論和研究方法，選用重組蜂毒素來作為抗生素替代品，評價其對黃羽肉雞的生長性能、血清抗氧化指標(biāo)及小腸腸道形態(tài)的影響。為重組蜂毒素在黃羽肉雞中作為飼料添加劑的應(yīng)用提供參考理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試驗設(shè)計

本試驗挑選初生體重相近，健康無病的1 日齡黃羽肉雞240羽；重組蜂毒素由中基高科（北京）生物技術(shù)有限公司提供；抗生素為土霉素鈣（以50 mg/kg 土霉素有效成分計）；抗氧化指標(biāo)測定使用試劑盒均購自南京建成科技有限公司；腸道組織切片由武漢博爾夫生物科技有限公司進(jìn)行制作。

將黃羽肉雞240 羽，隨機(jī)分為3 組，每組4 個重復(fù)，每個重復(fù)20 羽。NC 組為空白對照組飼喂基礎(chǔ)日糧，AN 組為抗生素組在對照組日糧基礎(chǔ)上添加500 mg/kg 土霉素鈣，AP 組為抗菌肽組在對照組日糧基礎(chǔ)上添加300 mg/kg 重組蜂毒素，試驗期63 d。

1.2 基礎(chǔ)飼糧和飼養(yǎng)管理

基礎(chǔ)飼糧參照NRC（1994）肉雞營養(yǎng)需要配制，為玉米-豆粕型飼糧，其組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗開始前對雞舍進(jìn)行消毒。采用2 層重疊式籠養(yǎng)，自由采食與飲水。采用自然采光和白熾燈補(bǔ)光相結(jié)合，24 h 光照，1 周后逐漸減少光照時間至自然光照，注意保溫，記錄每天的投喂量、溫度和濕度。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(%)

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 生長性能

分別于試驗的第1、21、42、63 天空腹稱量各重復(fù)試驗雞的體重，并記錄其耗料量，計算各階段體重（BW）、平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）和料重比（F/G）。

1.3.2 抗氧化指標(biāo)

試驗第21、42、63 天，每個重復(fù)隨機(jī)挑選1 只健康、接近平均體重的黃羽肉雞，翅下靜脈采血5 mL，3000 r/min 離心10 min（醫(yī)用離心機(jī)），取上清液，分裝于1.5 mL EP 管中，置于-80 ℃冰箱保存待測。采用南京建成的抗氧化檢測試劑盒對采集到的血清進(jìn)行超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、總抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化物酶（CAT）的酶活力測定。

1.3.3 腸道形態(tài)

于試驗第42 天，每個重復(fù)隨機(jī)挑選1 只健康、接近平均體重的黃羽肉雞，將雞放血處死后，取十二指腸、空腸、回腸中段2～3 cm 沖洗并放入10%的甲醛溶液中固定。將固定后的腸段切取做常規(guī)石蠟包埋并切片，經(jīng)HE 染色后，應(yīng)用Nikon Eclipse Ni-E 熒光顯微鏡測量絨毛高度（VH）和隱窩深度（CD）。顯微鏡下測定不同視野中15 個腸絨毛高度、隱窩深度并計算絨隱比（VH/CD）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），采用Duncan氏方法進(jìn)行了多重比較，分析結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”呈現(xiàn)，以P＜0.05 為差異顯著的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 添加重組蜂毒素對黃羽肉雞生長性能的影響

由表2 可知，在前期試驗（1-21d），AP 組和AN 組黃羽肉雞的21 日齡BW、ADG 和ADFI高于NC 組，AP 組F/G 低于AN組。在中期試驗（22-42d），AN 組和AP 組黃羽肉雞的42 日齡BW、ADG 高于NC 組。在后期試驗（43-63 d），AP 組的黃羽肉雞63 日齡BW、ADG 高于NC 組和AN 組，F(xiàn)/G 低于NC 和AN 組。

表2 重組蜂毒素對黃羽肉雞生長性能的影響

2.2 添加重組蜂毒素對黃羽肉雞抗氧化指標(biāo)的影響

由表3 可知，在21 日齡階段，AP 組的MDA 顯著低于NC組和AN 組（P＜0.05）；AP 組與AN 組的T-AOC 含量都略高于NC 組，但差異不顯著（P＞0.05）；而對比GSH-Px 則是AN 組和AP 組顯著低于NC 組（P＜0.05）；AP 組的CAT 顯著高于NC 組和AN 組（P＜0.05）；對于T-SOD，AP組顯著低于NC 組（P＜0.05）。在42 日齡階段，AN 組與AP 組的MDA 和T-AOC 與NC 組相比差異不大（P＞0.05）；AN 組和AP 組的GSH-Px 均顯著低于NC 組（P＜0.05）；CAT 含量AN 組顯著低于NC 組（P＜0.05）；T-SOD 含量AN 組顯著高于NC 組（P＜0.05），且AP 組與其他兩組均無顯著差異（P＞0.05）。在63 日齡階段，AP 組和AN 組的T-AOC 含量均顯著高于NC 組（P＜0.05）；GSH-Px 含量AN 組顯著低于NC 組（P＜0.05），且AP 組與其他兩組均無顯著差異（P＞0.05）。

表3 重組蜂毒素對黃羽肉雞抗氧化指標(biāo)的影響

2.3 添加重組蜂毒素對黃羽肉雞腸道形態(tài)的影響

由表4 可知，42 日齡時，AP組十二指腸絨毛高度高于NC組，與NC 組相比，AP 組的十二指腸隱窩深度值低，AP 組的十二指腸絨隱比顯著升高（P＜0.05）。AP 組與NC 組相比，回腸絨毛高度顯著升高（P＜0.05），空腸、回腸絨隱比差異不顯著（P＞0.05）。

表4 添加重組蜂毒素對黃羽肉雞腸道形態(tài)的影響

3 討論

本試驗在已有的研究基礎(chǔ)上，選擇土霉素鈣添加劑作為抗生素對照組與重組蜂毒素作為試驗組添加劑飼養(yǎng)的黃羽肉雞進(jìn)行對比。土霉素鈣是土霉素作為添加劑最為廣泛應(yīng)用的一種形式，在畜禽生產(chǎn)中可起到防治疫病，具有促進(jìn)生長性能的趨勢，提高經(jīng)濟(jì)效益的作用。然而畜禽產(chǎn)品中土霉素的殘留物及其分解產(chǎn)物對人體具有致癌等許多不良作用（Rizal GM，2018；Treiber FM，2021； 馬 改 彥，2017）。因此本試驗通過指標(biāo)測定以證明重組蜂毒素可以替代土霉素鈣作為新型添加劑應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)。

3.1 重組蜂毒素對抗氧化能力的影響

機(jī)體代謝會產(chǎn)生自由基和過氧化物，會對細(xì)胞、組織產(chǎn)生損傷，促使細(xì)胞凋亡。血清中MDA 的含量反映了畜禽受到自由基攻擊的損傷程度，T-AOC 則反映了抗氧化能力。GSH-Px、CAT、還原型GSH 和SOD 具有協(xié)同清除自由基的作用（Gupta S，2021；蘇愷，2013；王紅軍，2022；羊秀美，2021；朱安南，2022）。機(jī)體天然的抗氧化作用不足以避免氧化損傷，尋找抗氧化劑是必要的，而具有抗氧化能力的抗菌肽在不同來源的動植物、昆蟲中被廣泛發(fā)現(xiàn)（Moretta A，2021）。研究人員在鵪鶉日糧中添加0.12 g/kg 蜂毒素可以顯著降低MDA 含量，顯著提升血液中GSH-Px 和SOD 活性（李治利，2022）。本研究與前人研究結(jié)果一致，在日糧中添加重組蜂毒素，各日齡段AP 組肉雞血清中MDA 含量均低于NC 組，其中21 日齡段顯著低于NC 組和AN組，說明重組蜂毒素具有降低氧化損傷的作用。Chen 等（2016）的研究結(jié)果表明在日糧中添加抗菌肽可以顯著提升羅非魚的T-AOC、SOD、CAT和溶菌酶（LZM）活性，提高羅非魚的抗氧化活性和非特異性免疫功能。本試驗添加重組蜂毒素顯著提高了21 日齡階段肉雞血清中CAT活性。在42-63 日齡階段，日糧中添加抗菌肽MT 和土霉素鈣均提高了血清中T-AOC 活性，其中63 日齡段效果更顯著。同時邵明艷（2017）研究發(fā)現(xiàn)在肉雞生長后期，融合肽hEGFAWRK6 能夠顯著提高肝臟的T-AOC、GSH-Px 和SOD 活性，并且顯著降低了肝臟的MDA 水平。研究結(jié)果說明重組蜂毒素在肉雞生長后期作用更為顯著。綜上，在抗氧化性能方面，重組蜂毒素降低氧化損傷作用優(yōu)于土霉素鈣。

3.2 重組蜂毒素對腸道形態(tài)的影響

小腸腸道在家禽的消化系統(tǒng)中發(fā)揮了重要的作用，腸絨毛高度（VH）增加小腸與營養(yǎng)物質(zhì)的接觸面積，提高了營養(yǎng)物質(zhì)吸收效率及機(jī)體的生長性能。腸隱窩深度（CD）越淺就代表腸上皮細(xì)胞成熟率高，小腸對營養(yǎng)物質(zhì)吸收效率高。絨隱比（VH/CD）作為評定腸道健康的指數(shù)，數(shù)值越大表示營養(yǎng)吸收能力越強(qiáng)（劉夢雪，2022；張凱瑛，2021）。研究報道，飼喂1 mg/kg 抗菌肽MccJ25可改善被沙門氏菌和大腸桿菌損傷的腸道形態(tài)，添加抗菌肽的禽類空腸絨毛高度、絨隱比和十二指腸絨毛高度比抗生素組更高（Wang G，2020）。添加抗菌肽Microcin C7 顯著增加了肉雞絨毛高度，降低了隱窩深度，并增加了小腸VH/CD 比率（Dai Z，2021）。與前人結(jié)果一致，本實驗在肉雞基礎(chǔ)日糧中添加重組蜂毒素后，顯著增高了42 日齡黃羽肉雞的十二指腸VH/CD 值、十二指腸及回腸絨毛高度，顯著降低了十二指腸隱窩深度，改善了AP 組肉雞腸道結(jié)構(gòu)的同時促進(jìn)了對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。綜上，重組蜂毒素作為添加劑可以改善黃羽肉雞腸道形態(tài)促進(jìn)對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。

3.3 重組蜂毒素對生長性能的影響

抗菌肽作為畜禽飼料添加劑的研究被證明可以改善畜禽生長性能。徐博成等（2020）的研究表明，給仔豬飼喂抗菌肽產(chǎn)品，ADG 和ADFI 明顯提高，并且顯著提高生長性能。研究發(fā)現(xiàn)，在日糧中添加3.0%重組抗菌肽rTP4 使肉雞增重率和飼料效率顯著提高（Tai HM，2021）。與前人結(jié)果相似，與NC 組相比，AP 組各階段BW 和ADG 均有升高趨勢，表明日糧中添加重組蜂毒素可以促進(jìn)肉雞生長。本試驗中，添加300 mg/kgAP 組63 日齡肉雞BW 具有高于NC 組和AN 組趨勢，差異不顯著，可能是添加量不足。重組蜂毒素與土霉素鈣相比，具備替代土霉素鈣作為新型飼料添加劑的潛能。推測是重組蜂毒素有利于腸道的健康發(fā)育，利于營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用，從而提高生長性能，具體的生理調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

重組蜂毒素作為飼料添加劑，可提高黃羽肉雞生長性能、提高血清中的抗氧化能力，改善腸道形態(tài)，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收。在某種程度上可替代抗生素，具有一定的實用價值。重組蜂毒素在飼料中的具體添加量，仍需進(jìn)一步研究探討。

參考文獻(xiàn)：（略）