沈露茜，徐學(xué)靜，葉逸繁，陳 卓，陳 蘭，申鈺琪，李紅智*

1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，北京 100050；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)部，四川 瀘州 646000；3.溫州醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院 教育部檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325035

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)在神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的發(fā)病中占第二位,目前主要的治療手段是多巴類藥物,但只能改善部分癥狀,并不能阻止病情進(jìn)展,更不能治愈。帕金森病的細(xì)胞病理特征主要為多巴胺能神經(jīng)元變性,其發(fā)病可能是遺傳和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果,分為家族性和散發(fā)性,其中約95%為散發(fā)性的。線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ(簡稱復(fù)合體1)缺陷可導(dǎo)致帕金森病的病理特征和臨床癥狀[1-3]。線粒體功能障礙學(xué)說認(rèn)為,帕金森病(特別是散發(fā)性)的發(fā)病機(jī)制是由于線粒體復(fù)合體Ⅰ活性降低所致[4-5]。這種在散發(fā)性帕金森病患者中普遍存在的復(fù)合體Ⅰ活性降低顯然不全是由于復(fù)合體Ⅰ亞基編碼基因的某個突變所致[6]。所以相應(yīng)的治療策略應(yīng)該是功能上彌補(bǔ)整個復(fù)合體Ⅰ的缺陷。

酵母的線粒體復(fù)合體Ⅰ是內(nèi)NADH脫氫酶(internal NADH dehydrogenase,NDI1)基因表達(dá)的NDI1蛋白,雖然由單亞基構(gòu)成,但有可能同源替代哺乳動物細(xì)胞中由45個亞基構(gòu)成的復(fù)合體Ⅰ[7-8]。

本研究采用酵母NDI1的重組腺相關(guān)病毒(recombinant adeno-associated virus with NDI1, rAAV-NDI1),以魚藤酮誘導(dǎo)經(jīng)分化的人神經(jīng)細(xì)胞系SH-SY5Y建立帕金森病細(xì)胞模型,研究酵母NDI1蛋白對人線粒體復(fù)合體Ⅰ功能缺陷和細(xì)胞病理特征的改善作用。本研究可以為散發(fā)型帕金森病的酵母NDI1基因治療提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞:人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SH-SY5Y(美國菌種保藏中心)。

1.1.2 試劑(盒):5型重組腺相關(guān)病毒rAAV5-NDI1(委托武漢樞密腦科學(xué)技術(shù)有限公司包裝);抗人α-突觸核蛋白(α-synuclein)抗體(BD公司);抗人pS129 α-突觸核蛋白抗體(Abcam公司);抗LC3B抗體、抗HA抗體(CST公司);熒光素/熒光素酶化學(xué)發(fā)光ATP測定試劑盒、MitoSOXTMRed(Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分組及處理:分為3組,DMSO+空載組(正常對照組)、魚藤酮+空載組(誘導(dǎo)模型組)、魚藤酮+NDI1組(誘導(dǎo)模型的治療組)。2×105個SH-SY5Y細(xì)胞鋪于6孔板中,待貼壁后,換為含10 μmol/L全反式維甲酸(all-trans retinoic acid, ATRA)的細(xì)胞分化培養(yǎng)液(第0天)。于第2天,將rAAV5-NDI1,以感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)為4×104,加入含ATRA的培養(yǎng)液中,進(jìn)行感染。于第4天,去病毒,換含ATRA的培養(yǎng)液,此后于第6天、第8天各換1次含ATRA的培養(yǎng)液。于第8天在含ATRA的培養(yǎng)液中加入1 μmol/L魚藤酮處理24 h。于第9天,收獲細(xì)胞用于后續(xù)的檢測。

1.2.2 Western blot檢測標(biāo)簽蛋白HA(NDI1)、α-突觸核蛋白和pS129 α-突觸核蛋白水平:收集細(xì)胞,裂解,離心取上清。測定蛋白濃度后,SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜。封閉后,加一抗(1∶1 000的抗HA抗體或α-突觸核蛋白(α-synuclein)抗體或pS129 α-突觸核蛋白抗體)于4 ℃孵育過夜。然后二抗孵育。最后顯影、曝光。

1.2.3 免疫熒光法檢測HA(NDI1)、MitoTracker、LC3B的定位及水平:細(xì)胞爬片上的細(xì)胞,加100 nmol/L的MitoTrackerTMRed于37℃避光孵育30 min。經(jīng)固定、通透、封閉后加一抗(1∶100的抗人LC3B抗體或HA抗體)于4 ℃ 避光孵育過夜。加Alexa fluo 647標(biāo)記的二抗室溫避光孵育1 h后加DAPI染色。激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.4 復(fù)合體依賴性氧耗的檢測:于Oxygraph-2K細(xì)胞呼吸儀的倉內(nèi)加入2×106個細(xì)胞/2 mL檢測液。加2% 洋地黃皂苷通透細(xì)胞膜后,先加入復(fù)合體Ⅰ的底物混合物記錄復(fù)合體Ⅰ依賴性的氧耗,再加入100 μmol/L的哺乳動物(不包括酵母的)復(fù)合體Ⅰ抑制劑魚藤酮,記錄抑制內(nèi)源性復(fù)合體Ⅰ后的氧耗,再加入0.225 mol/L的通用性(包括酵母的)復(fù)合體Ⅰ抑制劑黃酮,記錄抑制外源性酵母復(fù)合體Ⅰ后的氧耗,然后加入復(fù)合體Ⅱ和Ⅲ的底物混合物,記錄復(fù)合體Ⅱ和Ⅲ依賴性的氧耗。用DatLab 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.5 ATP合成的檢測:收集的細(xì)胞(約1×106個)在100 μL ATP提取液中100 ℃加熱90 s。10 μL上清液樣品或ATP標(biāo)準(zhǔn)品與100 μL ATP檢測液混合,用多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的ATP水平。除測定未經(jīng)處理細(xì)胞的基礎(chǔ)ATP合成外,另外將細(xì)胞與15 mg/L的寡霉素在37 ℃下孵育1 h后,測定抑制ATP合酶后的ATP合成。

1.2.6 線粒體內(nèi)ROS的測定:收集的細(xì)胞(約1×106個),加入5 μmol/L的MitoSOXTMRed于37 ℃避光孵育25 min。洗滌、重懸細(xì)胞,流式細(xì)胞儀采集5 000個細(xì)胞分析每個樣本的中位數(shù)熒光強(qiáng)度(median fluorescence intensity, MFI)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 分化后SH-SY5Y細(xì)胞的增殖狀態(tài)、轉(zhuǎn)導(dǎo)后NDI1的表達(dá)及亞細(xì)胞定位

SH-SY5Y細(xì)胞ATRA處理2 d后增殖變慢,在處理4 d后增殖基本停止(圖1B)。

A.scheme for all-trans retinoic aicd (ATRA) differentiation, rotenone treatment and rAAV5-NDI1 transduction of SH-SY5Y cells; B.proliferation status of ATRA treated SH-SY5Y cells; C.expression of HA (NDI1) on day 6 and 7 after transduction(day 8 and 9); D.subcellular co-localization of MitoTracker and HA (NDI1) on day 6 after introduced, MitoTracker(red), mitochondria;HA(green), HA (NDI1) protein; DAPI(blue), nucleus(scale bar:25 μm).圖1 分化后SH-SY5Y細(xì)胞的增殖狀態(tài)、感染后NDI1的表達(dá)及亞細(xì)胞定位Fig 1 Proliferation status of SH-SY5Y cells after differentiation, and the expression and subcellular localization of

在感染后第6、7天,感染NDI1組的HA(NDI1)的表達(dá)水平均較高(圖1C)。

HA(NDI1)與MitoTracker亞細(xì)胞共定位,顯示 NDI1蛋白定位于線粒體(圖1D)。

2.2 NDI1導(dǎo)入魚藤酮誘導(dǎo)的分化型帕金森病細(xì)胞模型后改善細(xì)胞病理學(xué)特征

魚藤酮+空載組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生異常改變,胞體變圓并聚集在一起,軸突縮短,細(xì)胞間連接變少;魚藤酮+NDI1組形態(tài)明顯改善,胞體皺縮現(xiàn)象改善,數(shù)量增多,細(xì)胞伸展,突起變長(圖2A)。

A.cell morphology (scale bar: 100 μm); B.cell viability; C.the α-synuclein (α-syn) and pS129 α-synuclein (pS129 α-syn) levels; D.quantitation of α-synuclein and pS129 α-synuclein levels; *P<0.01, **P<0.001 compared with DMSO+vector; #P<0.05, ##P<0.01 compared with rotenone+vector.圖2 NDI1導(dǎo)入魚藤酮誘導(dǎo)的分化型帕金森病細(xì)胞模型后能改善細(xì)胞病理學(xué)特征Fig 2 NDI1 improved the cytopathological characteristics after introduced into rotenone-induced differentiated Parkinson’s disease cell n=3)

魚藤酮+空載組與DMSO+空載組相比,細(xì)胞存活率顯著下降(P<0.01),魚藤酮+NDI1組較魚藤酮+空載組顯著回升(P<0.05)(圖2B)。

魚藤酮+空載組較DMSO+空載組α-突觸核蛋白和pS129 α-突觸核蛋白水平顯著增加(P<0.001,P<0.01),魚藤酮+NDI1組較魚藤酮+空載組顯著回落(P<0.01,P<0.05)(圖2D)。

2.3 NDI1導(dǎo)入魚藤酮誘導(dǎo)的分化型帕金森病細(xì)胞模型后恢復(fù)線粒體復(fù)合體Ⅰ依賴性的氧耗水平

魚藤酮+空載組較DMSO+空載組復(fù)合體Ⅰ依賴性氧耗顯著降低(P<0.001),魚藤酮+NDI1組較魚藤酮+空載組顯著回升(P<0.01)(圖3A)。

A:CI-dependent and CⅡ+CⅢ-dependent oxygen consumption levels, CI.complex Ⅰ, CⅡ.complex Ⅱ, CⅢ.complex Ⅲ; B:proportion of flavone or rotenone sensitive in complex Ⅰ-dependent oxygen consumption; *P<0.001 compared with DMSO+vector; #P<0.01, ##P<0.001 compared with rotenone+vector.圖3 NDI1導(dǎo)入魚藤酮誘導(dǎo)的分化型帕金森病細(xì)胞模型后能恢復(fù)線粒體復(fù)合體Ⅰ依賴性的氧耗水平Fig 3 NDI1 restored mitochondrial complex Ⅰ-dependent oxygen consumption level after transduction into rotenone-induced differentiated Parkinson’s disease cell n=3)

魚藤酮+NDI1組較魚藤酮+空載組,復(fù)合體Ⅰ依賴性氧耗中對黃酮敏感的比例顯著升高(P<0.001),占復(fù)合體Ⅰ依賴性氧耗的大部分(圖3B)。

2.4 NDI1導(dǎo)入魚藤酮誘導(dǎo)的分化型帕金森病細(xì)胞模型后能恢復(fù)ATP水平

魚藤酮+空載組較DMSO+空載組細(xì)胞整體ATP合成量(即base)顯著降低(P<0.001),魚藤酮+NDI1組較魚藤酮+空載組顯著回升(P<0.01)(圖4A)。

A.total cellular ATP content (base), oligomycin-sensitive ATP content (oligo-sensitive); B.proportion of oligomycin-sensitive ATP content; *P<0.001 compared with DMSO+vector; #P<0.01 compared with rotenone+vector.圖4 NDI1導(dǎo)入魚藤酮誘導(dǎo)的分化型帕金森病細(xì)胞模型后能恢復(fù)ATP水平Fig 4 NDI1 restored ATP level after transduction into the rotenone-induced differentiated Parkinson’s disease

魚藤酮+空載組較DMSO+空載組對寡霉素敏感的ATP合成量(即oligo-sensitive)及其比例顯著降低(P<0.001),魚藤酮+NDI1組較魚藤酮+空載組顯著回升(P<0.01)(圖4A,B)。

2.5 NDI1導(dǎo)入魚藤酮誘導(dǎo)的分化型帕金森病細(xì)胞模型后能降低ROS水平

魚藤酮+空載組較DMSO+空載組線粒體內(nèi)ROS水平顯著升高(P<0.001),魚藤酮+NDI1組較魚藤酮+空載組顯著回落(P<0.01)(圖5)。

MFI.median fluorescence intensity; *P<0.001 compared with DMSO+vector; #P<0.01 compared with rotenone+vector.圖5 NDI1導(dǎo)入魚藤酮誘導(dǎo)的分化型帕金森病細(xì)胞模型后能降低ROS水平Fig 5 NDI1 reduced the level of ROS after transduction into the rotenone-induced differentiated Parkinson’s

2.6 NDI1導(dǎo)入魚藤酮誘導(dǎo)的分化型帕金森病細(xì)胞模型后能降低細(xì)胞自噬和線粒體自噬水平

魚藤酮+空載組較DMSO+空載組自噬標(biāo)志物L(fēng)C3B免疫熒光強(qiáng)度顯著提高(P<0.001),魚藤酮+NDI1組較魚藤酮+空載組顯著回落(P<0.001)(圖6B)。

魚藤酮+空載組較DMSO+空載組LC3B與Mito-Tracker共定位的Pearson相關(guān)系數(shù)顯著提高(P<0.001),魚藤酮+NDI1組較魚藤酮+空載組顯著回落(P<0.001)(圖6C)。

3 討論

魚藤酮是常用的構(gòu)建帕金森病細(xì)胞、動物模型的神經(jīng)毒素,其主要機(jī)制是抑制線粒體復(fù)合體Ⅰ[9]。本研究采用魚藤酮來構(gòu)建帕金森病細(xì)胞模型,研究結(jié)果顯示復(fù)合體Ⅰ相關(guān)的線粒體功能低下并出現(xiàn)了帕金森病的細(xì)胞病理學(xué)特征(圖2～6),表明構(gòu)建成功。

目前針對線粒體復(fù)合體Ⅰ缺陷的基因治療,如 Leber氏視神經(jīng)病的ND4基因治療已完成臨床前研究并進(jìn)入臨床試驗(yàn)[10],還有對Ndufs4全身性敲除的Leigh綜合征模型小鼠采用AAV-Ndufs4進(jìn)行基因治療[11],但已報道基因治療策略只針對人復(fù)合體Ⅰ某一個亞基功能缺陷。本研究的基因治療策略能夠在功能上彌補(bǔ)整個復(fù)合體Ⅰ的缺陷,有望應(yīng)用于所有線粒體復(fù)合體Ⅰ缺陷的疾病。

已有一些研究證實(shí)了酵母NDI1或其蛋白產(chǎn)物用于復(fù)合體Ⅰ缺陷相關(guān)疾病治療的有效性。采用體外制備的細(xì)胞通透性TAT-NDI1蛋白,能夠使心肌缺血損傷模型大鼠的心肌復(fù)合體Ⅰ功能恢復(fù),心梗減小[7]。在多發(fā)性硬化模型小鼠中采用NDI1靶向功能缺陷的復(fù)合體Ⅰ,能夠緩解軸突受損和神經(jīng)元缺失問題,從而改善視覺功能[8]。本研究結(jié)果表明, 細(xì)胞水平的NDI1治療可以抵抗魚藤酮誘導(dǎo)的細(xì)胞形態(tài)改變和存活率下降,使復(fù)合體Ⅰ(主要是外源性的)依賴性氧耗、線粒體有關(guān)的ATP顯著回升,使線粒體ROS顯著下降并抵抗線粒體自噬(圖2～6),具有與上述文獻(xiàn)報道類似的改善效果。

本研究采用帶有線粒體導(dǎo)肽序列的酵母NDI1,先進(jìn)入細(xì)胞核中,在細(xì)胞質(zhì)中翻譯后轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體中。已有研究表明,酵母NDI1在大鼠中沒有引起免疫反應(yīng),這可能因?yàn)橥鈦淼鞍孜挥诰€粒體中,可以躲避免疫監(jiān)測之故[12]。

臨床試驗(yàn)已證明腺相關(guān)病毒AAV在帕金森病等神經(jīng)組織基因治療中具有令人鼓舞的安全性、有效性以及表達(dá)的持久性[13-14],故本研究采用AAV作為基因治療表達(dá)載體。本研究先采用全反式維甲酸分化SH-SY5Y細(xì)胞,停止細(xì)胞分裂,然后采用rAAV-NDI1感染分化型帕金森病細(xì)胞模型。因?yàn)橹亟M腺相關(guān)病毒在被感染的細(xì)胞中主要是以非整合的形式存在,細(xì)胞分裂后的子代細(xì)胞中重組基因含量將被稀釋掉[15]。