韓 振,宋衛(wèi)東,梁宇平,張 濤,盧昕媛,萬 健

(上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院 急診與重癥醫(yī)學(xué)科,上海 201299)

膿毒癥是一種由感染引起的全身炎癥綜合征,其中急性肺損傷(acute lung injury, ALI)是膿毒癥最常見和最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一,死亡率居高不下［1-2]。革蘭氏陰性菌的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是ALI的重要誘導(dǎo)因素,可激活磷脂酰肌醇三羥基激酶/蛋白激B/核因子-κB(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B/nuclear factorκ-B,PI3K/Akt/NF-κB)信號通路,促進多種炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生［3]。

羥基積雪草酸(madecassic acid,MA)分子式為C30H48O6,分子量為504.71,是一種在積雪草植物中發(fā)現(xiàn)的三萜類化合物,具有抗炎等多種藥理特性［4-5]。最近的研究顯示,積雪草提取物通過抑制LPS誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的產(chǎn)生,其作用可能是通過抑制Akt介導(dǎo)的NF-κB信號通路來實現(xiàn)［6]。MA在ALI中的作用機制尚未見研究報道。因此我們研究了MA對LPS誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠發(fā)生ALI的保護作用,并探索其對Akt/NF-κB信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗小鼠購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司[實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(滬)2013-0016],均為SPF級健康雄性C57BL/6小鼠,共35只,其中5只用于原代細(xì)胞制備,30只用于動物實驗,均為8～12周齡,體重20～25 g。本研究的動物實驗符合動物倫理學(xué)的相關(guān)要求,動物倫理批準(zhǔn)編號為2022-D-62。

1.2 實驗試劑 羥基積雪草酸(CAS號: 18449-41-7,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);LPS(L4391,Sigma-Aldrich,美國);噻唑藍(lán)(thiazolyl blue tetrazolium bromide,MTT,CT-MTT-1,上海炎熙生物科技有限公司);p-AKT抗體(ab38449,稀釋倍數(shù)1∶1 000,英國Abcam公司);AKT抗體(ab179463,稀釋倍數(shù)1∶1 000,英國Abcam公司);核因子κB的抑制蛋白(inhibitor of NF-κB,稀釋倍數(shù)1∶1 000,IκB)抗體(#4814,稀釋倍數(shù)1∶1 000,美國Cell Signaling Technology公司);p65抗體(#8242,稀釋倍數(shù)1∶1 000,美國Cell Signaling Technology公司);GAPDH抗體(#5174,稀釋倍數(shù)1∶1 000,美國Cell Signaling Technology公司);TNF-α的 ELISA試劑盒(PT512,上海碧云天生物技術(shù)有限公司);IL-6的ELISA試劑盒(PI326,上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.3 實驗儀器 多功能酶標(biāo)儀(multiskan FC,美國Thermo Fisher公司);倒置相差顯微鏡(ECLIPSE TS2,日本尼康公司);Western blot印跡成像分析儀[iBright CL 750,阿拉斯加科技(北京)有限公司];超純水系統(tǒng)(Dura pro 12,上海和泰儀器有限公司);超凈工作臺(AirGuard 1000,上海滬凈醫(yī)療器械有限公司)。

1.4 原代細(xì)胞制備 根據(jù)文獻(xiàn)報道的方法,用C57BL/6小鼠制備原代腹腔巨噬細(xì)胞(mouse primary macrophages,MPM)并進行體外培養(yǎng)［7]。在37 ℃和5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中,MPM細(xì)胞在含有10%FBS、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在給予MA預(yù)處理時,將MA預(yù)先溶解在DMSO溶液中,添加到細(xì)胞中以稀釋到不同濃度。

1.5 LPS誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠模型 C57BL/6小鼠培養(yǎng)在相對恒定的室溫(25 ℃)和濕度(60%～80%)下,將動物置于12 h的明暗循環(huán)中,并給予標(biāo)準(zhǔn)食物和充足的水。雄性C57BL/6小鼠被隨機分為3組,即對照組(n=10)、LPS組(n=10)和LPS+MA組(n=10)。將MA溶解于聚乙二醇15-羥基硬脂酸酯(注射用非離子增溶劑),終濃度為2 mg/mL,雄性C57BL/6小鼠在尾靜脈注射LPS(20 mg/kg)前15 min腹腔注射MA溶液(1 mL,100 mg/kg)溶液［8]。對照組和LPS組給予相同體積的溶劑,記錄之后7 d小鼠的生存和死亡情況,采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線,進行生存分析。實驗結(jié)束后處死小鼠分離血清,收集肺組織標(biāo)本用于后續(xù)檢測。

1.6 MTT法測定細(xì)胞活力 將MPM細(xì)胞(1×105細(xì)胞/mL)接種96孔板中并過夜培養(yǎng),加入用0～200 μmol/L不同濃度MA預(yù)處理細(xì)胞1 h,MTT法用于測定細(xì)胞活力,將MTT溶液加入活細(xì)胞中,并在CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h,測量490 nm處的吸光度以確定細(xì)胞存活率。

1.7 TNF-α和IL-6的測定 根據(jù)試劑生產(chǎn)商的說明書［9],使用LPS(10 ng/mL)刺激MPM細(xì)胞6 h后收集細(xì)胞上清液,使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)試劑盒測定血清或者細(xì)胞上清液中TNF-α和IL-6濃度。

1.8 Western blot檢測蛋白表達(dá) 肺組織勻漿后使用RIPA裂解液進行裂解,然后使用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,并電轉(zhuǎn)移至硝化纖維素膜。室溫下在pH 7.6的Tris緩沖鹽水中預(yù)培養(yǎng)1 h,加入抗Akt、p65、IκB和三磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase,GAPDH)的特異性抗體孵育,4 ℃孵育過夜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二級抗體孵育,并使用增強化學(xué)發(fā)光試劑顯色、拍攝和定量分析,以p-Akt與Akt的比值計算Akt激活情況。

1.9 組織病理學(xué) 右肺上葉用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,然后切成5 μmol/L切片。使用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)用于染色光學(xué)顯微鏡觀察的切片。

2 結(jié)果

2.1 MA抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠原代巨噬細(xì)胞促炎因子的分泌 MTT檢測表明,0～200 μmol/L的MA預(yù)處理MPM細(xì)胞時,細(xì)胞存活率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,圖1A)。ELISA檢測結(jié)果表明,與Ctrl組相比,LPS刺激后巨噬細(xì)胞分泌的TNF-α(P=0.000 4)和IL-6(P=0.000 7)顯著增加;而與LPS組相比,MA(10 μmol/L)預(yù)處理顯著抑制了LPS刺激的TNF-α(P=0.006)和IL-6(P=0.008)分泌(圖1B、C)。

A:MTT法測定MPM細(xì)胞活力;B、C:ELISA檢測MPM細(xì)胞上清液TNF-α和IL-6;***:與 Ctrl組相比,P<0.001;##:與 LPS組比較,P<0.01。圖1 MA抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠原代巨噬細(xì)胞TNF-α和IL-6分泌

2.2 MA對LPS誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠的保護作用 LPS刺激小鼠4 h后,小鼠血清中IL-6和TNF-α迅速增加(P=0.000 2、P=0.000 3);而與LPS組相比,MA的預(yù)處理有效抑制了血清中IL-6和TNF-α的產(chǎn)生(P=0.000 4、P=0.000 9,圖2A、B)。此外,與LPS組相比,MA還顯著提高了LPS刺激后小鼠的7 d存活率(P=0.008,圖2C)。

A、B:ELISA法測定血清IL-6和TNF-α濃度;C:各組小鼠7 d的存活率;***:與 Ctrl組比較,P<0.001;##:與 LPS組比較,P<0.01;n=10。圖2 各處理組小鼠的存活率、血清中IL-6和TNF-α的表達(dá)情況

2.3 MA對LPS誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠肺損傷具有保護作用 HE結(jié)果顯示,與Ctrl組相比,LPS刺激組小鼠的肺肺泡壁厚度增加,肺泡數(shù)量減少,肺損傷評分顯著升高(P=0.000 6)。與LPS組相比,MA的預(yù)處理抑制了LPS激發(fā)小鼠肺泡壁的腫脹,并減輕了肺泡數(shù)量的下降和肺損傷評分的升高(P=0.008,圖3)。

A:各組小鼠肺組織切片HE染色,放大倍數(shù)為100倍;B:各組小鼠的肺損傷分?jǐn)?shù);***:與Ctrl組比較,P<0.001 ;##:與LPS組比較,P<0.01;n=10。圖3 MA在LPS刺激小鼠中顯示了對肺損傷的保護作用

2.4 MA抑制LPS誘導(dǎo)的Akt/NF-κB信號通路 Western blot檢測結(jié)果顯示,LPS刺激后顯著誘導(dǎo)膿毒癥小鼠肺組織中Akt的磷酸化、IκB的降解和p65表達(dá)增加(P=0.005、P=0.014、P=0.012);而與LPS組相比,MA預(yù)處理顯著抑制了Akt的磷酸化和IκB的降解,并減少了p65的表達(dá)(P=0.023、P=0.019、P=0.011,圖4)。

A:代表性蛋白條帶;B:蛋白條帶統(tǒng)計結(jié)果;**:與 Ctrl組比較,P<0.01;#:與LPS組比較,P<0.05。圖4 各實驗組P-Akt、P65、IκB蛋白的表達(dá)情況

3 討論

急性炎癥性疾病是全世界重癥監(jiān)護室病人死亡的主要原因,在臨床治療中仍然缺乏有效的治療方法。已發(fā)現(xiàn)甾體和非甾體抗炎藥在治療膿毒癥和ALI方面的治療局限［10]。由于膿毒癥的復(fù)雜性,臨床應(yīng)用的大多數(shù)治療方法不理想［11]。因此,迫切需要找到新的、有效的膿毒癥治療方法。

治療和預(yù)防膿毒性休克及其相關(guān)疾病的一種治療策略是及時干預(yù)NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)［12]。LPS通過結(jié)合蛋白和CD14呈遞給TLR4/MD2復(fù)合物,激活下游的NF-κB,然而TLR4特異性抑制劑TAK-242的臨床試驗未能治療患者的嚴(yán)重膿毒癥和相關(guān)呼吸系統(tǒng)疾?。?3]。此外,阻斷TLR可能導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用,如過敏性Th2反應(yīng)或免疫耐受［14]。另一方面,許多化合物以多種方式抑制NF-κB,顯示出對肺部炎癥的治療或緩解作用。其中一些天然活性化合物如槲皮素、蘆丁以及MA等,能抑制促炎信號和預(yù)防感染性休克［6,15-16]。積雪草具有良好的生物安全性,在基礎(chǔ)研究中未發(fā)現(xiàn)存在明顯的毒性作用［5,16],這為我們探索用于膿毒癥的抗炎候選藥物提供了新的思路。

促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的過度表達(dá)是急性炎癥疾病初期的指標(biāo)特征［17],它們能迅速啟動全身炎癥反應(yīng),從而刺激適應(yīng)性免疫反應(yīng)和細(xì)胞因子風(fēng)暴［18-19]。本研究發(fā)現(xiàn),使用非細(xì)胞毒性劑量的MA預(yù)處理巨噬細(xì)胞后,有效降低了LPS刺激的MPM中TNF-α和IL-6的生成,同樣在小鼠膿毒癥模型中也觀察到類似結(jié)果。因此,本研究提示MA通過減少促炎細(xì)胞因子的表達(dá)來抑制LPS誘導(dǎo)的MPM和動物模型中的炎癥過程。此外,本研究發(fā)現(xiàn)MA治療顯著增加了LPS攻擊小鼠的存活率。由于LPS誘導(dǎo)的嚴(yán)重炎癥反應(yīng)會損傷肺組織,本研究也證實了MA(100 mg/kg腹腔注射)減少了肺泡壁腫脹,抑制了肺組織中肺泡數(shù)量的下降,展現(xiàn)了對急性肺損傷的保護作用。

AKT可以調(diào)控NF-κB的激活,被證明是LPS促炎信號通路中的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。已有研究表明,PI3K/AKT通路的抑制在ALI小鼠模型中發(fā)揮保護作用［20],并且PI3K/AKT通路會進一步抑制NF-κB活性,從而抑制炎癥反應(yīng)［21]。在我們的研究中,LPS刺激后Akt的磷酸化、IκB的降解和NF-κB的表達(dá)顯著增加,但MA顯著抑制了LPS的這一促炎效應(yīng)。本研究結(jié)果表明MA發(fā)揮抗炎保護作用的潛在機制可能與Akt/NF-κB信號通路的抑制有關(guān)。

綜上所述,MA對LPS誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠急性肺損傷具有顯著的保護作用,可能與Akt/NF-κB信號通路激活有關(guān),提示MA具有作為治療急性炎癥性疾病的潛在價值。